A bársony agancs polipeptid hatása az öregedő hím egerek szexuális viselkedésére és tesztoszteron szintézisére

Zhi-Jun Zang

1 Meddőségi és Szexuális Orvostudományi Osztály, Harmadik Társult Kórház, Sun Yat-sen Egyetem, Guangzhou, Kína

Hong-Feng Tang

2 Bőrgyógyászati Osztály, Shunde Első Népi Kórház, amely a Southern Medical University-hez kapcsolódik, Foshan, Kína

Ying Tuo

3 Szövettani Klinika, Első Társult Kórház, Sun Yat-sen Egyetem, Guangzhou, Kína

Wei-Jie Xing

4 Reproduktív Orvosi Központ, a harmadik társult kórház, Sun Yat-sen Egyetem, Guangzhou, Kína

Su-Yun Ji

5 Bőrgyógyászati Osztály, Guangdong Tartományi Bőrgyógyászati Kórház, Guangzhou, Kína

Yong Gao

6 Reproduktív Orvosi Központ és Guangdong Tartományi Reproduktív Orvostudományi Laboratórium, az első kapcsolt kórház, Sun Yat-sen Egyetem, Guangzhou, Kína

Csun-Hua Deng

7 Urológiai Tanszék, az első kapcsolt kórház, Sun Yat-sen Egyetem, Guangzhou, Kína

Absztrakt

BEVEZETÉS

A 65 évesnél idősebbek száma az elmúlt évszázadban több mint tízszeresére nőtt, és a jelenlegi demográfiai tendenciák szerint ez tovább fog növekedni.1 Az öregedő férfipopuláció gyors növekedése együtt jár az életkor növekedésével kapcsolatos betegségek, mint például szívbetegség, magas vérnyomás, rák, csontritkulás, jóindulatú prosztata hiperplázia és cukorbetegség. A későn megjelenő hipogonadizmus (LOH) szintén az egyik leggyakoribb korral járó betegség. Lunenfeld és mtsai ajánlásai szerint az LOH-t olyan klinikai és biokémiai szindrómaként határozzák meg, amely az életkor előrehaladtával társul, és amelyet hipogonadal tünetek (gyenge reggeli erekció, alacsony szexuális vágy és merevedési zavar) és a szérum tesztoszteronszintjének csökkenése jellemez (összesen tesztoszteron 11 nmol l −1 alatt és szabad tesztoszteron 220 pmol l −1 alatt). 2,3 A LOH-hoz számos egyéb tünet társul, többek között a zsírtömeg növekedése, az izomtömeg csökkenése, a fáradtság, az álmatlanság, a csont ásványi anyagsűrűség csökkenése és az oszteoporózis, gyenge koncentráció, feledékenység és depresszió. 4,5 A súlyos LOH-t még az összes ok és a kardiovaszkuláris halálozás lényegesen magasabb kockázatával is összefüggésben tartják.6 Tehát a LOH nagymértékben befolyásolja az öregedő férfiak életminőségét és egészségi állapotát.

Az elmúlt években a tesztoszteronpótló kezelést (TRT) széles körben alkalmazták LOH-val rendelkező férfiak számára, és a jelentések szerint hatékony terápia a fő tünetek enyhítésére és az életminőség javítására. 7,8,9 Az exogén tesztoszteron néhány mellékhatása azonban nem hagyható figyelmen kívül, mint a túlzott libidó és agresszió, erythropoiesis, májdaganatok, intrahepatikus kolesztázis, hepatotoxicitás, májelégtelenség és alvási apnoe.1 A TRT nem ajánlott mellrákban, prosztatarákban és alsó húgyúti tünetekben szenvedő férfiaknál, megnagyobbodott prosztata.10 A termékenység fenntartására vágyó férfiaknak nem ajánlott a TRT alkalmazása, mert az exogén tesztoszteron elnyomhatja a hipotalamusz-hipofízis-gonád tengelyt (HPG tengely), és meddőséget eredményezhet.10,11 Olyan módszer kidolgozása, amely kihasználja a A TRT a káros hatások elkerülése mellett sokkal jobb alternatíva lenne.

