A jakokból izolált probiotikumok javítják az egerek immunitásával és gyulladásával kapcsolatos növekedési teljesítményt, antioxidáns aktivitást és citokineket

Aoyun Li

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

Yaping Wang

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

Zhixing Li

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

Hammad Qamar

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

Khalid Mehmood

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

2 Állatorvosi és Állattudományi Egyetemi Főiskola, Bahawalpuri Iszlám Egyetem, Bahawalpur, 63100 Pakisztán

Lihong Zhang

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

Juanjuan Liu

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

Hui Zhang

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

Jiakui Li

1 Állatorvostudományi Főiskola, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, 430070 Kínai Népköztársaság

3 Állattenyésztési és Állatorvosi Főiskola, Tibeti Mezőgazdasági és Állattenyésztési Egyetem, Linzhi, 860000 Tibeti Kínai Népköztársaság

Társított adatok

Kérésre elérhető lesz.

Absztrakt

Háttér

A tibeti fennsík (3600 m) nagy magasságú hipoxiás környezetében élő jakoknak különleges bélmikrobák vannak. Mindazonáltal a jak probiotikumokkal kapcsolatos kutatások mindeddig kevések. Ezért vizsgálatunk célja a tibeti jakból izolált Bacillus subtilis és Bacillus velezensis növekedést elősegítő hatásának, antioxidáns képességének, immunhatásának és gyulladáscsökkentő képességének értékelése volt egérmodellben.

Eredmények

Az eredmények azt mutatták, hogy az izolált törzsek kiegészítése nem csak a növekedési teljesítményt javítja, hanem növeli a vékonybélben lévő villusok hosszát és a bél emésztési enzim aktivitását. Fontos, hogy megfigyeltük, hogy a probiotikummal kezelt egerekben a T-AOC, SOD és GSH-PX szintek emelkedtek, és az MDA tartalom csökkent, ami azt jelentette, hogy a probiotikumok kiegészítése enyhítheti az egerek antioxidatív aktivitását. Az AST és az ALT szintje korrelált a májkárosodással, és az AKP, TP, GLB, ALB, Ca és P szintje szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll csoportban. Ezenkívül a probiotikumokkal kezelt egerek magasabb szérum IgG-, IgM- és IgA-értéket mutattak, ami bizonyos mértékben tükrözheti az immunállapotot. Ugyanakkor a fő gyulladáscsökkentő faktor TNF-α, IL-6 és IL-8 szintje alacsony volt, az IL-10 gyulladásgátló faktor pedig a kontroll csoportokhoz képest.

Következtetések

Összefoglalva, ezek az eredmények bebizonyították, hogy a Bacillus subtilis és a Bacillus velezensis kiegészítés növelheti az általános növekedési teljesítményt és javíthatja az egerek gyulladásával és immunitásával kapcsolatos vérparamétereket.

Elektronikus kiegészítő anyag

A cikk online verziója (10.1186/s12934-019-1161-6) kiegészítő anyagot tartalmaz, amely az engedélyezett felhasználók számára elérhető.

Háttér

Köztudott, hogy az antibiotikumok döntő szerepet játszanak a bakteriális betegségek kezelésében és az állatok növekedési teljesítményében [1]. Számos tanulmány azonban kimutatta, hogy a zárt állatok takarmányozása során széles körben alkalmaznak antibiotikumokat, és ez az antibiotikumokkal szemben rezisztens baktériumok és a dysbacteriosis növekedését idézte elő az állatokban [2, 3]. A szimbiotikus baktériumok antibiotikum-rezisztens fenotípust mutathatnak gyakori antibiotikum-expozíció alatt, és végül az emberekbe is átjuthatnak. Ezenkívül az antibiotikumok válogatás nélküli felhasználása az állatállományban az élelmiszer-ellátási lánc révén nagy veszélyt jelent az emberek egészségi állapotára és az élelmiszer-biztonságra [4]. Korábbi kutatások kimutatták, hogy az állattenyésztésben számos probléma merült fel az antibiotikumok tiltásával egyes országokban, például a növekedési teljesítmény csökkenése és az eredetileg antibiotikumok által szabályozott betegségek kitörése [5]. Ezért a hasznos antibiotikum-alternatívák új osztályának kidolgozását várták. A probiotikumokat a gazdaszervezetre gyakorolt sokszoros jótékony hatásuk miatt napjainkig az antibiotikumok természetes helyettesítőinek tekintik, és a kutatók között nagy figyelmet keltettek [6].

