Az alternatív spliceléssel létrehozott új IL-15 izoformák a bél hámjában expresszálódnak

Absztrakt

Korábbi tanulmányok azonosították az interleukin-15-et (IL-15) kódoló három izoformát, amelyek differenciál splicelés útján keletkeznek, és ugyanazon érett IL-15 fehérjét kódolják, két különböző szignálpeptiddel. Az egér bél hámsejtjeinek elemzése két új IL-15 mRNS izoformát tárt fel, amelyet különböző alternatív splicing események generáltak. Az egyik formában (IL-15ΔE6) a 6 exon hiányzik, a második formában a 7 exon első 48 nt-je hiányzik (IL-15ΔE7) egy alternatív 5'-splicing hely használatával a 7. exonban. Ezek az mRNS izoformák kódoltak kereten belüli IL-15 fehérje variánsok, amelyekből hiányzik sem 15aa (IL-15AE6), sem 16aa (IL-15AE7), mindkettő a normál hosszú szignálpeptidet használja. Jelentős szerkezeti változásokat jósoltak ezeknek az új IL-15 izoformáknak. Az RNS-védelmi vizsgálatok az izoform mRNS legnagyobb expresszióját mutatták ki a bélhámban, és a rekombináns IL-15 izoform fehérjék funkcionális elemzése lehetséges szabályozási funkciókat javasolt.

Bevezetés

Az Interleukin 15 (IL-15) egy 14–15 kDa 114aa glikoprotein, és a 4α-helix köteg citokinek családja (beleértve az IL-2, -4, -6, -7, -9, -15 és -21-et). Az IL-15 egy nagy affinitású IL-15 receptorból álló receptoron keresztül működik α-az IL-2/15 receptor β-lánc és a közös γ-lánc (γC). Az 1., 2. IL-15 az IL-2-vel kapcsolatban bizonyos biológiai funkciókat oszt meg in vitro a T-sejtek aktivációjának és proliferációjának stimulálása, az NK-sejtek citolitikus aktivitásának indukciója és az immunglobulin termelés B-sejtek által. 3, 4, 5, 6 A legújabb vizsgálatok megállapították, hogy az IL-15 meghatározó szerepet játszik az NK-sejtek, az NKT-sejtek és a bél IEL-ek kialakulásában, homeosztatikus proliferációjában és aktiválásában. A 7., 8., 9., 10., 11., 12. Az IL-15 és az IL-7 szintén elengedhetetlen a CD8 memória T-sejtjeinek homeosztatikus szabályozásához. Legalábbis a CD8 memória T-sejtjeinek proliferációja és az NK-sejtek túlélése esetén az IL-15 egy szokatlan mechanizmuson keresztül működik, amelyet transzpresziónak neveznek, amelyben az IL-15Rα-az egyik sejttípus által expresszált lánc megkötött IL-15-et mutat az IL-15R-t expresszáló sejtekhezβ és a γC. 7, 16, 19, 20, 21 További tanulmányok az IL-15-t pleiotróp citokinként tárják fel, amelynek szélesebb biológiai funkciói meghaladják az immunrendszer szabályozását, például anabolikus hatásokat közvetítenek a vázizomzatra. 22, 23

Széles biológiai funkciójú, hatékony immunmodulátorként az IL-15 expresszió szigorúan ellenőrzött a transzkripció, a transzláció és az intracelluláris kereskedelem szintjén. Az alternatív splicing egy általános szabályozó mechanizmus, amelyet számos biológiailag és immunológiailag fontos molekula, például a TCR variánsainak előállítására használnak. ζ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, CD44 és CD45, és az IL-15-re is vonatkozik. 25 Az IL-2, IL-4 és IL-6 splice variánsok mindegyikéből hiányzik egy exon, úgy vélik, hogy ezek a citokin szignalizáció természetes inhibitorai, lényegében a citokin domináns negatív formáiként hatnak, amelyek a teljes hosszúságú citokinrel versenyeznek. receptorkötés. 26, 27, 28 Az IL-15 esetében az eddig azonosított mRNS-splicing variánsok mind ugyanazt a teljes hosszúságú érett fehérjét kódolják, de két különböző szignálpeptiddel. Az alternatív splicing eredményeként három IL-15 mRNS izoformát képeznek, amelyek a következő exonhasználati kombinációk révén termelődnek: 1-2-3-4-5-6-7-8 exonok; Az 1-3-4-5-6-7-8 vagy az 1-3-4-Ex exonok (5. alternatív exon) -5-6-7-8). Az IL-15 izoformák vagy a rövid szignálpeptidet (szekvencia-specifikus (SSP), 21aa az emberben, 26aa az egérben) vagy egy szokatlanul hosszú 48aa (LSP) szignálpeptidet alkalmazzák. 29.

