Az all-trans retinsav csökkenti a szérum retinol-kötő fehérje 4 koncentrációját és növeli az inzulin érzékenységet a diabéteszes egerekben

A szerző közzététele: P. V. Bhat, D. Manolescu és A. Sima, nincsenek összeférhetetlenségek.

Daniel-Constantin Manolescu, Aurelia Sima, Pangala V. Bhat, az All-trans retinsav csökkenti a szérum retinol-kötő fehérje 4 koncentrációját és növeli az inzulinérzékenységet a diabéteszes egerekben, The Journal of Nutrition, 140. évfolyam, 2. szám, 2010. február, 311. oldal –316, https://doi.org/10.3945/jn.109.115147

Absztrakt

A legújabb kutatások kimutatták, hogy a zsírszövetből kiválasztott emelkedett szérum retinol-kötő fehérje 4 (RBP4) szerepet játszik a szisztémás inzulinrezisztencia kialakulásában, és az RBP4 csökkentése javítja az inzulinérzékenységet. Ezek a megfigyelések indokolják az új antidiabetikus szerek kifejlesztését, amelyek célja a szérum RBP4 koncentrációjának csökkentése. Ebben a tanulmányban arra kerestük a választ, hogy a retinsav (RA) beadása csökkenti-e a szérum RBP4-et és elnyomja-e az inzulinrezisztenciát diabéteszes ob/ob egerekben. All-trans RA-t [100 μg/(egérd) kukoricaolajban] gyomor intubációval adtunk ob/ob egerek egy csoportjának, a kontroll csoport 16 napig kapta a vivőanyagot. A testtömeget és az ételbevitelt nyomon követtük. Glükóz és inzulin tolerancia teszteket végeztek. A szérum RBP4-et és a retinolt kvantifikáltuk Western-blottolással, illetve HPLC-vel. RA kezelés csökkentette a testtömeget (P

Bevezetés

Az all-transz retinsav (RA), 4 az A-vitamin aktív metabolitja, elengedhetetlen az embriogenezishez és az epitheliális szerkezet megfelelő fenntartásához (1, 2). Az RA számos biológiai funkcióját az RA receptorok közvetítik (RAR és RXR) (3). Az RA szintén hatékony kemopreventív szer (4). Klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy teljes remissziót vált ki akut promyelocytás leukémiában szenvedő betegeknél (4, 5). Az RA-t jelenleg prosztatarák vagy neuroblasztóma kezelésére is alkalmazzák, és számos más RA-forma (retinoid) kemopreventív megközelítést képvisel olyan premalignus elváltozásokban szenvedő betegeknél, mint pl. Aktinikus keratinosis, leukoplakia és nyaki dysplasia, vagy az elsődleges bőr terápiája, orális, tüdő- és emlődaganatok (6, 7). Bár az RA ígéretes rákellenes gyógyszer, hatásosságát más betegségek, például a cukorbetegség ellen nem vizsgálták.

Mi és mások megmutattuk, hogy az étrendi RA drámai módon elnyomja a keringő retinol szintet a rágcsálókban (29–31). Bár ezekben a vizsgálatokban nem mértük az RBP4-et, annak szintje csökkenhetett, mivel a retinol az RBP4-hez kötődött a szérumban. Mivel az RA-nek retinol-RBP4-csökkentő hatása van, feltételeztük, hogy a diabéteszes egerek RA-val történő kezelése az inzulinrezisztencia elnyomását eredményezheti.