Tipikus állati drogként a bársony agancsot (VA) több mint 2000 éve használják a hagyományos kínai gyógyszerekben. Számos ország, például Kína, Japán és Korea, a szikaszarvasból és a gímszarvasból VA-t jelölte ki gyógyászati célra. 12 VA-t általában használják a szexuális működés javítására vagy az öregedési folyamat késleltetésére ezekben az országokban, és pozitív hatásait találták .13,14,15,16 Azonban kevés jelentés tárgyalta a VA mögöttes mechanizmusait. Számos tanulmány azt sugallta, hogy a bársony agancs-polipeptid (VAP) a VA aktív aktív összetevője. 17,18,19. A tanulmány célja annak felmérése volt, hogy a VAP javíthatja-e a tesztoszteron szintjét in vivo és javíthatja-e az öreg férfiak szexuális működését egerek. Ezenkívül teszteltük a tesztoszteron szintézis számos sebességkorlátozó enzimének expresszióját, beleértve a szteroidogén akut szabályozó fehérjét (StAR), a citokróm P450 koleszterin oldallánc hasítási enzimet (P450scc) és a 3β-hidroxi-szteroid dehidrogenázt (3β-HSD), hogy további erőfeszítések a VAP hatásmechanizmusának tisztázására ebben a folyamatban.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Etikai nyilatkozat

Az állat- és kísérleti protokollokat a Sun Yat-sen Egyetemi Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá. Minden állat emberséges gondozásban részesült, és minden erőfeszítést megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében. A kísérletek után eutanáziát végeztünk az állatokon CO2 belégzéssel.

Állatok

Az összes hím C57BL/6 egeret a Sun Yat-sen Egyetem Állatközpontjából (Guangzhou, Kína) vásároltuk, és 12 órás/12 órás éjszakai rendben tartottuk (világítás 19: 00-tól 07:00 h) állandó hőmérsékleten (22 ± 1 ° C) és páratartalomban (60%). Ezek az egerek körülbelül 24 hónaposak voltak, és kizárólag ketrecekben voltak elhelyezve. Körülbelül 3 hónapos nőstény egerek voltak, ketrecenként öten.

Minden hím egér szérumát összegyűjtöttük a retrobulbar térből, hogy lehetővé tegyük a szérum tesztoszteron mennyiségi meghatározását. Csak azokat fogadta el, akiknek a szérum tesztoszteron koncentrációja 8 ng ml -1 alatt volt, és véletlenszerűen négy különböző csoportba sorolták őket. Minden csoport 10 hím egeret tartalmazott.

A nőstény egereket stimulációs nőstényként használták a viselkedési tesztekben, és kettős petefészkekkel reszektálták őket. Az ovariectomia után egy hónappal minden nőstény egeret előkezeltek ösztradiol-benzoáttal (50 μg, 48 órával a vizsgálat előtt, feloldva 50 μl mogyoróolajban) és progeszteronnal (500 μg, 5 óra a vizsgálat előtt, feloldva 50 μl földimogyoróolajban). északi állapot.

Kábítószerek

A Cervus nippon Temminch-ből származó VA-t a Bei Jing Jiu Lu Deer Industry Breeding Co., Ltd.-hez (Kína) tartozó szarvastenyésztő bázison gyűjtötték be. A VAP-ot a VA Kémiai és Vegyészmérnöki Iskola izolálta a Dél-Kínai Műszaki Egyetemen. A VAP világos, sárga por volt, amelynek molekulatömege 3,2 kDa. A VAP fő összetevőjét korábban ábrázoltuk.12 Miután desztillált vízben oldottuk, a VAP-ot orálisan adtuk be öt egymást követő héten keresztül. Az egyik csoportot keményítővel kezelték kontrollcsoportként, a másik három csoportot pedig VAP-val kezelték különböző adagokban minden nap (100, 200 és 300 mg kg -1 nap -1).

