A kínai Chai Hu Li Zhong Tang gyógyszer az AMPKα aktiválásával véd az alkoholmentes zsírmájbetegségektől

Meng Zhang, Yuan Yuan, Qing Wang, Xiaobo Li, Jiuzhang Men, Mingxin Lin; A kínai Chai Hu Li Zhong Tang gyógyszer az AMPKα aktiválásával véd az alkoholmentes zsírmájbetegségektől. Biosci Rep 2018. december 21 .; 38 (6): BSR20180644. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20180644

Hivatkozási fájl letöltése:

Bevezetés

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) egy olyan klinikai szindróma, amelyet hepatocelluláris steatosis, sejtkárosodás és gyulladásos sejtek beszivárgása jellemez a túlzott alkoholfogyasztás nélkül szenvedő egyének májszöveteiben [1,2]. Epidemiológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy a NAFLD prevalenciája meghaladta a vírusos hepatitis és az alkoholos májbetegség (ALD) előfordulását, így a világ leggyakrabban diagnosztizált orvosi és szociális problémája [3]. A nyugati országokban a NAFLD prevalenciája most 2-3-szor magasabb, mint a hepatitis B, a hepatitis C és az ALD. Japánban a NAFLD előfordulása 3–20-szorosára nőtt, és mára meghaladja a hepatitis C előfordulását. A NAFLD korai klinikai megnyilvánulása főleg egyszerű zsírmáj, amelyet máj steatosis és trigliceridek (TG) felhalmozódása jellemez. májszövet [4,5].

Bár a NAFLD patogenezise továbbra sem tisztázott, számos tényező vezethet annak előfordulásához és fejlődéséhez [6,7], beleértve a lipid anyagcsere rendellenességeit, az inzulinrezisztenciát, az oxigén szabad gyököket, a vas túlterhelését és a gyulladást [8,9]. A máj steatosisának fő oka a májszövet túlzott tápanyagfelvétele. Bár a máj képes valamilyen tápanyagból származó energiát tárolni, a túlzott tápanyag sértetlenül felgyorsítja a májszövetekben felhalmozódó zsírsavak és TG-k termelését [6,10]. Ezután az oxidatív stressz, a lipidperoxidáció és a gyulladásos citokinek mind segítenek a máj nekrózisának, gyulladásának és fibrózisának közvetítésében [4].

Az adenilát-aktivált protein-kináz (AMPK) fontos tényező, amely szabályozza az intracelluláris energia-anyagcserét [11]. Úgy szabályozhatja a test energia-anyagcseréjét, hogy érzékeli az AMP és az ATP arányának változását a citoplazmában, majd elősegíti a megfelelő energiaellátás fenntartását a keresleti egyensúlyhoz képest [12,13]. Amikor az AMPK szignálmolekulák aktiválódnak, a zsírsav- és a TG-metabolizmusban szerepet játszó különféle utak kikapcsolódnak, és aktiválódnak a zsírsav-oxidációban, a glükózfelvételben és a glikolízisben részt vevő metabolikus utak [14,15].

Korábbi vizsgálatok megerősítették, hogy az AMPK szignálmolekulák kulcsszerepet játszanak a máj lipidanyagcseréjében [12]. Két AMPK célfehérje létezik: acetil-koenzim A karboxiláz (ACC) és 3-hidroxil-3-metilglutaril-koenzim A koenzim A reduktáz (HMGR). Az ACC és a HMGR egyaránt fontos szerepet játszik a zsírsavak és a koleszterin (TC) szintézisében [16]. Az AMPK foszforilezése gátolja az ACC aktivitást és csökkenti a májsejtekben a malonil-CoA szintjét, ezáltal gátolja a zsírsavak szintézisét, és fokozza azok hasznosulását és oxidációját. Ezek a hatások végül a TC és a zsírsavak szintézisének gátlását szolgálják a májban [17]. Számos tanulmány megerősítette, hogy a PPAR-γ és az SREBP-k, mint például az SREBP2, fontos szerepet játszanak az állatok lipid homeosztázisának fenntartásában [18].

A Chai Hu Li Zhong Tang (CHLZT) hagyományos kínai gyógynövény Xiao Chai Hu Tang és Li Zhong Tang alkotja. Tanulmányok kimutatták, hogy Xiao Chai Hu Tang hatékonyan csökkenti a testzsírt és a testsúlyt [19–21]; hasznossága és hatásmechanizmusa a NAFLD kezelésében azonban továbbra sem tisztázott. Jelen tanulmányban a NAFLD patkánymodelljét hoztuk létre magas zsírtartalmú étrend etetésével. Megállapítottuk a NAFLD sejtmodelljét is a HepG2 sejtek magas zsírtartalmú táptalajon történő tenyésztésével. Ezután ezeket a modelleket használtuk annak megvizsgálására, hogy a CHLZT hasznos lehet-e a NAFLD kezelésében, valamint hatásait az AMPK, PPAR-γ és SREBP2 jelátvitelre.

