Az allograft gyulladásos faktor 1 közvetíti az inzulinjelzés makrofágok által kiváltott károsodását az adipocitákban

Az Oktatási Minisztérium Qinghai-Tibeti-fennsík állatgenetikai erőforrásokkal történő fenntartásának és hasznosításának legfontosabb laboratóriuma,

Élettudományi és Technológiai Főiskola, Délnyugati Nemzetiségi Egyetem,

16. sz., 4. déli szakasz, Első körút, Csengdu, 610041, (PR Kína);

Tel. + 86-28-85522310, e-mail [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízás az egyik legfontosabb kockázati tényező az inzulinrezisztencia kialakulásában, valamint a cukorbetegség, a szív- és érrendszeri betegségek és más társbetegségek előrehaladásában [1]. Krónikus alacsony fokú szisztémás gyulladás állapotának tekintik az aktivált makrofágok beszivárgása miatt a zsírszövetben [2, 3]. Számos tanulmány hangsúlyozta, hogy a krónikus gyulladás összeköti a zsírfelesleget az anyagcserezavarokkal [3, 4]. A zsírszöveti makrofágok számos gyulladásgátló citokint termelnek, amelyek jelentősen megváltoztatják az adipocita működését, lipid felhalmozódást [5], gyulladásos reakciókat [6] indukálva és csökkentve az inzulinérzékenységet [7]. Az adipocita káros hatásait közvetítő főbb tényezők azonosítása potenciális terápiás célpontokat kínálhat.

Az allograft gyulladásos faktor-1 (AIF-1) egy kalcium-kötő, gyulladással kapcsolatos állványfehérje, amelyet főleg immunsejtek termelnek [8]. Először krónikus kilökődéssel rendelkező patkány szív-allograftok aktivált makrofágjaiban azonosították (GenBank U17919 belépési szám) [9]. Számos más molekula, például a daintain [10], az ionizált Ca 2+ -kötő adapter (Iba1) [11] és az 1-es mikroglia válaszfaktor (MRF-1) [12] az AIF-1 homológjai. Az AIF-1-et elismerték, hogy a makrofágok túlélése és gyulladáscsökkentő aktivitása szempontjából döntő molekula [13, 14]. Így részt vesz vasculopathiával [15], autoimmun betegségekkel [16] és központi idegrendszeri (CNS) sérüléssel járó gyulladásban és immunválaszokban [17] et al.

Nemrégiben számos jelentés jelezte, hogy az AIF-1 részt vesz az elhízásban. Először is, az AIF-1 génterület egyetlen nukleotid polimorfizmusa kapcsolódott a testtömeghez [18]. Másodszor, az AIF-1 -/- egereket megvédték az étrend okozta elhízástól [19]. Harmadszor: az AIF-1-et új adipokinnak javasolták, amelyet elsősorban az emberi fehér zsírszövet makrofágjai állítottak elő. Kifejezése nőtt elhízott alanyokban, és pozitív korrelációban állt az inzulinrezisztenciával [20]. Ezen eredmények alapján az AIF-1 szerepét az adipociták makrofágok által kiváltott szignál érzékenységében egér RAW264.7 makrofágok és 3T3L1 adipociták alkalmazásával vizsgáltuk jelen tanulmányban.

Anyagok és metódusok

Vektor konstrukció és transzfekció

Olajvörös O assay

Az egér 3T3L1 előadipocitáit szintén az ATCC-től nyertük, és DMEM-ben tenyésztettük 10% FBS-sel és 1% penicillin/sztreptomicinnel 37 ° C-on, 5% CO2 nedvesített atmoszférában. Az elő-adipocitákat differenciáltuk adipocitákká, ahogy azt korábban leírtuk [21]. Röviden, 2 nappal az összefolyás után (0. nap) a sejteket differenciálódásra indukáltuk 10% FBS-sel, 0,5 mmol/l 3-izobutil-1-metil-xantinnal, 0,25 µmol/l dexametazonnal és 10 ug/ml inzulinnal kiegészített DMEM-mel ( MDI, Sigma, St. Louis, MO, USA) további 2 napig. A 4. napon a sejteket makrofág-kondicionált táptalajba és 10 ug/ml inzulinba vittük át még két napig. A 3T3L1 adipociták intracelluláris lipidfelhalmozódását a zsírcseppek vizuális megjelenésével és az olajvörös O festéssel figyeltük meg. A lipidcseppek integrált optikai sűrűségét (IOD) alkalmaztuk a lipid felhalmozódás számszerűsítésére [22].

A reaktív oxigénfajták és az adipokin felszabadulás mérése

Az egér 3T3L1 előadipocitáit standard protokoll alkalmazásával teljesen differenciálták adipocitákká [21]. Pontosabban 2 nappal azután, hogy a sejtek összefolytak, 2 napig inkubáltuk őket a differenciáló táptalajban (10% FBS-sel és adipogén koktél MDI-vel kiegészített DMEM). Ezután a sejteket további 2 napig 10% FBS-t és 10 ug/ml inzulint tartalmazó DMEM-ben tartottuk, és 10% FBS-t tartalmazó DMEM-mel töltöttük fel, amíg az adipocitákba teljes mértékben differenciálódott. Ezt követően a táptalajt 2 napig makrofág-kondicionált tápközeggel vagy 0, 0,1, 1, 10 nmol/L AIF-1 [16] DMEM-ben pótoltuk 10% FBS-sel kiegészítve. A sejteket 500 g-vel 5 percig végzett centrifugálással gyűjtöttük össze és lizáltuk. A 3T3L1 adipocitákban a reaktív oxigénfajták termelését sejtes reaktív oxigénfajok detektálási készlettel (Sigma, St. Louis, MO, USA) mértük, és áramlási citométerrel (Beckman Coulter FC500, Brea, CA) elemeztük. Az alfa tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α), az interleukin 6 (IL6), az rezin és az adiponektin szekréciós koncentrációját, valamint a makrofág-kondicionált táptalajban a TNFα, IL6 alapszintjét a megfelelő ELISA-készletek (R&D Systems, Abingdon, Egyesült Királyság).

Glükózfogyasztás

A glükózfogyasztást a korábban leírtak szerint vizsgáltuk [23]. A differenciált 3T3L1 adipocitákat 18 órán át 10% FBS-t és 5 mmol/l vagy 25 mmol/l glükózt tartalmazó DMEM-nek tettük ki, 0,6 nmol/l inzulinnal vagy anélkül, az indikációnak megfelelően. Ezután a sejteket makrofág-kondicionált táptalajban vagy 0, 0,1, 1, 10 nmol/L AIF-1 DMEM-ben 10% FBS-sel inkubáltuk 48 órán át. A vizsgálat előtt a sejteket 100 nmol/l inzulinnal stimuláltuk 30 percig, és a táptalaj glükóz koncentrációját glükóz-oxidáz módszerrel elemeztük.

Western blot

Statisztikai analízis

Az adatokat átlagként ± az átlag standard hibájaként (SEM) fejeztük ki. Az adatokat statisztikailag elemeztük az SPSS Statistics V17.0 szoftver segítségével, és a megfelelő csoportok közötti különbségek szignifikanciáját ANOVA-val határoztuk meg, amelyet egy farkas többszörös t-teszt követett. Értéke P