Határok a farmakológiában

Etnofarmakológia

Ez a cikk a kutatási téma része

Rendszerfarmakológia és hagyományos kínai orvoslás Az összes 19 cikk megtekintése

Szerkesztette
Aiping Lu

Hongkongi Baptista Egyetem, Hongkong

Felülvizsgálta
Jianbo Wan

Macau Egyetem, Kína

Yanfang Zheng

Fujian Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem, Kína

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

határok

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Gyógyszerészeti Informatikai Intézet, Gyógyszerésztudományi Főiskola, Zhejiang Egyetem, Hangcsou, Kína
  • 2 Zhejiang tartomány mikrobiológiai technológiájának és bioinformatikájának legfontosabb laboratóriuma, Zhejiang Mikrobiológiai Intézet, Hangzhou, Kína
  • 3 NMPA kulcsfontosságú laboratórium a gyógyszerészeti mikrobiológia tesztelésére és figyelmeztetésére, Zhejiang Mikrobiológiai Intézet, Hangcsou, Kína
  • 4 Krónikus Betegségkutató Intézet, Táplálkozási és Élelmiszer-higiéniai Tanszék, Közegészségügyi Iskola, Zhejiang Egyetem Orvostudományi Kar, Hangzhou, Kína
  • 5 Közegészségügyi Iskola, Zhejiang Egyetem Orvostudományi Kar, Hangzhou, Kína
  • 6 Preklinikai Orvostudományi Főiskola, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, Kína
  • 7 Műszaki Központ, Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co. Ltd., Hangcsou, Kína

Bevezetés

A különféle egészségügyi problémákkal és csökkent élettartammal összefüggő betegségállapotként definiált elhízás (Hoyt et al., 2014) az elmúlt évtizedekben komoly egészségügyi kérdéssé vált (James, 2008). Becslések szerint világszerte több mint 1 milliárd ember hajlamos az elhízásra 2030-ig (Kelly et al., 2008). A zsírszövet felhalmozódása miatt az elhízott személyek hajlamosak az anyagcserezavarokra, beleértve az inzulinrezisztenciát, a 2-es típusú cukorbetegséget, a zsíros májbetegségeket és a szív- és érrendszeri betegségeket (Kopelman, 2000). A mai napig hiányzik az ígéretes stratégiák az elhízás megelőzésére és kezelésére, részben az elhízás előfordulását szabályozó mechanizmusok és a kapcsolódó anyagcsere-betegségek kialakulásának korlátozott ismerete miatt.

A bonyolult környezeti és genetikai tényezők közül a bél mikrobiota kritikus szerepet játszik a HFD által kiváltott elhízás és az elhízással összefüggő anyagcsere-betegségek szabályozásában (Turnbaugh et al., 2006; Cani et al., 2009; Ridaura et al., 2013). Elismert tény, hogy az étrend körülbelül 57% -ban befolyásolja a bél mikrobiota szerkezetét, míg a genetikai tényezők körülbelül 12% -ot (Tomasello et al., 2014). Azokkal a nyomokkal összhangban, hogy az elhízott fenotípus előfordulása a bél mikrobiózissal társul, amelyet a Firmicutes gazdagabb mennyisége és a szegényebb Bacteroides jellemez elhízott ob/ob egerekben (Ley et al., 2005), valamint hogy az elhízott ikrek bél mikrobiotájának átültetése az alacsony zsírtartalmú étrenddel etetett egerek transzmisszív adipozitási fenotípusokat eredményeznek (Ridaura et al., 2013), a bél mikrobiota szerkezetének és funkciójának megcélzása ígéretes stratégia lehet az elhízás megelőzésében és kezelésében.