Anyagok és metódusok

A CHLZT standardizált elkészítése

A kiindulási gyógyászati anyagok: Bupleurum (6 g), Scutellaria (6 g), gyömbér Pinellia (9 g), Codonopsis (9 g), Atractylodes (12 g), Poria (15 g), kurkuma (6 g), Zhigancao (6) g), gyömbért (9 g) és jujube-t (9 g) az Orvostudományi Intézet szakemberei azonosították, majd ellenőrizték sajátos törzsüket, eredetüket és minőségüket. Ezek az őshonos gyógyszerek nem tartalmaznak nehézfémeket. A gyógynövényeket kétszer alaposan megtisztítottuk ötszörös térfogatú csapvízben, majd 30 percig tízszeres térfogatú desztillált vízben áztattuk. Ezután 1 óra hosszat főzték 700 watt hő mellett; ezután a vizet szűréssel eltávolítottuk. A maradékot ezután másodszor főztük ugyanazon a hőmérsékleten 40 percig; ezután hatszoros térfogatú vizet adunk hozzá, és a maradékot ismét 40 percig főzzük. A szűrleteket ezután egyesítjük és 700 watt hőhevítéssel bepároljuk. ez olyan folyadékot eredményez, amely ml-ben 1 g nyersanyagot tartalmaz. A folyadékot sterilen csomagolták és felhasználásra előkészítették.

Állatkísérletek

Egészséges SPF hím SD patkányokat a Southern Medical University Kísérleti Állatközpontjából nyertünk, és négy csoportba soroltuk őket: egy normál csoportba, egy NAFLD csoportba, egy CHLZT kezelési csoportba és egy AMPK agonista AICAR kezelő csoportba (n = 10 patkány csoportonként). A NAFLD patkánymodell megalkotásához a patkányokat magas zsírtartalmú étrenddel (88% közönséges takarmány + 2% TC + 10% sertészsír) etették 8 hétig az adaptív etetés után 1 hétig. A normál csoportba tartozó patkányokat normál étrenddel etették. A CHLZT csoportba tartozó patkányok napi intragasztrális CHLZT-t kaptak (3,5 ml/nap), és magas zsírtartalmú étrendet kaptak a vizsgálat 9. és 12. hetétől. Az AICAR kezelési csoportba tartozó patkányok napi intraperitoneális AICAR injekciót kaptak (25 mg/kg/nap), amelyet először DMSO-ban készítettek, majd steril sóoldattal hígítottak a kívánt koncentrációig. Ezeket a patkányokat magas zsírtartalmú étrenddel is ellátták [22,23]. 12 hét elteltével az összes patkányt méhnyak elmozdulásával leöltük, és vérüket és májszöveteiket összegyűjtöttük. A vizsgálati protokollt a Shanxi Kínai Orvostudományi Egyetem intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá.

A TC, TG, alacsony sűrűségű lipoprotein-koleszterin, nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterin, alanin-aminotranszferáz és aszpartát-aminotranszferáz szintje

8 hét folyamatos kezelés után a patkányokat 12 órán keresztül éheztettük, majd mindegyik patkány hasi aortájából vért vettünk, és a szérumot elválasztottuk elemzés céljából. A szérum TC, TG, alacsony sűrűségű lipoprotein-koleszterin (LDL-C), nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterin (HDL-C), alanin-aminotranszferáz (ALT) és aszpartát-aminotranszferáz (AST) szintje minden csoportban öt véletlenszerűen kiválasztott patkányban (mások ELISA-hoz) automatikus biokémiai analizátorral detektáltuk.

Sejtkultúra és kezelés

A HepG2 sejteket (ATCC, Manassas, VA, USA) 79% Dulbecco módosított Eagle táptalajban (DMEM, 10569044, Gibco, Waltham, MA, USA) tenyésztettük, amely 20% FBS-t (10099-141, Gibco) és 1% penicillint tartalmazott. sztreptomicin (100 E/ml, 15140-122, Gibco) [24]. A HepG2 sejtek egyéb csoportjait 1% hosszú láncú zsíremulziót tartalmazó táptalajban (0338-0519-48, Intralipid® 20%, Baxter, Deerfield, IL, USA) 48 órán át tenyésztettük; ezeket a sejteket használták fel a NAFLD sejtmodell felépítéséhez [25]. Ezután a sejteket vagy CHLZT-tartalmú szérummal (definiálva: S-vegyület), vagy AICAR-tartalmú szérummal (definiálva: AICAR-S) kezeljük 20% -os végkoncentrációban. A kontroll sejteket normál FBS-sel inkubáltuk (20%).

