A hnRNS-kötő fehérjék hnRNP L és PTB szükségesek a Cat-1 arginin/lizin transzporter mRNS hatékony transzlációjához aminosav éhezés során

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: [email protected]

Cikk ábrák és adatok

Ábrák

(A) A Cat-1 mRNS 5'-UTR-jéhez kötődő fehérjék azonosítása. A táplált (F) és a 9 órával éheztett (S) C6 sejtek citoplazmatikus kivonatait a jelzett RNS-kel bevont streptavidin gyöngyökkel inkubáltuk, és a megkötött fehérjéket eluáltuk, SDS-PAGE-val feloldottuk és Coomassie ragyogó kékkel festettük az ismertetett módon anyagokban és módszerekben. A megjelölt zárójelben és a csillagban lévő éhezett sejtek sávjait tömegspektrometriás elemzésnek vetettük alá. (B) A C6 sejteket táplált (F) körülmények között tenyésztettük, vagy 1–9 órán át éheztettük aminosavakat (S1 – S9). Citoplazmatikus és magkivonatokat készítettünk és Western-blot-analízissel analizáltunk. A tubulint és a PCNA-t citoplazmatikus és nukleáris markerként vettük fel.

A rekombináns hnRNP L és a PTB kötődik a Cat-1 IRES-hez. (A) Az RNS-ek vázlata a Cat-1 5 'UTR szekvenciáival. (B) UV-keresztkötési kísérleteket végeztek rekombináns PTB-vel vagy hnRNP L-vel és a 32 P-vel jelölt RNS-ekkel. A keresztkötés után a mintákat RNáz A-val kezeltük és SDS-PAGE-val elemeztük. Kontrollként a pSP72 RNS-t (a Bluescript RNS 72 nukleotidja) használtuk. (C) PTB vagy hnRNP L és 32 P jelzett Cat-1 (-192) mRNS-t tartalmazó térhálósító kísérleti keverékekhez jelöletlen versenytárs RNS-eket adtunk a Cat-1 5 'UTR jelzett szekvenciáival. (D és E) EMSA-k 32 P-jelölt Cat-1 (-192) RNS-sel, rekombináns PTB-vel és hnRNP L-vel, valamint a jelzett antitestek.

A PTB CU-ban gazdag elemen keresztül kapcsolódik a Cat-1 mRNS-vezetőhöz. (A) A Cat-1 mRNS-vezető (70) szerkezete, amely bemutatja a PTB kötőhelyét és a PTB-vel kölcsönhatásban lévő hnRNP L. fehérjét. (B) Cat-1 (−192) vagy Cat-1 (−270) RNS-eket, amelyek vad típusú szekvenciát vagy a CU-ban gazdag elem mutációját inkubáltuk táplált vagy aminosavval éhezett sejtek citoplazmatikus kivonataival. A komplexeket sztreptavidin gyöngyökön gyűjtöttük össze, majd SDS-PAGE-val és Western-blot-analízissel elemeztük az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint.

(A) A C6 sejtek siRNS-sel történő kezelése a PTB ellen csökkenti a Cat-1 IRES-hez való kötődést. A C6 sejteket siRNS-sel transzfektáltuk PTB-be 2 napig, majd aminosavval táplált vagy éhezett körülmények között inkubáltuk. A citoplazmatikus kivonatokat Cat-1 (-192) RNS-sel inkubáltuk, és a komplexeket sztreptavidin gyöngyökön gyűjtöttük össze. A kötött fehérjéket SDS-PAGE-val és Western-blot-analízissel elemeztük az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. (B) Az A panelben használt citoplazmatikus kivonatokat immunprecipitáljuk anti-hnRNP L antitesttel vagy kontroll IgG-vel. Az immunprecipitátumokban található Cat-1 és GAPDH mRNS-eket RT-PCR-rel elemeztük.

A Cat-1 mRNS előnyösen asszociálódik a hnRNP L-vel és a PTB-vel aminosav-éhezés során. Táplált vagy aminosav-éhezett körülmények között tenyésztett C6 sejtek a megadott időtartamig. Nukleáris és citoplazmatikus kivonatokat készítettünk és immunprecipitáltuk a hnRNP L és a PTB számára. (A) Cat-1 és GAPDH mRNS szintek a bemeneti és az immunprecipitált mintákban, RT-PCR-rel elemezve. (B) RT-PCR termékek relatív szintje az A panelen és hasonló kísérletek citoplazmatikus kivonatokkal, szkennelt gélekből számítva.