A bél mikrobiota hatással van a tápanyagok megszerzésére, az energiatermelésre és a gazda anyagcsere útvonalaira (Devaraj et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). Az elhízás forgatókönyvében a lipid-, szénhidrát-, epesav- és aminosav-anyagcsere rendellenességek valószínűleg összefüggenek a bél mikrobiotájának összetételbeli változásával (Caesar et al., 2010; Yokota et al., 2012; Devaraj et al., 2013; Neis és mtsai., 2015). A széklet metabolomikájának vizsgálata, különösen annak összefüggése a bél mikrobiomjának funkcionális kiolvasásával, nagy jelentőséggel bír az étrend – mikrobiota – anyagcsere kölcsönhatások megértése szempontjából (Cheng et al., 2018; Zierer et al., 2018).

Anyagok és metódusok

KSLP előkészítés

A KSLP-t (Med-drug engedélyszám: B20021021) a Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co. Ltd.-től (Hangcsou, Kína) szereztük be. Hat gyógynövényből áll, köztük R. glutinosa (Gaertn.) DC., P. ginseng C.A. Me., A. cochinchinensis (Lour.) Merr., O. japonicus (Thunb.) Ker Gawl., L. chinense Mill. És P. cocos (Schw.) Farkas. mivel a vegyület vegyes aránya 409: 167: 26: 26: 26: 77, a KSLP előállítását a szabadalmi leírás (CN 1943707 B) szerint követjük (Zhou, 2012). A HPLC ujjlenyomat-eredményeit három különböző tételből (Batch 20171020, 20180302 és 20180716) soroltuk (1. kiegészítő ábra). A jelenlegi vizsgálatban a KSLP-t (Batch 20171020) feloldottuk Milli-Q vízben, és felhasználás előtt gyógyszer-szuszpenzióként készítettük.

Állatok és kísérleti tervezés

A C57/BL6 egereket (hím, 6-8 hét) a Shanghai ReMed Biotechnology Co. Ltd.-től (Sanghaj, Kína, www.remed-bio.com) vásároltuk, és a következő környezetben tartottuk fenn: 24–26 ° C, 40 ° C –60% páratartalom, 12 órás világos/sötét ciklus, étel és víz ad libitum. Az állatkísérleteket Zhejiang tartomány központjában végeztük a betegség elleni védekezés és megelőzés céljából. A laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutatót követték (Mason és Matthews, 2012).

Az egereket négy csoportra osztottuk: normál étrend (ND, n = 5), a KSLP-vel ellátott normál étrend (ND_K, n = 5), magas zsírtartalmú étrend (HFD, n = 9), és a HFD a KSLP-vel (HFD_K, n = 9). A normál étrendi takarmányt a Zhejiang kísérleti állatközpont szolgáltatta, és a szabvány végrehajtása GB14924.1-2001 volt. A HFD takarmányt a Research Diets szállította (New Brunswick, NJ, USA), az energiaellátási arány 60% zsír, 20% fehérje és 20% szénhidrát volt. Az egereket vagy 0,45 g/kg/nap KSLP-reszuszpenzióval, vagy azonos mennyiségű vízzel intagasztrikusan adagoltuk 12 egymást követő héten át.

Az egerek testtömegét és a táplálékfelvételt hetente mértük. A kísérleti periódus 9. hetén orális glükóz tolerancia tesztet (OGTT) hajtottak végre. A kísérlet végén az egereket 4 órán át éheztettük, mielőtt a szem vére összegyűlt volna. Ezt követően egérmintákat gyűjtöttünk a további vizsgálatokhoz. Részletesen a zsigeri zsírszövet mintáit (VAT, beleértve az epididymális zsírokat, a perirenalis zsírokat és a mesentery zsírokat), a szubkután zsírszövetet (SAT), interscapularis barna zsírszövetet (BAT) és a gastrocnemius izmokat vonták ki súlyozás céljából; a bél ürülékét összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk, amíg el nem küldtük 16S rRNS génszekvenálásra és nem célzott metabolomikai elemzésekre.

