A központi leptin hevesen megfordítja az étrend okozta máj inzulinrezisztenciát

Absztrakt

Az önkéntes túltáplálás gyorsan rezisztenciát vált ki a szisztémás inzulin és a leptin máj glükóz-anyagcserére gyakorolt hatásaival szemben. Annak megvizsgálására, hogy a rekombináns leptin központi adagolása helyreállíthatja-e a leptin és az inzulin hatását a máj glükóz fluxusain, a hasnyálmirigy-inzulin clamp vizsgálatok során a tudatos túltáplált patkányok harmadik agykamrájába infundáltuk a leptint. A leptin hatása a jelátalakító és a transzkripció-3 aktivátorának foszforilációjára a hipotalamusz íves magjaiban hasonló volt azoknál az állatoknál, akiket rendszeres táplálékkal vagy magas zsírtartalmú étrenddel tápláltak 3 napig. A leptin infúziója a harmadik agykamrában jelentősen gátolta a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányok glükóztermelését, elsősorban a glikogenolízis csökkentésével. A glikogenolízis gátlása elegendő volt a glükóztermelés normalizálásához, és leptin által kiváltott csökkenéssel járt a glükóz-6-foszfatáz és a foszfoenol-piruvát-karboxi-kináz máj expressziójában. Így a leptin központi adagolása megmenti a rövid távú hiperfágia által kiváltott máj inzulinrezisztenciát.

A leptin egy adipocita eredetű hormon, amely képes módosítani az ételbevitelt és a máj inzulinhatását (1–4). A keringő leptint telített transzportrendszeren keresztül szállítják az agyba, mind az endotheliumnál, mind a choroid plexusnál (5,6). A vér-agy gáton (BBB) való áthaladás után a leptin hatásait elsősorban a leptin receptor hosszú formája (OB-Rb) közvetíti, amely az egyetlen izoform, amely képes aktiválni a JAK-jelátalakítót és a transzkripció aktivátorát (STAT) ) útvonal (7–9). A leptin genetikai hiánya (ob/ob egerek), valamint a leptin receptor mutációi (db/db egerek, Zucker zsíros [fa/fa] patkányok) elhízáshoz és cukorbetegséghez vezetnek (10). Emberekben ritkán monogén elhízási szindrómákat is leírtak korábban (11).

Az elhízott egyének súlyos inzulinrezisztenciával rendelkeznek, magas az inzulin és a leptin keringési szintje (12,13). Ebben a tekintetben a megnövekedett leptinszint nem képes helyreállítani a normális energiát és a metabolikus homeosztázist általában a leptinrezisztencia bizonyítékaként tekintik. A rágcsálókon végzett több jelentés rávilágított a leptin anorektikus hatásának súlyos károsodására magas zsírtartalmú táplálékkal ellátott modellekben (14–17). A leptinrezisztencia ezen megszerzett formáját a központi idegrendszerbe (CNS) történő leptintranszport és/vagy a központi idegrendszeren belüli leptinszignálási szint hibáinak tulajdonítják. Ebben a tekintetben Van Heek et al. (16) arról számoltak be, hogy a diéta okozta elhízott egerek perifériás, de nem központi ellenállást fejtenek ki a leptinnel szemben, míg El Haschimi és mtsai. (14) és Munzberg és mtsai. (15) megfigyelte, hogy két hiba hozzájárul a leptinrezisztenciájukhoz, az agyban a leptin transzport zavara és a leptin csökkent képessége a STAT3 aktiválására a hipotalamusz íves magjában.

Fontos, hogy egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arról, hogy a leptin is fontos szerepet játszik a metabolikus fluxusok és az inzulinhatás modulálásában (18). Például, hogy a leptin megfordítja az inzulinrezisztenciát és a cukorbetegséget a veleszületett lipodystrophiában szenvedő egerekben, függetlenül a táplálékfelvételre gyakorolt hatásától, már korábban bemutatták (4,18–20). Karcsú patkányokban a leptin szisztémás vagy központi infúziója a máj glükózfluxusainak gyors újraelosztásához vezet a glükoneogenezis robusztus stimulálásával, amely a glikogenolízis hasonló gátlásával párosul (4,19). Fontos, hogy a leptin hatása a glükoneogenezisre, de a glikogenolízisre nem, a melanokortin receptorok központi aktivációjától függ (4).