Olajvörös O festés

A májszövet darabjait elválasztottuk és folyékony nitrogénben -80 ° C-on tároltuk. A szövetrészeket és a HepG2 sejtek alikvot részeit háromszor PBS-sel mostuk, majd 10% -os formaldehiddel rögzítettük 1 órán át szobahőmérsékleten. Ezután a szövetmetszeteket és a sejteket 30 percig Oil Red O-val inkubáltuk, háromszor öblítettük desztillált vízzel, majd fordított mikroszkóp alatt figyeltük meg. Az Oil Red O festés mennyiségének meghatározásához ImagePro Plus 7 szoftvert (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA) használtunk.

Immunhisztokémia

ELISA

A kezelés után a HMGR és az inzulin szintjét ELISA készletekkel (Elabscience, Houston, TX, USA) vizsgáltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Miután biotinilezett antitesttel (100 μl/üreg) inkubáltuk 1 órán át 37 ° C-on, a tenyésztő lemezeket ötször PBS-sel mostuk, a megfelelő enzim szubsztráttal 37 ° C-on 30 percig inkubáltuk, majd sötétben inkubáltuk. kromogén szubsztráttal (3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB)) 15 percig. A festési reakciókat 100 μl STOP oldattal leállítottuk. Minden egyes lyuk optikai sűrűségét 450 nm-en mikrolemez-leolvasóval leolvastuk.

qRT-PCR

A kezelés után a csontvelőből származó makrofágokban (BMM) lévő teljes RNS-t TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával izoláltuk egy szokásos protokoll szerint. Az RT-qPCR-t SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara, Shiga, Japán) és valós idejű PCR rendszer (Real Applied Biosystems, Applied Biosystems, Santa Clara, CA, USA) felhasználásával végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. Az alkalmazott primereket az 1. táblázatban mutatjuk be. Az összes vizsgálatot három példányban hajtottuk végre. A génexpressziót normalizáltuk a GAPDH expresszióhoz, és a 2 -ΔΔC t módszerrel számítottuk.

Gene. Előre szekvencia (3′ – 5 ′). Fordított sorrend (3′ – 5 ′) .

Patkány-PPARy	TACCACGGTTGATTTCTCCA	TGAGGGAGTTTGAAGGCTCT
Patkány-SREBP-2	GGGACATCGACGAGATGCTA	AATGGGACCTGGCTGAATGA
Patkány-GAPDH	CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT	GGGTAGAGTCATACTGGAACATG
Humán-PPARy	ACCAAAGTGCAATCAAAGTGGA	ATGAGGGAGTTGGAAGGCTCT
Humán-SREBP-2	CCTGGGAGACATCGACGAGAT	TGAATGACCGTTGCACTGAAG
Ember-GAPDH	TGTTCGTCATGGGTGTGAAC	ATGGCATGGACTGTGGTCAT

Gene. Előre szekvencia (3′ – 5 ′). Fordított sorrend (3′ – 5 ′) .

Patkány-PPARy	TACCACGGTTGATTTCTCCA	TGAGGGAGTTTGAAGGCTCT
Patkány-SREBP-2	GGGACATCGACGAGATGCTA	AATGGGACCTGGCTGAATGA
Patkány-GAPDH	CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT	GGGTAGAGTCATACTGGAACATG
Humán-PPARy	ACCAAAGTGCAATCAAAGTGGA	ATGAGGGAGTTGGAAGGCTCT
Humán-SREBP-2	CCTGGGAGACATCGACGAGAT	TGAATGACCGTTGCACTGAAG
Ember-GAPDH	TGTTCGTCATGGGTGTGAAC	ATGGCATGGACTGTGGTCAT

Western blot vizsgálatok

A májszövetek összes fehérjét (négy patkányt véletlenszerűen választottak ki az egyes csoportokból) és a sejteket BMM-ekből extraháltuk RIPA lízispuffer segítségével, majd Pierce BCA Protein Assay Kit-rel (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) számszerűsítettük. A fehérjéket 10% SDS/PAGE-val elválasztottuk, majd egy nitrocellulóz membránra vittük át, amelyet 5% sovány tejjel blokkoltunk. Ezután a membránt inkubáltuk olyan primer antitestekkel, amelyek anti-AMPK, anti-p-AMPK, anti-ACC, anti-p-ACC, anti-PPARγ és anti-SREPBP-2 (Abcam, USA) éjszakán át 4 ° C-on inkubálták., majd HRP-konjugált szekunder antitesttel (Bioworld, Kína) inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten. Az immunfestett fehérjéket ECL-Plus reagenssel (Millipore, Billerica, MA, USA) tettük láthatóvá.