A szexuális viselkedés tesztjei

A szexuális viselkedés vizsgálatát korábban leírták.20 A következő mérési célokat rögzítettük és pontoztuk: a felcsatolás, az intromisszió és az ejakuláció késleltetése; a felszerelés és az intromisszió gyakorisága; kopulációs hatékonyság (kiszámítva az intromissziós frekvencia osztva a beépítési frekvenciával + az intromissziós frekvenciával). A vizsgálatokat tiszta tesztketrecben (40 cm × 26 cm × 21 cm) végeztük, csendes környezetben. A hím egereket egyedileg a tesztketrecbe helyeztük előadaptáció céljából. 15 perc múlva egy előkezelt nőstény egeret helyeztek ugyanabba a tesztketrecbe. Ha 10 perc telt el intromisszió nélkül, akkor ezt a nőstény egeret egy másik előkezelt nőstény egérrel helyettesítettük. Ha a hím egér nem tudta elérni az intromissziót a második nőstény egérrel a következő 5 percen belül, akkor egy harmadik előkezelt nőstény egeret vezettünk be egy utolsó 15 perces időszakra. A teszt kezdetétől számított 15 percen belüli intromisszió és a 45 percen belüli magömlés elmaradása a teszt befejezését eredményezte, és ehhez a viselkedéshez a maximális 45 perces késleltetési értéket rendelték hozzá. Az összes szexuális viselkedési tesztet egy megfigyelő végezte, aki nem tudta, hogy ezek a hím egerek melyik csoportba tartoznak.

A test és a reproduktív szervek súlyozása

Huszonnégy órával az utolsó etetés után minden hím egeret először lemértek. Ezután az összes állatot éterrel altattuk, és vérmintákat nyertünk a vena cava-ból. A tesztoszteron mérésére szérumot választottunk el. Közvetlenül a vérminták összegyűjtése után kétoldali heréket, mellékvese-sejteket és szeminális vezikulákat nyertek és lemértek.

Tesztoszteron vizsgálatok

A szérum tesztoszteront az enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készlettel (R and D Systems, Minneapolis, MN, USA) határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően. Az intratestikuláris tesztoszteron (ITT) koncentrációit a korábban leírtak szerint vizsgáltuk.21 Röviden: az egyes egerekből nyert herezöveteket (50 mg) ultrahanggal (2 s × 20 s) foszfát pufferoldatban (PBS) homogenizáltuk, majd 10 000 g-vel centrifugáltuk. 10 percig. A felülúszók tesztoszteron-koncentrációit szintén meghatároztuk az ELISA kit alkalmazásával (R and D Systems, Minneapolis, MN, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. Az eredményeket ng g -1 szövetben fejeztük ki.

Immunfluoreszcens festés

Asztal 1

Az immunfluoreszcencia elemzéséhez használt primer és szekunder antitestek

Kvantitatív valós idejű PCR

A herékből származó teljes RNS-t RNeasy mini kit (Qiagen, Tokió, Japán) alkalmazásával extraháltuk a gyártó protokollja szerint. A reverz transzkripciós reakciókat egér leukémia vírus reverz transzkriptáz és oligo-dT primerek alkalmazásával hajtották végre (Fermentas, Litvánia). A valós idejű PCR-t a Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo, Oszaka, Japán) alkalmazásával végeztük a gyártó utasításainak betartásával. A jelek detektálására egy Light Cycler 480 detektáló rendszert (Roche, Basel, Svájc) használtunk. Belső kontrollként a β-aktin mRNS-t választottuk. A primer szekvenciák a következőképpen vannak felsorolva: 5-GGGCATACTCAACAACCAG-3 (felső primer) és 5-ACCTCCAGTCGGAACACC-3 (alsó primer) a STAR-hoz, 5-AGTATCCGTGATGTGGGG-3 (felső primer) és 5-CATACAGTGTCGCCTTTTC P450scc, 5-TGTGCCAGCCTTCATCTAC-3 (felső primer) és 5-CTTCTCGGCCATCCTTTT-3 (alsó alapozó) 3β-HSD-hez, és 5-TCGTGCGTGACATTAACGAG-3 (felső primer) és 5-ATTGCCTATCTATTGTG.

