A több forrásból származó kefirszemek és tej baktérium- és gombakompozíciójának szekvenciaalapú elemzése

Társulások Teagasc Élelmiszer-kutatási Központ, Moorepark, Fermoy, Írország, Alimentáris Gyógyszerészeti Központ, Cork Egyetemi Főiskola, Cork, Írország, Mikrobiológiai Tanszék, Cork Egyetemi Főiskola, Cork, Írország

Társulás Teagasc Food Research Center, Moorepark, Fermoy, Írország

Társadalmi táplálékkiegészítő gyógyszerközpont, Cork Egyetemi Főiskola, Cork, Írország, Mikrobiológiai Tanszék, Cork Egyetemi Főiskola, Cork, Írország

Társulások Teagasc Food Research Center, Moorepark, Fermoy, Írország, Táplálkozási Gyógyszerészeti Központ, Cork Egyetemi Főiskola, Cork, Írország

Társulások Teagasc Élelmiszer-kutatóközpont, Moorepark, Fermoy, Írország, Alimentáris Gyógyszerészeti Központ, Cork Egyetemi Főiskola, Cork, Írország

Alan J. Marsh,
Orla O’Sullivan,
Colin Hill,
R. Paul Ross,
Paul D. Cotter

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Marsh AJ, O’Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD (2013) Több forrásból származó kefirszemek és tejek bakteriális és gombás összetételének szekvenciaalapú elemzése. PLoS ONE 8 (7): e69371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371

Szerkesztő: Colin Dale, Utah Egyetem, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2013. március 24 .; Elfogadott: 2013. június 7 .; Közzétett: 2013. július 19

Finanszírozás: Az Alimental Pharmabiotic Center egy kutatási központ, amelyet az Science Science Ireland (SFI) finanszírozott az ír kormány nemzeti fejlesztési terve révén. A szerzőket és munkájukat az SFI CSET APC CSET 2 támogatás 07/CE/B1368 támogatása támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A kefir erjesztett tej alapú ital. Ez egy viszkózus, szénsavas, savas ital, amely alacsony alkoholtartalmat tartalmaz, és feltételezhetően mintegy 2000 évvel ezelőtt a kaukázusi hegységből származik. A tejet szilárd, karfiolszerű, kefirszemként ismert poliszacharid mátrix fermentálja, amelyet újrafelhasználják a későbbi fermentációk megkezdéséhez. A gabona elsősorban baktérium által előállított kefiránból áll [1], amely egy komplex baktériumok és élesztő konzorciumot tartalmaz, amelyek szimbiózisban dolgoznak a tej erjesztésében [2].

A fent említett vizsgálatok kétségtelen értéke ellenére a kultúrán alapuló elemzések korlátozottak, mivel csak olyan fajokat fedeznek fel, amelyek képesek növekedni az adott meghatározott táptalajon. Így a kultúrától független technikák pontosabb és mélyebb elemzést nyújthatnak. Bár kultúrától független technikákat, például Sanger-szekvenálást [12], [16], [20], [21] és DGGE [14], [15], [22] alkalmaztak a kefirpopuláció feltárására, a magas - az ilyen mikrobiális ökoszisztémák vizsgálatához szükséges DNS-szekvenálás különösen jelentős fejlemény. Ezt a stratégiát számos erjesztett étkezési környezet mikrobiális összetételének tanulmányozására alkalmazták, mint például sajt [23], [24], erjesztett hal [25], [26], erjesztett zöldség [27], rizskorpa [28] és gyöngy köles iszap [29]. Valójában a közelmúltban nagy áteresztőképességű DNS-szekvenálást is alkalmaztak, hogy átfogóbb képet kapjanak egy ír kefir szem és tej, valamint három brazil kefir szem baktérium populációjáról [30], [31].

A potenciálisan egészséget elősegítő populációk azonosításán kívül a kefirtermelés kereskedelmi forgalomba hozatala elősegítheti a kapcsolódó mikrobiális populációk részletes megértését. Szükség van továbbá ezen populációk sokféle szemcsén belüli heterogenitásának felmérésére, és különösen molekuláris megközelítések alkalmazásával a kapcsolódó élesztőpopulációk jobb jellemzésére. Ezen követelmények fényében a tanulmány célja az volt, hogy nagy áteresztőképességű szekvenálási technikákat alkalmazzon a különböző forrásokból nyert 25 különböző kefirszem és tej mikrobiális konzorciumának mélyreható elemzésére a földrajzi torzítás minimalizálása érdekében. ami befolyásolhatja a flórákat. Ez a tanulmány az első alkalom, amikor ezt a technológiát ilyen nagyszámú kefirmintára alkalmazták, és ez az első ilyen jellegű tanulmány, amely feltárja a kefir gombás összetevőjét.