Statisztikai analízis

A modell és a CHLZT csoport inzulinszintje szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll csoporté (1G ábra). A CHLZT vagy AICAR kezelés szignifikánsan csökkentette az inzulinszintet a modellcsoport inzulinszintjéhez képest (1G ábra). Összefoglalva, a CHLZT vagy AICAR kezelés csökkentette a TG, TC, LDL-C, AST, ALT és inzulin szérumszintjét a NAFLD patkányokban, és jelentősen megnövelte HDL-C szérum szintjüket, ami arra utal, hogy a CHLZT és az AICAR szolgálhat a védelemben NAFLD patkányok.

A NAFLD patkányok májának zsírtartalma csökkent a CHLZT kezelés után

A zsír eloszlását a patkány májmintáiban olajvörös O festés után figyelték meg (2A. Ábra). A májszövetekben lévő lipidcseppeket vörösre festették és eloszlották a sejtek citoplazmájában. A kontroll patkányok májszakaszai lényegesen kevesebb zsírcseppet tartalmaztak, mint a modell patkányok máj szakaszai. A CHLZT vagy AICAR kezelés szignifikánsan csökkentette a lipidcseppek számát a NAFLD modell patkányokban.

Zsíros anyagok és p-AMPKα immunhisztokémiai festése a májszövetekben

A CHLZT indukálta az AMPKα foszforilációját NAFLD patkányokban

A p-AMPKα immunhisztokémiai (IHC) festését végeztük, hogy feltárjuk az AMPKα szerepét CHLZT-vel kezelt NAFLD patkányokban (2B. Ábra). A p-AMPKα pozitív májszöveti minták barna színt mutattak az egész citoplazmában. A kontroll minták p-AMPKα festésével összehasonlítva a modellcsoportból származó mintákban a p-AMPKα festés mennyisége jelentősen csökkent. Ez azt jelezte, hogy a CHLZT és az AICAR kezelés jelentősen megnövelte a p-AMPKα mennyiségét a NAFLD modell patkányok májszövetében.

A CHLZT indukálta a p-AMPKα és a PPARγ expresszióját, de gátolta az ACC-α, p-ACC-α, SREBP-2 és HMGR expresszióját NAFLD patkányokban

Az AMPKα downstream jelátvitelének kimutatásához patkányokban detektálták a PPARγ, ACC-a, p-ACC-a és SREBP-2 szintjét. A p-AMPKα IHC festésének eredményeivel összhangban a p-AMPKα szintje a modellcsoportban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll csoporté. A CHLZT vagy AICAR kezelések szignifikánsan megnövelték a p-AMPKα szintjét a NAFLD modell patkányokban (3A. Ábra). Ezenkívül az ACC-α és p-ACC-α szintje a modell patkányokban szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll patkányokban. A CHLZT vagy AICAR kezelések szignifikánsan csökkentették az ACC-α és p-ACC-α szintet a NAFLD modell patkányokban (3A. Ábra). A kontroll patkányok szintjéhez viszonyítva a PPARγ mRNS és a fehérje szintje szignifikánsan csökkent a modell patkányokban. A CHLZT vagy AICAR kezelések szignifikánsan csökkentették a PPARγ mRNS és fehérje szintjét a NAFLD modell patkányokban (3A, B ábra). Az SREBP-2 mRNS és fehérje szintje a modell patkányokban szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll patkányokban. A CHLZT vagy AICAR kezelések szignifikánsan megnövelték a PPARγ mRNS és a fehérje szintjét a NAFLD modell patkányokban (3A, B ábra). A HMGR-szintek a modell patkányokban szignifikánsan magasabbak voltak, mint a kontroll patkányokban (3C. Ábra). A CHLZT vagy AICAR kezelések szignifikánsan csökkentették a HMGR szintet a NAFLD modell patkányokban.

AMPKα, p-AMPKα, PPARγ, ACC-α, p-ACC-α, SREBP-2 és HMGR expressziója a májszövetekben

A CHLZT gátolta a lipidek aggregációját, de kiváltotta az AMPKα foszforilációját a NAFLD sejtekben

A HepG2 májsejteket hosszú láncú zsíremulziót tartalmazó táptalajban tenyésztettük a NAFLD sejtmodell létrehozása érdekében. Miután a NAFLD modellsejteket CHLZT-tartalmú szérummal vagy AICAR-tal kezeltük, az Oil Red O festés azt mutatta, hogy ezek a kezelések gátolták a lipid aggregációt a sejt citoplazmájában (4A. Ábra). Az AMPKα foszforilációját a sejtekben immunfluoreszcens festéssel detektáltuk (4B. Ábra). CHLZT-tartalmú szérummal vagy AICAR-val végzett kezelés a citoplazmatikus AMPKα foszforilációját indukálta.