Bár úgy gondolják, hogy az IL-15 expressziót szigorúan ellenőrzik, nem világos, hogy létezik-e szövet-specifikus expresszió és az IL-15 izoformák szabályozása. Korábbi kutatások kimutatták, hogy mind az SSP, mind az LSP szekvenciájú IL-15 mRNS izoformák aktivált monocitákban/makrofágokban, több sejtvonalban, hereben, szívben, csecsemőmirigyben és függelékben expresszálódtak, míg vázizmokban csak az LSP-IL-15 izoform mRNS expresszálódott. és vese. 30, 31, 32 Az egér bélhámjában jelen lévő IL-15 mRNS két új izoformáját azonosítottuk, az egyikben hiányzott a 6 exon, a másikból pedig a 7 exon egy része hiányzott. Mindkettő az LSP használatával kódolja a kereten belüli fehérjéket, és úgy tűnik, hogy gátolják teljes hosszúságú IL-15 a proliferáció közvetítésében.

Eredmények

Új IL-15 izoformák molekuláris klónozása

Az egér IL-15 génje 7 intronból és 8 exonból áll, 33, míg a 4. intron egy részét később alternatív 5. exonként azonosítottuk. 34 Két IL-15 mRNS izoformát különböző szignálpeptidet kódoló szekvenciákkal (48aa LSP és 26aa SSP) különböző egérszövetekben vannak jelen. 30, 31, 32, 35 Mivel ismert, hogy az IL-15 a 36, 37, 38 bélhámban expresszálódik, meg akartuk állapítani, hogy az IL-15 izoformák szövetspecifikus expressziója létezik-e az egér belében. Ennek érdekében az IL-15 reverz transzkripciós PCR-jét végeztük egér bélhámsejt RNS-ből. Két 619 és 483 bp-os terméket jósolnak az LSP és az SSP használatához kapcsolódó izoformákra. Három cDNS-terméket kaptunk azonban 400–650 bp tartományban (1a. Ábra). A termékeket TA vektorba klónoztuk, és olyan rekombináns plazmidokat választottunk ki, amelyek mind a három termék egyikét tartalmazzák, a restrikciós enzim emésztéssel (1b. Ábra).

Az izolált PCR-termékeket ezután DNS-szekvenálásnak vetettük alá, amely megerősítette, hogy a közepes méretű termék normál IL-15 cDNS-t képvisel, és hogy a legnagyobb termék megfelel az IL-15 izoformának, alternatív 5 exont alkalmazva, amely 136nt hozzáadását eredményezi. A több plazmidból származó cDNS szekvenálása azt mutatta, hogy a legkisebb PCR termék valójában két szekvenciát tartalmazott, amelyek 45 vagy 48 nt rövidebbek voltak, mint a normál IL-15 cDNS szekvencia (1c. Ábra). Szekvenciaillesztéseket használtunk ezen szekvenciák összehasonlításához az IL-15 cDNS-sel. Egyik szekvencia sem tartalmazta az 5. alternatív exont (1c. Ábra). Az egyik izoformában a 6 exon (45 nt) hiányzott, a szekvencia fennmaradó részében megegyezett a normál IL-15-vel, ezt az IL-15AE6 izoformát neveztük el (GenBank hozzáférési szám: DQ083236); a másik izoformában a 7 exon első 48 nt-je hiányzott egy alternatív 5 ′ 5 'toldási hely használatávalCAG ∣ GU3′ A 7. exonban, és ezért ezt a variánst IL-15ΔE7-nek neveztük (GenBank hozzáférési szám: DQ083237). Így a két cDNS-izoform csak hosszában különbözött 3 nm-től, ami megmagyarázta a termékek standard gélelektroforézissel történő szétválasztásának képességét.