Anyagok és metódusok

Kultúra fenntartása

9 ír kefirszemet rekultiváltunk -80 ° C-os tárolásból a Teagasc Culture Collection-en belül 10% -os feloldott fölözött tejben (RSM) fermentálva, amelyet 15 percig 115 ° C-on sterilizáltunk. Ezeket eredetileg országszerte háziasszonyoktól szerezték be [18], és e tanulmány céljából IR1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 és 10 jelölést kaptak. További 16 szemet nyertek egyéni és kereskedelmi beszállítókat számos helyről (S1. táblázat), és egységes körülmények között termesztették. Az Egyesült Királyságból származó mintákat UK1 – UK5, az Egyesült Államokból származó mintákat pedig US1, 2, 3 és 5 jelöléssel látták el. Az egyéb kefirszemeket Spanyolországból (Sp1), Franciaországból (Fr1), Olaszországból (It1), Kanadából (Ca1) ) és Németország (Ger1 és Ger2). A tenyészeteket szobahőmérsékleten tartottuk, és friss tejbe oltottuk be hetente háromszor, az extrakció előtt legalább 4 hónapig.

Metagenomikus DNS kivonás

100 ml 10% -os RSM-et oltottunk be 1 g kefir szemcsével, és 24 órán át 25 ° C-on fermentáltuk, amikor a kefirt leggyakrabban elkészítettük. A DNS kefirből való kivonásához 1,8 ml fermentált tejet centrifugálva egy pelletet állítunk elő, amelyet 450 ul P1 lízispufferben szuszpendálunk a Powerfood Microbial DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories Inc., USA) cégtől. Az újraszuszpendált üledéket mutanolizin (100 egység/ml) és lizozim (50 ug/ml) enzimekkel 37 ° C-on 1 órán át enzimatikus emésztésnek vetettük alá, majd 55 ° C-on 1 órán át proteáz-K (250 ug/ml) emésztést végeztünk. óra. Az extrakciót 10 perces 70 ° C-os inkubálással optimalizáltuk [40] a mechanikus lízis előtt, a Qiagen TissueLyser II (Retsch) alkalmazásával.®). Ezután a Powerfood mikrobiális DNS-izoláló készletet használtuk a gyártó utasításainak megfelelően. A tiszta DNS-t HPLC minőségű steril vízzel eluáltuk. A kefirszemekből származó DNS-t módosított fenol-kloroform-alapú extrakciós eljárással izoláltuk [22].

DNS-amplifikáció és piroszekvenálás

Piroszekvenáló adatok elemzése

Eredmények

A kefirtej bakteriális populációja következetesebb és kevésbé változatos, mint a megfelelő szemeké

A posztminőségű szűrés 23 gabona esetében 106 235 és 136 815 leolvasás, illetve a megfelelő 23 tejminta megmaradt, ami minden gabonaminta 4619 és tejmintánként 5949 leolvasás átlagának felel meg.

Kiszámítottuk a Chao1 értékeket (tükrözve az OTU/fajgazdagságot), Shannon és Simpson indexeket (a fajok sokféleségének meghatározásához), valamint a filogenetikai sokféleség és a megfigyelt fajok számát (S2. Táblázat). A 97% -os hasonlósággal számított retefrakciós görbék az összes tengellyel párhuzamosan közelítenek az x tengellyel, jelezve, hogy elegendő leolvasást sikerült elérni a populáció megfelelő értékeléséhez (S1. Ábra). A box-plot elemzés azt sugallja, hogy a kefirtej baktérium populációja általában kevésbé változatos, mint a kefirszemekben (S2. Ábra), ahol a tej mediánértéke (fekete sáv) minden mutatóban alacsonyabb volt, a Shannon kivételével index. Az egyetlen szignifikáns különbség a gabona és a tej között a filogenetikai sokféleségben mutatkozott (p 2 = 0,924, p = 0,644, 2A. Ábra). A kefir gabona közösségek közötti hasonlóságok nem azonosak a kefir közösségek hasonlóságaival.