A CHLZT-t tartalmazó szérum hatása az AMPKα lipid aggregációjára és foszforilációjára a NAFLD sejtekben

A CHLZT indukálta a p-AMPKα és a PPARγ expresszióját, de gátolta az ACC-α, p-ACC-α, SREBP-2 és HMGR expresszióját a NAFLD sejtekben

A PPARγ, ACC-a, p-ACC-a és SREBP-2 szintjét a NAFLD sejtekben is kimutattuk (5A. Ábra). A kontrollsejtekben mért szintjükhöz képest a p-AMPKα és a PPARy szintje jelentősen megnőtt a CHLZT-tartalmú szérummal vagy AICAR-tal kezelt sejtekben. Az ACC-α és p-ACC-α szinteket jelentősen csökkentették CHLZT-tartalmú szérummal vagy AICAR-mal végzett kezelések (5A. Ábra). Ezenkívül a PPARγ mRNS és a fehérje szintjét jelentősen megnövelték a CHLZT-tartalmú szérum- és AICAR-kezelések, míg az SREBP-2 mRNS és fehérje szintjei jelentősen csökkentek ezek a kezelések (5A, B ábra). A CHLZT vagy AICAR kezelések szintén jelentősen csökkentették a HMGR szintjét a NAFLD modellsejtekben (5C. Ábra).

AMPKα, p-AMPKα, PPARγ, ACC-α, p-ACC-α, SREBP-2 és HMGR expressziója NAFLD sejtekben

Vita

A CHLZT kínai gyógyszer hatékonyan védett a NAFLD ellen

Vázlatos ábra, amely bemutatja, hogy a kínai CHLZT gyógyszer hogyan csökkenti a lipidszintet a NAFLD-ben azáltal, hogy fokozza a PPARγ expressziót, elősegíti az AMPKα foszforilációját, és gátolja az SREBP-2 expresszióját, az ACC-α foszforilációját és a HMGR aktivitását.

Vázlatos diagram, amely bemutatja, hogy a kínai CHLZT gyógyszer hogyan csökkenti a lipidszintet a NAFLD-ben azáltal, hogy fokozza a PPARγ expressziót, elősegíti az AMPKα foszforilezését, és gátolja az SREBP-2 expresszióját, az ACC-α foszforilációját és a HMGR aktivitást.

A PPAR-y csökkenti az inzulinrezisztenciát az inzulinérzékenység szabályozásával és az adiponektin szintézisének elősegítésével [39,40]. A zsírsav-oxidációban kulcsfontosságú enzimként a PPAR-γ szabályozza a zsírsav-anyagcsere minden aspektusát, és elősegíti a szabad zsírsavak felvételét és a TG-k tárolását [41]. Ezenkívül a PPAR-y adipocita differenciálódást indukál, és expressziója növekszik az adipociták differenciálódásával [42]. Megállapítottuk, hogy a CHLZT növelte a PPAR-γ szintet, ami hozzájárulhat az adipociták differenciálódásához. Számos tanulmány megerősítette, hogy az SREBP-k, mint például az SREBP2, nemcsak fontos szerepet játszanak a zsírsav-anyagcsere szabályozásában, hanem segítenek az autofágia diszfunkciójának enyhítésében és részt vesznek a TC, a foszfolipidek és más anyagok szintézisében és felszívódásában, hogy fenntartsák állatok lipidjeinek homeosztázisa [43]. Megállapítottuk, hogy a CHLZT csökkentette az SREBP2 szintet a NAFLD májszövetekben és sejtekben.

Összegzésképpen elmondható, hogy a CHLZT az AMPKα aktiválásával, az ACC aktivitás gátlásával, az SREBP2 és HMGR lefelé szabályozásával és a PPAR-y felfelé szabályozásával véd a NAFLD ellen. Eredményeink hozzájárulhatnak a NAFLD-ben szenvedő betegek klinikai eredményeinek javításához.

Finanszírozás

Ezt a munkát a kínai Shanxi tartomány kulcsfontosságú kutatási és fejlesztési programja támogatta [támogatás száma 201603D3113021].

Versenyző érdekek

A szerzők kijelentik, hogy a kézirathoz nincsenek versengő érdekek fűződve.