Az IL-15AE6 és IL-15AE7 izoformák előre jelzett fehérjeszekvenciája és szekunder szerkezete

A 2. és az 5. alternatív exon felvétele vagy kizárása alapján a korábbi vizsgálatok három alternatíván splicelt IL-15 mRNS izoformát azonosítottak (az 1d. Ábra a Nishimura-ból származik). et al. 29.) A különböző szignálpeptidet kódoló szekvenciák használata ellenére az ismert izoformák ugyanazt az érett fehérjét kódolják. Az itt leírt új izoformákban a 6 exon hiánya az IL-15AE6-ban vagy a 7 exon egy részének hiánya az IL-15AE7-ben különálló csonka érett fehérjék termelését eredményezné (1d. Ábra). Ez kiderült az IL-15AE6 és az IL-15AE7 levezetett fehérjeszekvenciáiból, amelyek mind a kereten belüli fehérjéket kódolják. A 6. exon törlése 15aa veszteséget eredményezne (18 SIHIDTTLYTDSDFH 32), a 7. exon csonkolása pedig 16aa törlést eredményezne (33 PSCKVTAMNCFLLELQ 48) (2a. Ábra). Ezenkívül, míg az IL-15ΔE6 fehérje megtartaná az érett IL-15-ben jelen lévő láncon belüli diszulfid kötési helyeket, az IL-15AE7 szekvencia változásai két cisztein elvesztését eredményeznék, amelyek részt vesznek a diszulfid áthidalásában (2b. Ábra).

Az új IL-15 izoformákra jósolt fehérjeszekvenciák és szekunder struktúrák elemzése. (a) A levezetett aminosav-szekvenciák illesztése az IL-15 izoformák érett fehérjéjében. (b) Az IL-15 izoform fehérjék sematikus ábrázolása. A normál IL-15 15aa kikelt területét a 6. exon kódolja, és nincs ÄE6 izoformában; a 7-es parciális exon által kódolt üres terület Cys20 és Cys27-et tartalmaz, amelyek normál IL-15-ben két diszulfidkötést alkotnak. A 16aa hiánya az ÄE7 izoformából a diszulfidkötések várható elvesztését eredményezi. A dobozok nem méretarányosak. (c) A SOPMA programmal létrehozott IL-15 izoform fehérjék szekunder szerkezete. A α a hélixeket csúcsként mutatják (hirdetés). Az érett fehérjében lévő aminosav-számokat a x tengelyeket.

Mivel az IL-15 a 4 tagjaα-helix köteg citokin család, elemeztük az új IL-15 izoformák másodlagos szerkezetét is (2c. ábra). Az IL-15ΔE6 forma mind a 4-et tartalmaztaα hélixek (A – D), bár az A és B hélixek között rövidebb összekötő hurkot eredményezett a 6 exon által kódolt 15aa hiánya. Érdekes módon egy hasonló szerkezet, amelynek rövidebb hurkja van az első 2 között α hélixek vannak jelen az IL-2 és az IL-4 antagonista alternatív módon splicelt izoformáiban. Figyelembe véve az IL-15 és az IL-2 szerkezetének és biológiai funkcióinak hasonlóságát, lehetséges, hogy az IL-15AE6 a normális IL-15 antagonistája lehet. Az IL-15ΔE7 esetében a másodlagos szerkezet drámai változását jósolták a második elvesztésével α spirál (2c. ábra). IL-15Rα az egér IL-15 kötőhelyeit még nem azonosították, de a második és a harmadik α az emberi IL-15 spirái az emberi IL-15R kölcsönhatásának helyeiα. 40 Ha ez igaz az egér IL-15 esetében, akkor az IL-15AE7 megváltoztathatja az IL-15R kötési aktivitásátα vagy IL-15Rβγ-láncok.