Zöld = ír kefir, narancs = belga kefir, világosbarna = spanyol kefir, piros = német kefir, szürke = amerikai kefir, rózsaszín = olasz kefir és lila = Egyesült Királyság kefir.

A két különböző mintatípus összekapcsolódik egy oszloppal (a fehér szemes flórát, a piros pedig a tej flórát jelöli). Az egyes tengelyek iránya tetszőleges.

A kefirtejek és -szemek gombapopulációinak alfa-sokfélesége változó, de a kefirszemek béta-sokfélesége nagyobb, mint a tejé

A posztminőségi szűrés összesen 118 879 és 118 976 leolvasást eredményezett, amelyek 23 gabona és a megfelelő 23 tej populációnak felelnek meg. Ez egy gabona- és tejmintánként átlagosan 5 167, illetve 5 173 olvasási számnak felel meg.

Az alfa diverzitás értékek megállapították, hogy a kefir szemekben és tejekben természetesen alacsony a diverzitás (S3. Táblázat). A Chao1, a megfigyelt fajok és a filogenetikai sokféleség indexek box-plot elemzése azt sugallja, hogy a kefirtejben a diverzitás nagyobb, mint a szemekben (S3. Ábra). A kettő közötti statisztikai különbség azonban a filogenetikai sokféleségre korlátozódott (p 2 = 0,855, p = 0,139, 2B ábra).

A kefirszemeket és a társult kefirrel erjesztett tejeket viszonylag kevés baktériumnemzetség uralja

Az ITS szekvenálás részletes betekintést nyújt a kefirszemek és társult kefirrel erjesztett tej gombás összetételébe

A gabonában egyetlen gombatörzs volt Ascomycota, a gomba királyságának legnagyobb menedékhelye. Kimutatták, hogy az ascomycota dominál a kefirtejben, a Ger1 100% -ától a magasig, az Ir10 89,38% -áig (S6. Táblázat; S7. Táblázat). A Basidiomycota-t, a Dikarya alkategóriába tartozó másik törzset 9 tejmintában találták, viszonylag alacsony olvasási szám mellett. A tejminták közül 9 tartalmaz nyomokban tenyésztetlen gombákat is. A gabona alacsonyabb diverzitása ismét családi szinten nyilvánvaló, ahol egy kivételével az összes minta (Sp1)> 99% Saccharomycetaceae-t tartalmaz. A Saccharomycetaceae átlagos átlagos aránya a tejben szignifikánsan alacsonyabb (a 23 mintából 16-ban az olvasások 99% -a. Az Sp1 kefirtej gombás összetétele szokatlan volt, mivel 34,27% Pichiaceae-t tartalmazott. Ezzel szemben a következő legnagyobb arány A Pichiaceae 0,48% volt (az UK3 tejben). A kefirtejekben és szemekben egyaránt kimutatott gombacsaládok voltak a Davidiellaceae és a Trichocomaceae. Herpotrichiellaceae, Teratosphaeriaceae, Valsaceae, Debaryomycetaceae, Phaffomycetaceaaceaaceaaceaceaaceaceae, Malacezaceae, Malasseziacea. Ezenkívül a Wallemiomycetákat csak a tejekben, míg a Dothioraceae-t csak a szemekben.

Ellentétben a 16S-olvasásokkal, amelyeknek magas szintű szekvencia-homológiája van, az ITS-olvasások eléggé különböznek egymástól ahhoz, hogy lehetővé tegyék a fajokhoz való hozzárendelést. Az 1. táblázat bemutatja az azonosított különféle fajok teljes számát és azt, hogy volt-e összefüggés a kefirrel. A populáció profilja faji szinten erősen tükrözi ezt a nemzetség szintjén. A legelterjedtebb faj, a Kazachstania unispora 20 szemben és minden tejben volt jelen. A Kluyveromyces és a Naumovozyma nemzetség összes olvasatát a Kluyveromyces marxianus és a Naumovozyma castelli fajokhoz rendeltük (S6. Táblázat; S7. Táblázat). Noha a Saccharomyces nemzetséget kis mennyiségben azonosították számos szem és tej esetében, faji szinten csak az Ir5-ben levőket azonosították fajokhoz (Saccharomyces cerevisiae-hez).