A Cat-1 mRNS és a PTB előnyös társulása riboszomális frakciókban aminosav-éhezés során. A C6 sejteket táplált vagy aminosav-éhezett körülmények között inkubáltuk 6 vagy 9 órán át, és riboszomális frakciókat készítettünk. (A) A PTB-t és az rpS5 riboszomális fehérjét Western-blottolással elemeztük. (B és C) A mintákat immunprecipitáltuk anti-PTB antitesttel vagy kontroll IgG-vel. Az immunprecipitátumokban lévő Cat-1 és GAPDH mRNS-eket RT-PCR (B) vagy kvantitatív valós idejű PCR (C) alkalmazással figyeltük meg.

A CU-ban gazdag elem a Cat-1 mRNS vezetőben szükséges az IRES funkcióhoz. A C6 sejteket átmenetileg transzfektáltuk a sematikus ábrán bemutatott vad típusú vagy CU-mutáns Cat-1 5 'UTR-eket tartalmazó bicistronic expressziós vektorokkal. 36 óra elteltével a sejteket 9 órán át tenyésztettük aminosavval táplált vagy éheztetett körülmények között. A sejtlizátumokat LUC és CAT aktivitásra vizsgáltuk. A grafikon három egymástól független kísérlet átlagának átlagértékét mutatja. SV40, majomvírus 40.

A bicistronic Cat-1 (-270) vektorral stabilan transzfektált C6 sejtvonalat átmenetileg transzfektáltuk a jelzett siRNS-ekkel. 48 óra elteltével a sejteket 6 vagy 9 órán át tenyésztettük aminosavval táplált vagy éheztetett körülmények között. (A és B) A sejtkivonatokat Western-blot-analízissel (A), valamint LUC- és CAT-aktivitásokra (B) elemeztük. (C) A bicistronic expressziós vektorral stabilan transzfektált C6 sejtvonalat a jelzett siRNS-ekkel transzfektáltuk. 48 óra elteltével a [35S] Met beépülését az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint mértük. A háromszoros meghatározások átlagainak ± standard hibáit mutatjuk be.

A Cat-1 IRES aktivitás hnRNP L indukciója az eIF2α foszforilációjától függ. (A) A MEF-eket (vad típusú [S/S] és S51A mutánsok [A/A]) egy bicistronic Cat-1 (-270) vektorral és egy hnRNP L-GFP fúziós fehérjét expresszáló vektorral transzfektáltuk. A sejtkivonatokat elemeztük táplált és éheztetett sejtek LUC és CAT aktivitására az indikáció szerint. (B) Az A/A MEF-eket együtt transzfektáltuk a hnRNP L-GFP fúziós fehérjét vagy önmagában a GFP-t expresszáló vektorral és a jelzett eIF2a fehérjéket expresszáló vektorokkal. Az elemzést az A. panelre leírtak szerint hajtottuk végre. (C) A transzfektált és a kontroll sejteket immunblotoltuk a hnRNP L-re, hogy bemutassuk a transzfektált hnRNP L-GFP expressziós szintjét. A tubulin töltésszabályozásként szerepel. (D) A kontroll C6 sejteket és a stabilan transzfektált konstrukcióból (pCDNA3-hnRNP L) expresszáló hnRNP L-t expresszáló sejteket és a Cat-1 expressziót Western blot (bal oldali) és l -arginin transzport segítségével elemeztük az Anyagok és módszerek szerint. A három párhuzamos meghatározás átlagának ± standard hibáit mutatjuk be (*, P

A PTB (A) vagy a hnRNP L (B) kimerülése csökkenti a Cat-1 fehérje felhalmozódását az aminosavval éhezett sejtekben. A C6 sejteket a jelzett siRNS-ekkel transzfektáltuk. 48 óra elteltével a sejteket a megadott időn át (órákig) tenyésztettük aminosavval táplált vagy éheztetett körülmények között, és a jelzett fehérjéket Western-blottolással elemeztük. A y-Actint használtuk terhelés kontrollként.