Vér biokémiai teszt

A vérmintákat 2 órán át mozdulatlanul tartottuk, majd 15 percig 4 ° C-on 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. Centrifugálás után a felülúszókat vérbiokémiai vizsgálat céljából összegyűjtöttük. A trigliceridet (TG), az összes koleszterint (CHOL), az alacsony sűrűségű lipoproteint (LDL), a nagy sűrűségű lipoproteint (HDL) és a glükózt tartalmazó paramétereket Hitachi 7180 automatikus biokémiai analizátorral (Kiotó, Japán) vizsgáltuk.

Az OGTT esetében az egereket 4 órán át éheztettük, mielőtt intragasztrikusan beadtuk őket glükózoldattal 2,5 g/kg dózisban. A kiinduláskor (0 perc), 30, 60 és 120 perccel a glükóz beadása után farokvért gyűjtöttünk a glükózszint mérésére (Super glucocard II GT-1640, ARKRAY Factory, Inc., Kiotó, Japán). Glükózgörbét készítettünk, és a glükózgörbe alatti területet (AUC) a következő képlet alapján számítottuk ki: AUC = (FPG/2 + 60 perc PG + 120 perc PG/2) × 1 h mmol · h/L (FPG: éhomi plazma glükóz).

Bélmikrobiota szekvenálás és adatelemzés

A székletminták egy részét elküldtük a Zhejiang Tianke high-tech Co., Ltd. (Hangzhou, Kína. Http://www.tkgeneclub.com/tkgeneclub/index.html) 16S rRNS génszekvenálására. A teljes genomi DNS-t 0,25 g ürülékből extraháltuk a PowerSoil ® DNS izoláló készlet (MO BIO, katalógusszám: 12888, Carlsbad, CA, USA) segítségével a gyártó protokolljainak megfelelően. A DNS-koncentrációt és tisztaságot 1% -os agarózgéleken követtük. A koncentrációnak megfelelően a DNS-t steril vízzel 1 ng/μl-re hígítottuk. A 16S rRNS géneket specifikus primerrel (16S V3 – V4: 341F-806R) amplifikáltuk vonalkóddal. Az összes PCR reakciót KAPA HiFi ™ HotStart ReadyMix (2 ×) alkalmazásával hajtottuk végre. A PCR-terméket 1% -os agarózgél-elektroforézissel igazoltuk. Az amplifikált termékeket Beckman DNS Clean Beads-szal tisztítottuk, és a Qubit 2.0 fluorométerrel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) számszerűsítettük. A könyvtárat 60 pM-re hígítottuk. A dúsított könyvtárat Ion 530 ™ Chip-be töltöttük, és egy Ion S5 ™ platformon (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) szekvenáltuk, és körülbelül 500 bázispárnyi egyvégű leolvasást generáltunk. A nyers szekvenálási adatok az NCBI Sequence Read Archive (SRA) adatbázisában állnak rendelkezésre, és a PRJNA565488 bioprojekthez kapcsolódnak.

Gén expressziós elemzés

Az Akkermansia kifejeződését tovább elemeztük a valós idejű qPCR alkalmazásával, másutt leírva (Everard et al., 2013). A primereket a Sangon Biotech-től (Sanghaj, Kína) szereztük be, és a 16S rDNS-t amplifikálták endogén referencia génként. A relatív expressziót a ΔΔCT módszerrel számoltuk, és a kontroll (ND csoport) összehasonlításában a redőny változásaként fejeztük ki.

Nem célzott anyagcsere-tanulmány

A székletminták egy részét a Calibra Diagnostics, Ltd. (Hangzhou, Kína, www.metabolon.com) közreműködésével juttatták el a Metabolonhoz nem célzott metabolomikai vizsgálat céljából. Röviden, körülbelül 50 mg székletet fagyasztva szárítottunk fagyasztva szárítóban (FreeZone 2,5 L, LABCONCO, Kansas City, MO, USA) 8 órán át. Ezután a mintákat MicroLab STAR ® rendszerrel (Hamilton, Svájc) vetjük alá automatikus feldolgozás céljából, amely magában foglalja a szűrést, a fehérje kicsapásához metanol hozzáadását és a centrifugálást, mielőtt az egyes minták felülúszóját a szerves oldószer elpárologtató rendszerbe TurboVap ® II-be visszük. eltávolítása és mobil fázis helyreállítása.

