A lipotoxikus sérülés differenciálisan szabályozza az agy mikrovaszkuláris gén expresszióját hím egerekben

A gippek expressziója qRT-PCR-rel a hippocampus mikrovérekben mikroarray elemzéssel azonosított génekről. Tizenegy gént (Npy, Taf1d, Trp53rka, Egln1, Arrb1, Aph1a, Fabp5, Slc17a5, Rap1b, Clca4a, MAPK8) teszteltünk qRT-PCR-rel vad típusú (WT) és LDL-R -/- egerekből izolált hippocampalis mikrovérekben kontroll étrenddel (CD) és nyugati étrenddel (WD) táplálva, és a génexpresszióban ugyanolyan tendenciát mutattak, mint a mikrorayával. Az expressziós szinteket log2-szeres változásként fejeztük ki (* p ≤ 0,05 WT-WD, LDL-R -/- CD és LDL-R -/- WD esetén, összehasonlítva a WT-CD-vel).

Génhálózat A differenciálisan expresszált fehérjét kódoló gének elemzése hippocampalis mikrovérekben. Szövegbányászati algoritmust (Metacore) alkalmaztunk a génhálózat-elemzések elvégzésére és a differenciálisan expresszált fehérjét kódoló gének funkcionális csoportjainak azonosítására a nyugati diétával (WD) táplált C57BL/6J (WT) egerek hippocampus mikrovérében, összehasonlítva a kontrollal diétás (CD) táplált WT egerek, CD-vel táplált LDL-R -/- egerek összehasonlítva a CD-vel táplált WT egerekkel, és WD-vel táplált LDL-R -/- egerek összehasonlítva a CD-vel táplált WT egerekkel. Ezek a kördiagramon ábrázolt génhálózatok részt vettek a sejtadhézióban (narancssárga), a citoszkeletonban (sárga), a proliferációban (barna), a proteolízisben (szürke), a transzkripcióban (sötétzöld), a fejlődésben (világoskék) és a jelátvitelben (sötétkék). ).

A differenciálisan expresszált fehérjét kódoló gének útvonalainak elemzése a hipokampusz mikrovérekben. A differenciálisan expresszált fehérjét kódoló gének jelentős sejtszintjének hisztogramja a hippocampus mikrovérekben. A differenciálisan expresszált gének sejt útjai a nyugati diéta (WD) táplált C57BL/6J (WT) egerekből származó hippocampus mikrovérekben összehasonlítva a kontroll étrenddel (CD) táplált WT egerek, a CD-vel táplált LDL-R -/- egerek a CD- táplált WT egereket és a WD-vel táplált LDL-R -/- egereket a CD-vel táplált WT egerekhez képest KEGG és MetaCore segítségével azonosítottuk.

Az étrend és a genotípus által érintett top 30 transzkripciós faktor Venn-diagramja a hippocampalis mikrovaszkuláris endotheliumban. A lipidkárosodás által potenciálisan modulált transzkripciós faktorokat MetaCore transzkripciós szabályozó algoritmus segítségével azonosítottuk. A Venn-diagram 17 transzkripciós faktort (TF) mutat közösen a nyugati étrenddel (WD) táplált C57BL/6J (WT) egerek, a kontroll étrend (CD) táplált LDL-R -/- egerek és a WD-vel táplált LDL-R egerek között. -/- egerek, összehasonlítva a CD-vel táplált WT egerekkel.

A lipidkárosodás hatása a mikroRNS-re a differenciálisan expresszált génpályák expressziójára a hippocampus mikrovérekben. A differenciálisan expresszált génpályák és miRNS-célgén-utak hőtérképe. A differenciálisan expresszált gének és a miRNS-célgének útvonalainak összehasonlítása útvonalcsoportot azonosított, mint például a kemokin jelátviteli út, a fokális adhézió, a rés junction, az inzulin jelátvitel, az Nf-kB jelzés vagy a Gap csomópontok, valamint az endothel sejtek interakcióját szabályozó útvonalakat és átjárhatóság közös. Részletesen bemutatjuk a differenciálisan expresszált gének és a differenciálisan expresszált miRNS-ek célgénjeinek reprezentatív integrált elemzését a fokális adhéziós jelátviteli úton. Kék = differenciálisan expresszált gének; sárga = differenciálisan expresszált miRNS-ek célgénjei; színátmenet kéktől sárgáig = azonosított gének, amelyek mind differenciálisan expresszálódnak, mind pedig a differenciálisan expresszált miRNS-ek célpontjai.