A jakok a magaslati környezet ősi fajai, amelyekre jellemző az alacsony hőmérséklet és a hipoxiás körülmények alkalmazkodása. A statisztikák szerint a világ jakjainak 90% -a főleg Kína Szecsuán, Tibet és Csinghaj tartományban él [13]. Jakok teljes mértékben kihasználhatják a gyógynövény-erőforrásokat az alpesi területeken, és erősen alkalmazkodhatnak zord ökológiai környezeti körülményeikhez. Ezért a magassági hipoxia (alacsony nyomás és alacsony oxigén) jelentős nyomást gyakorolna az evolúciós szelekcióra [14, 15]. Korábbi tanulmány szignifikáns különbséget mutatott a bélmikrobiális közösségekben a nagy magasságban élő tibeti és az alsó szárazföldön élő kínai han között a jellegzetes életkörülmények és a táplálkozási szokások miatt [14]. Brigitta és Adak kutatások kimutatták, hogy az emberi bél mikrobiota összetétele megváltozhat, ha rövid időn belül nagy magasságnak vannak kitéve [16, 17]. Ez azt jelezte, hogy a jakokban különleges bélbaktériumok is lehetnek, a sima régióban élő állatokhoz képest. A jak bélmikroorganizmusairól azonban kevés jelentés készült, a jakokban található probiotikumokról pedig még kevesebb tanulmány készült.

Jelen tanulmányban a Bacillus subtilis két törzsének (BS1 és BS2 elnevezésű) és a jakból izolált Bacillus velezensisis (BV1 nevű) egy törzsének a növekedési teljesítményre, a szervi indexre, a vékonybél nyálkahártyájára, a bél emésztési képességére gyakorolt hatását kívántuk felmérni., antioxidáns kapacitás és az egerek immunindexei.

Mód

A probiotikumok kultúrája

Két jakac bélből izoláltunk két Bacillus subtilis törzset (BS1 és BS2) és egy Bacillus velezensis törzset (BV1), és ezeket konzerváltuk a kínai Huazhong Mezőgazdasági Egyetem (Wuhan, Kína) Állatorvosi Belgyógyászati Laboratóriumában. Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a BS1, BS2 és BV1 magas antibakteriális hatékonysággal rendelkezett a Staphylococcus aureus (ATCC 26112), az Escherichia coli (ATCC 25922) és a Salmonella enteritidis (NCTC 13349) ellen, és magas a sav- és az epesók toleranciája [18 ]. Ezenkívül antibiotikum rezisztencia kísérleteket, rezisztencia gén teszteket és hemolitikus kísérleteket végeztek a BS1, BS2 és BV1 törzsek biztonságosságának meghatározására. Korábbi eredményeink azt mutatták, hogy a BS1, BS2 és BV1 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciája alacsonyabb volt, rezisztencia gének és hemolízis nem volt megtalálható [18]. A biztonsági értékelés eredményei azt mutatták, hogy az izolált törzsek biztonságosak és felhasználhatók állatkísérletekben [18]. Három izolált törzset tenyésztettünk Luria – Bertani (LB) táptalajban, 37 ° C-on 24 órán át, aerob környezetben. Ezután a BS1, BS2 és BV1 életképes sejtek számát lemezt számláló módszerrel értékeltük. A baktérium-szuszpenziókat steril körülmények között gyűjtöttük össze, hogy orálisan beadhassuk az egereket.

Állatkísérlet

Tizenöt napos egészséges Kunming egereket (n = 72) vásároltunk a kínai Wuhan, Hubei tartomány állatkísérleti központjából. Az egereket véletlenszerűen felosztottuk a kontroll csoportba, a BS1-vel kezelt csoportba, a BS2-vel kezelt csoportba és a BV1-vel kezelt csoportba. Az egész kísérlet során az egereknek szabadon inni és etetni engedték. Ezenkívül a probiotikummal kezelt csoportokban az egereknek BS1, BS2 vagy BV1 szondát adtunk 1 × 109 CFU/nap sebességgel 21 egymást követő napon keresztül, és a kontroll egereknek ugyanolyan térfogatú sóoldatot kaptunk ugyanazzal a módszerrel. Mindegyik csoportban 18 egeret osztottak fel egyenlően 3 ismétlésre. Valamennyi egér (15–18 g) kezdeti súlya és tápanyagtartalma hasonló volt az étrendhez. Az egereket műanyag ketrecekben (375 mm × 273 mm × 165 mm) 21 napig tenyésztették. A kísérlet során a tenyésztési hőmérsékletet 20 és 24 ° C között tartottuk, a páratartalmat 53 és 57% között tartottuk, és a napi megvilágítást fényként 12, sötétben 12 órát végeztük. Ezenkívül naponta háromszor (8 óránként) feljegyezték étrendjüket, ivóvizüket és általános teljesítményüket, az elhullást, hasmenést, depressziót, fáradtságot, étvágytalanságot az egerek normális teljesítményének tekintették.