Az inzulin- és leptinrezisztencia az önkéntes túltáplálástól számított 3 napon belül alakult ki egy rágcsáló törzsben (Sprague-Dawley patkányok), amelyek fogékonyak az életkor és az étrend függő súlygyarapodásra (21). Különösen a rövid távú túltáplálás súlyos hibát okozott abban, hogy a leptin (50 μg) szisztémás infúziója képes a máj glükóz fluxusainak modulálására (21). Mivel bebizonyítottuk, hogy 1,5 μg leptin i.c.v. teljesen reprodukálta a szisztémásan beadott 50 μg leptin hatását a máj glükózfluxusaira standard étrendű patkányokban (19), célunk annak tisztázása, hogy a leptin központi adagolása megmenti-e az inzulin máj szénhidrát-anyagcserére gyakorolt hatását.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Felnőtt hím Sprague-Dawley patkányokat (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) vizsgáltunk. A patkányokat egyedi ketrecekben helyezték el és szokásos világos-sötét ciklusnak vetették alá (a fények 0600-kor világítanak). Tizennégy nappal az in vivo vizsgálat előtt a patkányokat belső katéterekkel látták el, amelyeket sztereotaxiás műtéttel helyeztek el a harmadik agykamrában (19, 22). A teljes helyreállítás (~ 10 nap) után a katétereket a jobb belső jugularis vénába és a bal carotis artériába helyeztük (19, 22). A patkányokat ezután véletlenszerűen két csoportra osztották, és 3 napig standard táplálékkal vagy nagyon ízletes, magas zsírtartalmú étrendgel etették őket. A szokásos chow (katalógusszám: 5001; Purina Mills) 59% kalóriát adott szénhidrátból, 20% fehérjét és 21% zsírt. A magas zsírtartalmú diétás chow (katalógusszám: 9398; Purina Mills) 45% kalóriát tartalmazott szénhidrátokból, 22% fehérjét és 33% zsírot.

Intracerebroventrikuláris vizsgálatok.

Az itt leírt kísérleti protokollt arra terveztük, hogy megvizsgálja, hogy a leptin-rendszer központi stimulálása helyreállítja-e a normál inzulinérzékenységet a túltáplált állatokban. A patkányokat két kísérleti csoportra osztottuk, miután a műtétekből teljesen felépült, és a szokásos étrendet vagy a magas zsírtartalmú étrendet 3 napig kiosztották a fentiek szerint. A patkányok intracerebroventrikuláris infúzióban részesültek bármelyik vivőanyagból (mesterséges cerebrospinalis folyadék; Harvard Apparatus) 6 órán át, vagy rekombináns egér leptinből (1,5 μg/6 óra) (SDS-PAGE-nál> 95% -os tisztaságban; Dr. M. McCaleb, Amgen, Thousand ajándéka. Oaks, Kalifornia). Összességében négy kezelési csoportot vizsgáltak: 1) standard étrend – hordozó; 2) szokásos étrend - leptin; 3) magas zsírtartalmú étrend - hordozó; és 4) magas zsírtartalmú étrend – leptin. Valamennyi patkány megkapta az alábbiakban leírt euglikémiás/hiperinsulinémiás szorítóprotokollt a leptin utolsó 2 órája alatt. Az in vivo vizsgálatok végén a patkányokat altattuk (pentobarbitált 55 mg/testtömeg-kg, iv.), És a szövetmintákat in situ fagyasztva rögzítettük folyékony nitrogénben előhűtött alumínium fogókkal és -80 ° C-on tároltuk a későbbiekben. elemzés.

Euglikémiás/hiperinsulinémiás clamp vizsgálatok.

A hasnyálmirigy-inzulin clamp vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végezzük, hogy fiziológiás hiperinsulinémiát kapjunk (4,19,23).

Mediobasal hypothalamus

Western blot elemzések.

Gén expresszió.