A szövetek eloszlása és az IL-15 izoformák relatív bősége

Szöveteloszlás és relatív IL-15 mRNS izoformák. (a) RNáz-védelmi vizsgálat egy 32 P-jelölt antiszensz próbával mindhárom izoformának kimutatására. A külső sávok az IL-15, Bcl-2, L32 és GAPDH szondáit tartalmazzák, mint RNS méret standardokat. Az osztott nyilak azt jelzik, hogy az RNS próba fragmenseit szöveti mRNS védi az RNáz emésztésétől. Belső kontrollként az L32 és a GAPDH háztartási géneket alkalmazzák. A bemutatott eredmények három kísérletre vonatkoznak. (b) A szövetekből származó IL-15 mRNS izoformák mennyiségi meghatározása. Az eredményeket három kísérlet képintenzitásának átlag- és standard deviációjaként mutatjuk be, miután normalizáltuk az egyes szövetekben a GAPDH háztartási gén mRNS-tartalmára és a vesében a GAPDH RNS-szintre standardizáltuk.

Az IL-15AE6 és IL-15AE7 expressziója és funkcionális elemzése

Az IL-15 izoformák fehérje expressziója és működése. (a) Tisztított IL-15 izoform fehérjék Western blotja anti-IL-15 poliklonális antitesttel. A fehérjéket E-vel jelölt fúziós fehérjékként fejezik ki. coli. és Ni-NTA agaróz oszlopon tisztítjuk. (b) A CTLL-2 vizsgálatot három párhuzamosan, oszlopon tisztított normál, ΔE6 és ΔE7 izoformák 1: 2 sorozatos hígításával hajtottuk végre. Az izoformhoz hasonló mennyiségeket adtunk a vizsgálathoz, amelyet Western-blot-analízissel határozunk meg anti-Xpress mAb-vel (az adatokat nem mutatjuk be). A LacZ fehérjét használtuk negatív kontrollként a CTLL-2 biológiai vizsgálathoz. (c-e) Rekombináns humán IL-15-et adtunk 80 ng/ml koncentrációban a CTLL-2 sejtekhez pozitívan kontrollként a vele jelölt normál IL-15 titrált dózisainak jelenlétében (c) izoform ΔE7 (dvagy izoform ΔE6 (e). Az adatokat a három kútmintának átlagaként és szórásaként mutatjuk be.

Vita

Anyagok és metódusok

A C57BL/6J egereket a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, ME, USA) szereztük be.

A bél hámsejtjeinek izolálása

A C57BL/6J egerek bélhámsejtjeit alacsony hőmérsékletű módszerrel izoláltuk, a korábbiakban leírtak szerint, 52 kisebb módosításokkal. Röviden, két vékonybelet eltávolítottunk és hideg Hank kiegyensúlyozott sóoldatával/0,5 mM DTT-vel öblítettük, Pasteur pipettára vittük, 2-3 mm-es darabokra vágtuk, 4 ° C-on 5 percig kevertük, és centrifugálással lebontottuk. A béldarabokat ezután 150 ml pH = 7,3 kelátképző pufferben (27 mM trinátrium-citrát, 5 mM Na2HPO4, 96 mM KH2PO4, 1,5 mM KCL, 0,5 mM ditiotreitol, 55 m MD-szorbit, 44 mM) inkubáltuk. szacharóz) 4 ° C-on, állandó keverés közben 20 percig, majd 20 ml hideg kelátképző pufferben, 50 ml-es kúpos csőben, óvatos rázással mossuk. A töredékeket hideg kelátképző pufferrel mossuk 10-szer, és a felülúszót összegyűjtjük (villus frakció). Az üledéket ismét 100 ml friss kelátképző pufferben keverjük 4 ° C-on 10 percig, 10-szer mossuk, és a felülúszót összegyűjtjük (kriptafrakció). A villus sejtek és a kriptasejtek morfológiáját mikroszkóppal igazolták.