Minták gyűjtése és feldolgozása

21 napos etetés után az összes csoport egereit eutanizálták pentobarbitál (25 mg/kg) injekcióval. Ezt követően a máj, a vese, a belek (duodenum, jejunum és ileum) és a vérmintákat azonnal steril körülmények között gyűjtöttük a további vizsgálatok céljából. Ugyanakkor az egereket sebészi késsel boncoltuk a belső szervek és a bélminták megfigyelésére. Az összegyűjtött bélminták (duodenum, jejunum és ileum) körülbelül 2 cm-es részét, míg a májat, a vesét és a kockát (0,5 cm × 0,5 cm × 0,5 cm) vágott lépet 4% paraformaldehidben rögzítettük. Másrészt az összes rögzített mintát rutinszerűen dolgozták fel paraffinba ágyazással, és a szövettani metszeteket (4-5 µm) hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festették mikroszkópos vizsgálat céljából. A többi mintát további elemzés céljából -80 ° C-on tároltuk. A vérmintákat statikusan 1 órán át a centrifuga csőbe helyeztük. Ezután a mintákat 10 percig 3500 x g-vel centrifugáltuk 4 ° -os nagysebességű centrifugán (H2050R-1, Changsha, Kína), és a felülúszókat -80 ° C-on tároltuk ELISA és biokémiai elemzés céljából.

A termelés teljesítményének elemzése

Ebben a vizsgálatban az egereket meghatározott időpontokban és helyeken súlyozták. Ezenkívül az átlagos napi takarmányfelvételt (ADFI) és az átlagos napi súlygyarapodást (ADWG) rögzítették és kiszámították az egyes súlyozott csoportok felhasználásával. A takarmány-konverziós arányt (FCR) a következő képlettel számítottuk: F C R = ADFI ADG .

A vékonybél nyálkahártyájának morfológiai elemzése

A hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festett vékonybél szövettani metszeteinek morfológiáját invert mikroszkóppal (Olympus BX51, Japán) figyeltük meg, a bélbél hosszát és mélységét pedig képelemző programmal (Image-Pro Plus 6.1 Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Ezenkívül kiszámították a villus hosszának és a kripta mélységének arányát is.

Emésztőrendszeri aktivitás, antioxidáns indexek és biokémiai indexek

A májat és a vékonybelet steril 0,9% -os sóoldat hozzáadásával 10% (w/v) homogenizátumok előállításához homogenizáltuk, és a homogenizátumokat -80 ° C-on tároltuk a további vizsgálatokhoz. A máj antioxidáns indexeit, beleértve a T-AOC, MDA, GSH-PX és SOD, valamint a vékonybél emésztési enzim aktivitását, beleértve az α-amilázt és a tripszint, a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kína) kereskedelmi készletével mértük. Bár a probiotikumok kiegészítése jótékony hatással van a gazdaszervezetre, de egyes probiotikumok májkárosodáshoz és bakterémiához vezethetnek [19]. Ezért annak értékelésére, hogy a tibeti jakból izolált probiotikumok indukáltak-e májkárosodást, májindex-elemzést végeztek. Ezenkívül a májhoz (AKP, AST és ALT) és a szérumhoz (TP, GLB, ALB, Ca, P) kapcsolódó biokémiai indexeket is elvégezték a kereskedelmi készletek, amelyeket a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-ban (Nanjing, Kína). Az összes műveletet a gyártó protokolljai szerint hajtják végre.

Immunglobulinok és citokinek elemzése

A szérum immunglobulinokat, beleértve az IgG, IgM és IgA szinteket, valamint a citokineket, beleértve az IL-6, IL-8, IL-10 és TNF-α tartalmat, egérspecifikus ELISA kit (Colorful Gene Biological Technology, Wuhan, Kína) alkalmazásával számszerűsítettük. a gyártó utasításait. Az egyes minták OD (optikai sűrűség) értékeit a Thermo Scientific Microplate Reader készülékkel mértük 400 nm hullámhosszon.