Fagyasztással kapcsolt májat olyan állatoktól nyertünk, amelyek euglikémiás/hiperinsulinémiás bilincset kaptak. A PEPCK és a glükóz-6-foszfatáz (G6Pase) gén expresszióját kvantitatív PCR-rel elemeztük (4).

Analitikai eljárások.

A plazma glükózszintet glükóz-oxidáz módszerrel (Glucose Analyzer II; Beckman Instruments, Palo Alto, CA) mértük. A plazma inzulin és leptin koncentrációkat radioimmun vizsgálattal mértük. A szabad zsírsavak plazmakoncentrációját enzimatikus módszerrel, automata készlettel határoztuk meg a gyártó specifikációinak megfelelően (Waco Pure Chemical Industries, Osaka, Japán). A plazma [3H] glükóz radioaktivitást duplikátumokban mértük a plazmaminták BA (OH) 2 és ZnSO4 csapadékának felülúszójában (somogyi eljárás), miután szárazra pároltuk a tríciumos víz eltávolítása érdekében. A glükózfelvétel és az endogén glükóztermelés mértékét a korábban leírtak szerint számoltuk (19).

Máj glükóz fluxusok.

Az uridin-difoszfoglükóz (UDP-glükóz) és a foszfoenol-piruvát (PEP) koncentrációit és specifikus aktivitását a májban két egymást követő kromatográfiás elválasztással kaptuk, amint arról korábban beszámoltunk (20). A máj [14C] PEP, [3H] uridin-difoszfoglükóz (UDP-glükóz) és [14C] UDP-glükóz specifikus aktivitását nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával mértük, és kiszámoltuk a PEP-glükoneogenezis sebességét. A máj glükóz-6-foszfátkészletének százalékát, amely közvetlenül a plazma glükózból származik, a máj [3H] UDP-glükóz és a plazma [3H-3] glükózspecifikus aktivitások (közvetlen út) arányaként számítottuk ki. A glükoneogenezist (közvetett útvonalat) a máj 14 C-val jelölt UDP-glükóz (feltételezhetően a máj glükóz-6-foszfát specifikus aktivitását tükröző) és a máj PEP specifikus aktivitásai alapján becsülték meg az [U-14 C] laktát és [3H-3] glükóz (19).

Statisztika.

Valamennyi értéket átlag ± SE-ként adunk meg. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük a P –1 · min –1) clamp eljárásnál, amelynek célja a plazma inzulin koncentrációjának fiziológiai (kb. Háromszoros; 1. táblázat) növekedésének generálása (1B. Ábra).

A központi leptin beadása helyreállítja az inzulinérzékenységet a túltáplált patkányokban. A hím Sprague-Dawley patkányoknak intracerebroventrikuláris kanülöket implantáltak a 0. napon (3 héttel az in vivo vizsgálat előtt), valamint vénás és artériás katétereket a 14. napon. 3 nap. A: Clamp eljárást a 21. napon hajtottak végre. B: Hasnyálmirigy-inzulin clamp eljárás. A patkányok az in vivo kísérletek előtt és alatt intracerebroventrikuláris infúzióban kaptak leptint vagy vivőanyagot (aCSF, mesterséges cerebrospinalis folyadék). 120 perc múlva [3H] glükóz infúziót indítottak. A befogási eljárás 240 percnél kezdődött. Ez magában foglalta a szomatosztatin (3 μg · kg –1 · min –1), az inzulin (3 mU · kg –1 · min –1) és a glükóz (szükség esetén a hipoglikémia megelőzéséhez) infúzióját. C: Az intracerebroventrikuláris leptin (▪, 1,5 μg teljes dózis) megemelte a glükóz infúzió sebességét a túlteljesített patkányokban (OF) a standard chow-val etetett patkányokban (SC) megfigyelt szintekre. D: A leptin (▪) vagy a vivőanyag (□) infúzió nem változtatta meg a glükózfelvételt a standard étrendű és a túltáplált állatoknál. E és F: Az intracerebroventrikuláris leptin markánsan gátolta a glükóztermelést a szorítás során túletetett, de normál étrendű patkányokban. * P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A kísérleti csoportok általános jellemzői