Ultrahagy teljesítményű folyadékkromatográfia – tandem tömegspektroszkópia (UPLC-MS/MS): Minden módszer egy Waters Acquity ultraperformáns folyadékkromatográfiát és egy Thermo Scientific Q-Exactive nagyfelbontású/pontos tömegspektrométert használt, mellyel összekapcsolták a fűtött elektromos spray-ionizációt (HESI-II) forrás és Orbitrap tömegelemző 35 000 tömegfelbontással működött. Az UPLC és az MS konkrét feltételeit, valamint a módszer validálását a korábbi cikkek részletesen ismertették (Long et al., 2017).

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± standard hibaként adjuk meg (S.E.M.). A statisztikai különbségeket két csoportban értékeltük varianciaanalízissel (ANOVA) a GraphPad Prism 7.0 szoftver segítségével. A metabolomikai kutatásban statisztikai elemzéseket végeznek az ArrayStudio-ban; Hallgatói t tesztet két csoport között végeztünk, míg ANOVA-t két csoport között használtunk. A o 0,05 alatti érték statisztikai szignifikanciát jelzett. A Pearson-korrelációs elemzést SPSS-sel végeztük, és a megfelelő hőtérképet Excel és Adobe Illustrator segítségével vizualizáltuk.

Eredmények

KSLP csökkent testtömeg, fehér zsírszövet arány és javult glükóz tolerancia zavar a HFD egerekben

Asztal 1 A szérum lipid- és glükózszint négy csoportban.

2. ábra A KSLP rekonstruálta a bél mikrobiota közösségét HFD egerekben. (A) Rarefakciós görbe elemzése. Az abszcissza a mintából véletlenszerűen kivont szekvenciák száma, az ordináta pedig az OTU-k száma, amelyek a szekvenálási számok száma alapján felépíthetők. (B) A diagramokat a fő koordinátanalízis (PCoA) felhasználásával állítottuk elő.

2. táblázat A HFD és a KSLP hatása a bél mikrobiota sokféleségére.

Az UniFrac-alapú PCoA-t értékeltük, hogy összehasonlítsuk az egyes csoportok mikrobiota-struktúráját (2B. Ábra). Míg az ND és az ND_K klaszterek összeolvadtak, az ND/ND_K, a HFD és a HFD_K csoportok számára külön fürtök jelentek meg. Ez az eredmény arra utalt, hogy a KSLP megváltoztatta a bél mikrobiota összetételét a HFD egerekben, de nem volt hatással az ND egerekre.

A KSLP szabályozott bélmikrobiota menekültügyi és családi szinten HFD egerekben

6. ábra HFD egerekben a KSLP kezelésre reagáló legfontosabb filotípusok. (A) Az ND (lila), az ND_K (piros), a HFD (zöld) és a HFD_K (sárga) egerek székletmikrobiotájában lineáris diszkrimináns analízis (LDA) pontszámokat számítottunk ki differenciális mennyiségben. Az LDA pontszám jelezte az egyes differenciálisan bőséges taxonok hatásának nagyságát és rangsorát (LDA> 4). (B) Valós idejű qPCR elemzés. Az Akkermansia relatív expresszióját az ND csoporthoz viszonyított szeres változásként fejeztük ki.