Anyagok és metódusok

A vizsgálati protokollt a Montreali Egyetem Kutatóközpontjának intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá. Tizenhat nőstény 9 hetes B6.V-Lep/J ob/ob egeret kaptunk a Jackson Laboratóriumtól. 2 csoportba osztották őket, egyenként 8 egérből: 1 kontroll (RA -) és 1 RA-kiegészített (RA +). Az egereket (ketrecenként 4-en) környezettel ellenőrzött körülmények között, 12 órás fény/sötét ciklusban helyeztük el, amelyhez szabad hozzáférés volt a vízhez és a szokásos rágcsáló-pellet-étrendhez (2018. sz., 18% fehérje rágcsálóknak, Harlan Teklad). Az étrend összetétele (g/kg): nyersfehérje, 188; nyersolaj 60 (összes telített, 9,6; összes egyszeresen telítetlen, 12,8; és összes többszörösen telítetlen, 34,1), nyers rost, 38; 500 szénhidrát (keményítő, 450; és cukor, 50), ásványi keverék, 32,05; vitaminkeverék, 2,9; és energia 13,7 kJ/g. A kísérlet megkezdése előtt 1 hétig akklimatizálódtak új környezetükbe. A testtömeget és a táplálékfelvételt naponta mértük.

Tíz hetes sovány egereket (C57BL/6 törzs), amelyeket a Charles River Labs-tól szereztünk be, és standard rágcsáló-pellet-táplálékkal etettek, megvizsgáltuk az RBP4, a retinol és azok arányának normális szintjének meghatározására.

RA előkészítése és beadása.

Az all-trans RA-t (Sigma-Aldrich) feloldottuk kukoricaolajban, és 100 μg dózisban 100 μl-ben adagoltuk az egereknek gyomor intubációjával, reggelente. RA - az egerek csak a hordozót, kukoricaolajat kapták. Az RA kiegészítése 16 napig folytatódott. Mivel az RA viszonylag instabil vegyület, az oldatot naponta készítettük, és a stabilitást HPLC-vel igazoltuk. Annak elkerülése érdekében, hogy a fény expozíciója ne okozzon RA-t, az összes RA-vel végzett műveletet gyenge fényben hajtották végre.

Vércukor, intraperitoneális glükóz és inzulin tolerancia tesztek mérése.

Az egerektől 4 órán át nem kaptak élelmet, és a vércukor-koncentrációt a farok vérmintáiban mértük d 9-n (a kezelés alatt) és d 16-on (a kezelés utolsó napján), amikor intraperitoneális glükóz- és inzulin-tolerancia teszteket (IPGTT és IPITT) végeztek. Az IPGTT és az IPITT esetében az egerek glükóz (1 g/testtömeg-kg) és emberi szokásos inzulin (1 NE/testtömeg-kg) injekciókat kaptak. A vércukor-koncentrációt AccuCheck glükométerrel (Roche) határoztuk meg farok vérmintákból 0, 20, 40, 60, 90 és 120 perccel a glükóz és az inzulin beadása után.

Szérumminták gyűjtése és tárolása.

Miután az egereket egyik napról a másikra elvonták a takarmánytól, a vért vakuainer csövekbe vették, amelyek szilikagél alapú alvadási aktivátort tartalmaztak, és előzőleg alumíniumfóliával tekerték be, hogy minimalizálják a fényt. A mintákat azonnal sötét helyiségben dolgoztuk fel, és a szérumot 8165 × g-vel 4 ° C-on végzett centrifugálással nyertük (Eppendorf Centrifuga, 5415C modell), majd 1,5 ml-es barna Eppendorf-kriotubusokban -80 ° C-on tároltuk az elemzésig. Egyszer megolvasztották őket, és egyidejűleg megvizsgálták retinolt és RBP4-et.

Retinol extrahálása szérummintákból HPLC-hez.

A szérummintákból származó retinolt butanol/acetonitrillel (azonos térfogatú) extraháltuk, lényegében McClean és mtsai. (32), kivéve, hogy a módszert kisebb mintatérfogatokra alkalmazták. A –80 ° C-on tárolt mintákat jégen leolvasztottuk és 10 percig 4 ° C-on 735xg-vel centrifugáltuk (Eppendorf Centrifuga, 5415C modell), hogy tiszta felülúszókat kapjunk. Ezután 200 μl szérumot vittünk egy alufóliába csomagolt boroszilikát csőbe, és 200 μl butanol: acetonitrilt (1: 1) adtunk hozzá. Az elegyet 1 percig vortexeltük, és 72 mg hidratált K2PO4 20 μl vízben történő hozzáadása után ismét vortexeltük 30 másodpercig. Az extrakciós elegyet 2620 x g-vel 15 percig centrifugáltuk 4 ° C-ra előhűtött Sorval RC3C Plus centrifugában. Összesen 100 μl tiszta felülúszót injektáltunk a HPLC rendszerbe. A helyreállítási vizsgálatokat retinoidok hozzáadásával (5–50 ng 100 μl-ben) 3 külön szérummintához adtuk. A retinol visszanyerése ebben az extrakciós módszerben> 99%.