A hasnyálmirigy-inzulin clamp vizsgálatok során a plazma glükóz és inzulin koncentrációja minden csoportban hasonló volt (1. táblázat). A szokásos étrendű patkányokban a leptin nem befolyásolta a glükóz infúzió sebességét (~ 15 mg · kg -1 -1 perc –1), amely szükséges a plazma glükózszintjének változásainak megakadályozásához (1C. Ábra). A várakozásoknak megfelelően a túltáplált patkányokban inzulinrezisztencia alakult ki, így jelentősen kevesebb glükóz (9,5 ± 1,3 mg · kg –1 · min –1; P –1 · min –1) (1C ábra).

A központi leptin beadása normalizálja a máj inzulinhatását a túltáplált patkányokban.

Az intracerebroventrikuláris leptin hatása a glükoneogenezisre, a glikogenolízisre és a máj PEPCK mRNS-re túltáplált patkányokban. A központi leptin beadása jelentősen csökkentette a glikogenolízist (A) mind a standard-chow (SC), mind a túltáplált (OF) patkányokban. Ezzel szemben a központi leptin stimulálta a glükoneogenezist (B) a szokásos étrendben, de a túl táplált patkányokban nem. C: Ezenkívül az intracerebroventrikuláris leptin jelentősen megnövelte a PEPCK máj expresszióját standard étrendű patkányokban. A rövid távú hyperphagia (OF) önmagában növelte a PEPCK (C) máj expresszióját, de a leptin központi adagolása jelentősen gátolta a PEPCK mRNS-t (C). * P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A közvetlen és közvetett út hozzájárulása a máj UDP-glükózkészletéhez

Ezután a PEPCK mRNS májbőségét vizsgáltuk a vivőanyag vagy a leptin központi infúziója után. Normál étrendű patkányokban a centrális leptin növelte a PEPCK expressziót (4) (3C. Ábra). Ezzel szemben a központi leptin-kezelés a PEPCK-expresszió markáns szuppresszióját eredményezte (3C. Ábra) a túltáplált patkányokban. Így a túlzottan táplált patkányokban a centrális leptin elsősorban a glikogenolízis gátlásával, valamint a PEPCK és a G6Páz csökkent expressziójával és a glükoneogenezis stimulációjának hiányával csökkentette a glükóztermelést.

Az intracerebroventrikuláris leptin normálisan aktiválja a hipotalamusz STAT3-at túltáplált patkányokban.

Mivel a leptin szignál transzdukciójának korai lépése foszforilezést és a STAT3 aktiválását foglalja magában, megvizsgáltuk az intracerebroventrikuláris leptin hatását a hipotalamusz STAT3 foszforilációjára standard étrendű és túltáplált állatokban (4. ábra). Harminc perccel a leptin (2,5 μg) vagy vivőanyag intracerebroventrikuláris injekciója után a patkányokat leöltük, és a hipotalamusz mediobasalis ékeit boncoltuk fel és elemeztük Western blot segítségével. Az összes STAT3 fehérje és β-aktin (nem látható) szint hasonló volt az összes csoportban. Az intracerebroventrikuláris leptin a 705-ös helyzetben (Tyr705) (25) a STAT3 tirozin-foszforiláció markáns növekedését indukálta, hasonló mértékben a standard étrendű és túltáplált patkányokban. A Stat3-705 kiindulási szintje nem volt magas a túletetett patkányokban. Ezenkívül a Stat3 transzkripciós aktivitását tovább fokozhatja a 727-es pozícióban lévő leptin-független szerin-foszforilezés. Érdekes módon a Stat3 (Ser727) szerin-foszforilációját sem a leptin, sem a rövid távú túltáplálás nem befolyásolta ezen a helyen.

Leptin-függő Stat3 aktiváció standard étrendben és túltáplált patkányokban. Mediobasalis hypothalami immunblotjai, amelyeket standard táplálékkal és túlzottan táplált patkányokkal nyertek, injektálva leptinnel (2,5 μg iv.) Vagy aCSF-vel (mesterséges cerebrospinalis folyadék), és Stat3-705-gyel (tirozin-foszforiláció) és Stat3-727 (szerin-foszforiláció) szondázva. Az intracerebroventrikuláris leptin hozzávetőlegesen háromszoros Stat3-705-foszforiláció-indukcióhoz vezetett a standard étrendű és a túltáplált állatokban, míg a Stat3-727-et sem a kezelés, sem az étrend nem befolyásolta.