Az IL-15 izoformák molekuláris klónozása

RNase védelmi vizsgálat

A C57BL/6J egerek frissen izolált szöveteit és szerveit fagyasztva rögzítettük, összetörtük, feloldottuk és homogenizáltuk GIT pufferben (5 M guanidin-izotiocianát, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, pH 8,0, és 5% 2-merkaptoetanol)., 5,7 M CsCl fölött rétegezve, majd 55 000 fordulat/perc sebességgel forogva 3 órán át. Az RNS minőségét és integritását spektrofotométerrel és agaróz gél analízissel határoztuk meg.

Fehérje expresszió és tisztítás

Rekombináns pET100/D-TOPO plazmidokat, amelyek normál IL-15 (N), vagy IL-15AE6, vagy IL-15AE7 érett fehérjét kódoló szekvenciákat és pozitív pET100/D-TOPO-LacZ (Invitrogen) kontrollt transzformáltak a BL21 Star ™ -ba (DE3) Egy lövéssejtet (Invitrogen), egyetlen telepeket szedtünk és LB táptalajon tenyésztettünk. N′ Terminális 6x His-tagjelölt fehérje expresszióját 1 m M IPTG hozzáadásával indukáltuk 4-5 órán át, és a baktériumokat centrifugálással gyűjtöttük 6000 rpm-en. 10 percig. A fehérjéket affinitáskromatográfiával tisztítottuk Ni-NTA Agarose-on (Qiagen 30210) a termékprotokoll szerint.

Western blottolás

A tisztított fehérjéket 10–20% -os gradiens SDS – PAGE (BioRad, Hercules, CA) gélen elválasztottuk, és 100 mA állandó áram mellett PVDF membránra (BioRad) vittük át. A PVDF membránt inkubáltuk egér anti-Xpress Ab (Invitrogen 46-0528), egér anti-HisG Ab (Invitrogen 46-1008) vagy nyúl anti-egér IL-15 poliklonális Ab-tal (eBiosciences, San Diego, Kalifornia, USA). másodlagos Abs nyúl anti-egér IgG-vel (Sigma, St Louis, MO, USA) vagy kecske-anti-nyúl IgG-vel (KPL 214-1516) HRP-vel konjugálva, és az ECL-advanced Western Detection Kit (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA).

CTLL-2 assay

A CTLL-2 sejteket táptalajban tartottuk (Dulbecco módosított Eagle táptalaj 10% magzati borjúszérummal, 0,1 m M.). Minimális esszenciális tápközeg nem esszenciális aminosavak, 2 mM L-glutamin, 5,5 × 10-5 M β-merkaptoetanol, 1 m M nátrium-piruvát, 10 m M HEPE, pH 7,4, 50 mg/ml gentimicin-szulfát és 100 μ/ ml penicillin/100 μg/ml sztreptomicin) rekombináns humán IL-2 hozzáadásával (amelyet az NCI BRB reagens program segítségével kaptunk). A vizsgálathoz a CTLL-2 sejteket log-fázisú növekedésben háromszor mossuk IL-2 nélküli táptalajon. A tisztított normál IL-15, IL-15AE6, IL-15AE7 vagy a LacZ kontroll rekombináns fehérje hasonló koncentrációit (az anti-Xpress mAb Western blot segítségével meghatározzuk, az adatokat nem mutatjuk be) sorozatosan hígítottuk 100-ban. μ1 RPMI 96 üregű lemezeken, majd 4000 CTLL-2 sejt/100 hozzáadása μl/kút. A blokkoló vizsgálathoz 20 μ1 standard rhIL-15 80 ng/ml-t adtunk a hígított His-N, His-IL-15AE6 vagy His-IL-15AE7-t tartalmazó üregekbe, mielőtt CTLL-2 sejteket adtunk volna hozzá. A sejteket 18 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. 1 μCi/lyuk [3H] timidint adtunk a tenyészetbe az utolsó 6 órán át. A sejteket összegyűjtöttük, és a [3H] timidin beépülését folyékony szcintillációs számlálóval mértük.