HPLC szérum retinol.

A HPLC rendszer egy SIL-HTC automatikus mintavevővel és hűtőrendszerrel (Man-Tech) ellátott Shimadzu LC-10ADVP modellből állt. A retinolt Partisil 10-ODS analitikai oszlopon (250 × 4,5 mm, Grace Discovery Sciences) elválasztottuk, és 10 mmol/l ammónium-acetátot tartalmazó acetonitril: víz (65:35) mozgófázissal eluáltuk. 1,2 ml/perc. A retinolt fotodióda tömb detektorral (Shimadzu SPD-M10 AVP modell) detektáltuk, amely 200 és 500 nm közötti spektrumokat gyűjtött. A retinol kalibrációs görbéit standard retinol tiszta oldatokkal (Sigma-Aldrich) kaptuk. A retinolra jellemző UV-spektrumokat és retenciós időket azonosítottunk, és a csúcsfelületeket λmax-330-nál mértük Shimadzu SZ-228 modell adatrendszerben. A retinol kimutatási határa 2 pg volt.

A szérum RBP4 mérése kvantitatív Western-blottolással.

A szérum RBP4 mennyiségét lényegében Graham és munkatársai által leírtak szerint számszerűsítettük. (28) A tiszta humán vizeletből származó RBP4 (Sigma-Aldrich) szolgált standard fehérjeként az RBP4 mennyiségi meghatározásához. Az elemzés során 20, 40 és 80 ng/μl RBP4 és 1 μL szérumminták standard oldatait használtuk. A fehérjéket 15% -os trisz-glicin SDS-PAGE géleken szétválasztottuk és Hybond nitrocellulóz membránokra (Amersham) vittük át. A blotokat egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk primer antitesttel, az anti-RBP4-kel, amelyet teljes hosszúságú humán RBP4-sel szemben termeltünk, és amelyet a prekurzor és érett egér, patkány és humán RBP4 kimutatására ajánlunk (Santa Cruz Biotechnology). Az elsődleges antitestet 1: 700 arányban hígítottuk. A blotokat ezután 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel (kecske nyúlellenes IgG-torma-peroxidáz, 1: 3000 arányban hígítva, Santa Cruz Biotechnology). Az antitest komplexeket enzimatikus kemilumineszcenciával (kemoszubsztrát készlet a Perkin Elmer cégtől) tettük láthatóvá, és a sávokat kvantifikáltuk ImageQuant 5.2 szoftverrel (Molecular Dynamics). Az egyes gélek standard RBP4 kalibrációs görbéit (másodrendű polinom görbék, r 2> 0,99) ábrázoltuk annak szérumkoncentrációinak kiszámításához.

Statisztikai analízis.

Az eredményeket átlag ± SEM formában mutatjuk be. A jelentőséget egyutas ANOVA-val értékelték, majd Newman-Keuls elemzéssel (Prism Graph Pad szoftver). A görbe alatti terület (AUC) glükóz és AUCinsulin összehasonlításához nem párosított Student t tesztet alkalmaztunk. A különbségeket a P 1. ábrán) tekintettük szignifikánsnak, és így folytattuk ezt 13 napig, ezt követően fokozatosan, alacsony ütemben kezdtek hízni. Másrészt az RA csoport egerei normálisan nőttek és híztak a kísérlet során. Az RA + egerek testtömege kisebb volt, mint az RA - egereké, a vizsgálat d 4 - től kezdődően (P 1. ábra). D 16 napon az RA + egerek 7,4% -kal kevesebbek voltak, mint az RA-kontrollok (P - [5,43 ± 0,14 g/(egérd)] és RA + (5,17 ± 0,13 g/(egérd)] csoportok.