Transzkripciós faktorokkal és miRNS szabályozással dúsított fehérje – fehérje hálózat. A fehérje – fehérje kölcsönhatásokat a STRING adatbázis segítségével azonosítottuk, differenciálisan expresszált génekből. A fehérje – fehérje hálózat, a differenciálisan expresszált miRNS-ek (Mir 1192) és a potenciális transzkripciós faktorok (Stat1, c-Myc, Creb1) közötti kölcsönhatásokat az OmicsNet online eszköz segítségével állítottuk össze. A célgének a következők: Pax6, Arrb1, Irf9, Il12rb1, Irf8, Epas1, Tlr9, Tbx21, Dag1, Atxn3, Med1, Etv6, Olig1, Ube2n, Pard3, Nphp4, Ubc, Ctcf, Msx1, Dxdbd58, Sp1, Tcf3, Boon1, Pml, Zfp292, Dvl3, Ndn, Foxo1, Zfpm1, Rbbp4, Cul4a, Ywhaz, Arhoef7, Actef, Set, Pou5f1, Hist1hb4, Cbx2, Rxrb, Ywhae, Wnt7a, Afp, Kat2b.

A differenciálisan expresszált gének, a miRNS célgének és az lncRNS célpontok útvonal-elemzésének hőtérképe. A KEGG adatbázis segítségével azonosított útvonalak hőtérképe differenciálisan expresszált gének, differenciálisan expresszált miRNS célgének és lncRNS célpontok felhasználásával. A színintenzitás arányos az útban lévő gének számával.

Az aktin citoszkeleton útjának szabályozása differenciálisan expresszált génekkel, miRNS-sel és lncRNS-sel. (A) Integrációanalízis, amely differenciálisan expresszált géneket (kék négyzeteket), differenciálisan expresszált miRNS-eket (barna négyzetek) és célpontjaikat (barna törött nyilak), valamint differenciálisan expresszált lncRNS-eket (zöld négyzetek) és célpontjaikat (zöld törött nyilak) mutatja. A gének, a miRNS és az lncRNS közötti lehetséges kölcsönhatásokat is bemutatjuk. (B) A differenciálisan expresszált gének (kék színnel kiemelve), a miRNS-ek és célpontjaik, valamint az lncRNS-ek és célpontjaik amplifikálása, szabályozva az aktin citoszkeleton útját.

Absztrakt

1. Bemutatkozás

2. Módszerek

2.1. Kísérleti állatok

2.2. Vér metabolikus és hormonvizsgálatok

2.3. A rágcsáló agy Hippocampus izolálása és kriozekciója

2.4. A Hippocampal mikrorészecskék lézeres befogási mikrodisszekciója (LCM)

2.5. RNS-kivonás lézerrel befogott agyi mikrovezetőkből

2.6. Microarray hibridizáció és transzkriptóm elemzés

28 000 kódoló átirat és

7000 nem kódoló átirat, Affymetrix, Santa Clara, Kalifornia, USA). RNS-t (125 pg) használtunk a cRNS és az sscDNS előállítására Affymetrix GeneChip ® WT Pico Kit segítségével. Az SscDNS-t (5,5 ug) uracil-DNS-glikozilázzal (UDG) és apurinic/apyrimidinic endonukleázzal 1 (APE 1) fragmentáltuk, és terminális dezoxinukleotidil-transzferázzal (TdT) jelöltük, biotinhoz kovalensen kapcsolt DNS-jelző reagens alkalmazásával. A töredezett és címkézett ssCDNA mintákat három példányban elküldtük az UC Davis Genome Center megosztott erőforrásnak hibridizáció, festés és szkennelés céljából az Affymetrix WT tömb hibridizációs protokoll segítségével, a gyártó protokolljának megfelelően. A töredezett és jelölt ssCDNA minták hibridizálását a GeneChip ™ Hybridization Oven 645 alkalmazásával végeztük, majd a mintákat a GeneChip ™ Fluidics Station 450 alkalmazásával mostuk és festettük. A tömböket egy GeneChip ™ Scanner 3000 7G (Thermo Fisher Scientific, Santa Clara, Kalifornia) segítségével szkenneltük. (USA). A mikrosávok minőség-ellenőrzését az Affymetrix Expression Console 1.4.1 verziójával, az adatelemzést pedig az Affymetrix Transcriptome Analysis Console 3.1.0.5 verziójával hajtottuk végre.