VITA

Emberi és állatkísérletek arra utalnak, hogy a leptin károsodott transzportja a BBB-n keresztül hozzájárul a leptin rezisztenciához elhízott állapotban. Az elhízás genetikai modelljeiből (26,34), az étrend által kiváltott elhízással küzdő egerekből (15,16) több jelentés, de humán vizsgálatokból (35) is beszámoltak a leptin központi idegrendszerbe történő transzportjának hibájáról, amely részben a csökkenésük oka lehet leptin iránti érzékenység. A BBB-n keresztüli hibás leptin transzport mellett a leptin receptor expressziójában és a sejtszignalizációban bekövetkezett változásokat is megfigyeltek (14,15) a hipotalamuszon belül és különösen az ív alakú magban. A Leptin számos központi tevékenységét az energia homeosztázisban hajtja végre a melanokortin útvonal bekapcsolásával (22, 36). Ebben a tekintetben Clegg és munkatársai (36,37) nemrégiben kimutatták, hogy a magas zsírtartalmú étrend fogyasztása csökkenti a melanokortin út szintetikus agonista általi aktiválódását. Tehát a leptin energia metabolizmusra gyakorolt hatását tekintve a magas zsírtartalmú étrend hosszú távú (> 2 hét) expozíciója úgy tűnik, hogy több hibát okoz a BBB transzport, a receptor expresszió, a STAT3 aktiváció és a downstream effektor útvonalak szintjén mint például a melanocortin út.

A leptin glükóz homeosztázisra gyakorolt akut hatása meglehetősen összetett. Mivel a máj glükózfluxusainak gyors szabályozásáról van szó, a közelmúltban azonosítottuk a szisztémás vagy a központi leptin melanokortin- és melanokortin-független hatásait (4). A leptin melanokortin-független mechanizmus révén robusztusan gátolja a tudatban lévő patkányok májglikogenolízisét. A központi melanokortin útvonal leptinnel történő aktiválása azonban a glükoneogenezis, valamint a PEPCK és a G6Páz máj expressziójának stimulálásához is vezet. Érdekesség, hogy a leptin markánsan elnyomta a glükóztermelést sovány patkányokban, amikor a központi melanokortin út aktiválódását szelektíven blokkolták (4).

Összegzésképpen azt javasoljuk, hogy a leptin metabolikus hatásainak két különféle változása gyorsan indukálódjon a túltáplálás révén Sprague-Dawley patkányokban. Az első a keringő leptin átjutásának hibája a hipotalamuszban lévő cselekvési helyeire, a második pedig a központi leptin szelektív károsodása, amely valószínűleg a melanokortin útvonalon keresztül jelzi a máj glükoneogenezisét (5. ábra). Talán a legfontosabb, hogy a központi leptin jelátvitel szelektív változásai, amelyeket ebben a modellben a túltáplálás indukál, a központi leptin hatását a máj glükóztermelésében hatékonynak tűnik. Ez utóbbi hatás elegendő a magas zsírtartalmú táplálkozás által kiváltott súlyos máj inzulinrezisztencia teljes visszafordításához. Ezek az eredmények együttvéve azt az elképzelést mozdítják elő, hogy a leptin központi hozzáférhetőségének növelése új stratégia lehet az étrend okozta máj inzulinrezisztencia kezelésében.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az AECOM Cukorbetegség Kutató és Képző Központ támogatása kapta, DK-20541. L.R. megkapta az Országos Egészségügyi Intézmények DK-48321, DK-45024 és AG21654. ÍGY. az Amerikai Diabétesz Szövetség Junior Kar díját kapja. A.P. az Amerikai Diabétesz Szövetség posztdoktori ösztöndíját kapja.

Köszönjük Bing Liu, Clive Baveghems és Stanislaw Gaweda szakértői technikai segítségét.