Számos szerző arról számolt be, hogy az A-vitamin részt vesz az adipozitás és az energiamérleg szabályozásában (35, 36). Az A-vitamint kapó egerek lefogytak (37), és nemrégiben megfigyelték, hogy a magas zsírtartalmú étrend által előidézett elhízott egerek lefogytak, amikor RA étrendet fogyasztottak 5 hétig (38). Bár ebben a vizsgálatban az RA elnyomta az inzulinrezisztenciát, nem csökkentette a bazális glükózszintet. RA-t orálisan adtunk be diabéteszes egereknek 16 napig, és súlyuk 10% -át elvesztették. Mivel az RA-val kezelt egerek táplálékfelvétele nem különbözött a kezeletlen kontrollokétól, ezen egerek fogyása javította az energiafelhasználást.

Böjt állapotban az RBP4-hez kötött retinol körülbelül 1: 1 mólarányban kering a vérben, és tanulmányok kimutatták, hogy az RBP4-hez nem kötött retinol kis mennyisége is jelen van a keringésben (43, 44). Bár elméletileg a retinol: RBP4 arány a vérben 1, a mért arány> 1 a szabad retinol keringésben való jelenléte miatt. Motani és mtsai. (42) szérum retinol: RBP4 arányát sovány egerekben ∼1,78 arányban közölte, amely valamivel magasabb volt, mint az ilyen állatoknál mért értékeink (1,38; 4. ábra). Számos szerző összefüggést talált a szérum retinol: RBP4 arány elhízással és a 2-es típusú cukorbetegség között (16, 45, 46), ami arra utal, hogy a szérum retinol: RBP4 arány a 2-es típusú cukorbetegség relevánsabb mutatója, mint önmagában a szérum RBP4. Vizsgálataink során az ob/ob egerekben a szérum retinol: RBP4 arány szignifikáns növekedését tapasztaltuk a sovány egerekhez képest, és az RA kezelés 20% -kal csökkentette az arányt. Mivel a csökkent szérum retinol: RBP4 arány összhangban van a glükóz homeosztázis javulásával, javasoljuk, hogy ez felhasználható legyen a glikémiás indexet javító gyógyszerek hatékonyságának tesztelésére. Ennek a hipotézisnek a megerősítéséhez azonban több munkára van szükség több inzulinrezisztens állatmodellben.

Érdekes módon az ob/ob egerek keringésében jelentős mennyiségű megkötött retinol (a retinol: RBP4 arány alapján), egy potenciális toxin van jelen. Nem világos, hogy a szérumban lévő szabad retinolfelesleg hozzájárul-e a 2-es típusú cukorbetegség patogeneziséhez. Ebben az összefüggésben a legújabb tanulmányok nagyobb retinol: RBP4 arányról számoltak be a cerebrospinális folyadékban, mint az idiopátiás intrakraniális hipertóniában résztvevők szérumában, ami azt jelzi, hogy a szabad retinol részt vesz a cerebrospinális folyadékban az intrakraniális hipertónia patogenezisében (47, 48).

Összefoglalva, ez a munka azt mutatja, hogy az RA-kezelés jelentősen javítja az inzulinérzékenységet és a glükóz homeosztázist inzulinrezisztens ob/ob egerekben. Eredményeink alátámasztják az RA antidiabetikus aktivitását, amely klinikai jelentőségűnek bizonyulhat, és új kezelési stratégiákat kínál a 2-es típusú cukorbetegség kezelésében. Ezenkívül a szérum retinol: RBP4 arány biztosíthatja a gyógyszerek terápiás potenciálját a 2-es típusú cukorbetegség kezelésében.