Statisztikai analízis

A több csoport összehasonlítására szolgáló egyirányú ANOVA-t használták a különbségek jelentőségének felmérésére. Az eredményeket átlag ± s.e.m. Minden esetben P 1. ábra . A szerelési késleltetés 200 mg kg −1 dózisnál lerövidült (P −1 (P −1 (P 0,05). A szerelés gyakoriságának összehasonlítása azt mutatta, hogy bár mindhárom kísérleti csoportnak volt emelkedõ tendenciája, csak a változás 200 mg-nál kg-1 statisztikailag magasabb volt, mint a kontrollnál (P-1 csoport és 300 mg kg-1-es csoport a kontroll csoporthoz képest (P-1 (P-1 (P-1 (P> 0,05)).

Felmerült, hogy a szív- és érrendszeri kockázat társult a TRT-hez. 52 A szív- és érrendszeri biztonság érdekében az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala (FDA) szigorú rendelkezéseket hozott a tesztoszteron termékek előállítása és értékesítése során, és sokuk ellen döntött. Korábban említettük, hogy a VA hasznosnak bizonyul a szívelégtelenség kezelésében.36 Adataink szerint valamennyi állat egészségi állapota tökéletes volt, és a kísérlet során nem észleltek mellékhatásokat, ami azt jelenti, hogy a VAP biztonságos. Úgy gondoljuk, hogy a VAP javíthatja az endogén tesztoszteront és javíthatja a szívbetegségeket. Ezért a VAP jó választás lehet a szív- és érrendszeri betegségekben szenvedő LOH-betegek számára.

Eredményeink szerint nem tapasztaltak nyilvánvaló dózisfüggő hatásokat, és a 200 mg kg −1 dózisnál jelentkező hatás tűnt a legszembetűnőbbnek. Ez a jelenség azt jelezte, hogy a VAP-nak optimális dózisa lehet a kezeléshez. Vizsgálatunknak vannak bizonyos korlátai. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a tesztoszteron szintézisét a HPG tengely modulálja. További vizsgálatokra van szükség annak megvizsgálására, hogy a VAP beadása befolyásolja-e a gonadotropint felszabadító hormon, a luteinizáló hormon és a tüszőstimuláló hormon felszabadulását. Ezenkívül a jelen vizsgálatban a minták száma viszonylag kicsi, ami befolyásolhatja a statisztikai tesztek erejét.

KÖVETKEZTETÉS

Eredményeink azt mutatják, hogy a VAP-nak fiziológiai szerepe van a tesztoszteron szintézisében azáltal, hogy fokozza a StAR, P450scc és 3β-HSD expresszióját az öregedő hím egerek heréjében. A VAP beadása biztonságos terápiás módszer lehet a LOH kezelésében, és további klinikai vizsgálatokat és biztonsági értékeléseket kell végrehajtani emberen.

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

A ZJZ megtervezte és elvégezte a kísérleteket, elemezte az adatokat, elkészítette a kéziratot és felügyelte a csapatot. A HFT segített a tanulmány megtervezésében, a kísérletek elvégzésében és a kézirat elkészítésében. Az YT és a WJX segített a kísérletek lebonyolításában. SYJ és YG segített az adatok elemzésében. A CHD megfogalmazta ennek a kutatásnak az ötletét. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a kézirat végleges változatát.

VERSENY ÉRDEKEK

A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekeik.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81302223 sz.) És a kínai Guangdong tartomány Orvosi Tudományos Kutatási Alapítványa (B2013104) támogatta.