A KSLP által szabályozott, az elhízással kapcsolatos bélmikrobiota

Mivel 27 olyan nemzetséget azonosítottunk, amelyekben szignifikáns változások voltak az ND és a HFD csoportok között, a 27 nemzetség és az elhízással kapcsolatos paraméterek közötti korrelációt Pearson-korrelációs elemzéssel számoltuk. Az eredményeket a 2. kiegészítő táblázatban foglaltuk össze, és hőtérképként mutattuk be (7. ábra). Általánosságban elmondható, hogy kilenc nemzetség volt szorosan összefügg az elhízás fenotípusával, amelyek közül erős pozitív Intestinimonas, Oscillibacter, Lactococcus, Christensenellaceae_R-7_csoport, és Aliihoeflea, míg a Ruminococcaceae_UCG-014, a Prevotellaceae_UCG-001 esetében szignifikáns negatív együttállást azonosítottak, Muribaculum, és Family_XIII_AD3011_group (7. ábra). Ebből a kilenc nemzetségből, Intestinimonas, Oscillibacter, Christensenellaceae_R-7_csoport, és Aliihoeflea HFD egerekben KSLP-vel meg lehet fordítani (5C. ábra). Ezért, Intestinimonas, Oscillibacter, Christensenellaceae_R-7_csoport, és Aliihoeflea HFD egerekben a KSLP beavatkozási célpontjai lehetnek.

8. ábra Különböző metabolitok három csoport között. (A) Felfelé és lefelé szabályozott metabolitok száma. (B) A metabolitok befolyásoló tényezője kétirányú ANOVA alkalmazásával.

A KSLP az elhízással összefüggő nemzetségek korrelált metabolitjaikkal együtt

Különös figyelmet fordítottak az azonosított elhízással kapcsolatos bél mikrobiota és a megfordított metabolitok közötti újfajta belső kapcsolat feltárására a KSLP-re adott válaszként HFD egerekben. E tekintetben korrelációs elemzést végeztünk a KSLP-felelős-elhízással kapcsolatos négy azonosított nemzetség alkalmazásával. Intestinimonas, Oscillibacter, Christensenellaceae_R-7_csoport, és Aliihoeflea, valamint a 22 KSLP-felelős-HFD-vel kapcsolatos metabolit (6. kiegészítő táblázat).

Amint azt a hőtérkép mutatja (9. ábra), Intestinimonas, Oscillibacter, és a Christensenellaceae_R-7_csoport nagyon hasonló metabolit kapcsolati mintákat mutatott, amelyek pozitívan korreláltak a hisztidilalaninnal, a fenilalanilglicinnel és a gamma-CEHC-vel, de negatívan korreláltak a N-metilalanin, N,N,N-trimetil-5-aminovalerát, (12 vagy 13) -metil-mirisztát (a15: 0 vagy i15: 0), 2-hidroxi-arachidát *, 2-hidroxibehenát, 2-hidroxilignocerát *, 3-ketoszfinganin, lanoszterol, stigmasztadienon, 2′-dezoxinozin, N6-metiladenozin, 2′-dezoxi-guanozin, 5,6-dihidrouridin és hidroxi-metil-pirimidin. Ami pedig Aliihoeflea, gyenge korrelációt mutatott a felsorolt ​​metabolitokkal, kivéve a (12 vagy 13) -metil-mirisztáttal (a15: 0 vagy i15: 0) és a 3-ketoszfinganinnal való negatív együttállást.

9. ábra A KSLP-felelős-elhízással kapcsolatos nemzetségek és a KSLP által fordított metabolitok közötti összefüggés. ** |r| > 0,5 és o Kulcsszavak: Hagyományos kínai orvoslás, magas zsírtartalmú étrend, elhízás, bél mikrobiota, széklet nem célzott metabolomika, korrelációs elemzés

Idézet: Gong S, Ye T, Wang M, Wang M, Li Y, Ma L, Yang Y, Wang Y, Zhao X, Liu L, Yang M, Chen H és Qian J (2020) Hagyományos kínai orvoslás képlete Kang Shuai Lao Pian Javítja az elhízást, a bél diszbiózist és a széklet anyagcserezavarait a magas zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben. Elülső. Pharmacol. 11: 297. doi: 10.3389/fphar.2020.00297

Beérkezett: 2019. november 19 .; Elfogadva: 2020. február 27.;
Megjelent: 2020. március 25.

Aiping Lu, Hongkongi Baptista Egyetem, Hongkong

Yanfang Zheng, a Fujian Tradicionális Kínai Orvostudományi Egyetem, Kína
Jianbo Wan, Macau Egyetem, Kína