A LINC00116 egy mitokondriális peptidet kódol, amely összeköti a légzést és a lipid anyagcserét

  • Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
  • Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
  • Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
  • Levelezés céljából: mikhail.vyssokikh @ gmail.competya @ genebee.msu.ru

Szerkesztette Igor Ulitsky, a Weizmann Tudományos Intézet, és elfogadta David J. Mangelsdorf szerkesztőségi tag 2019. január 28-án (beérkezett felülvizsgálatra 2018. június 7-én)

kódol

Jelentőség

A rövid peptideket minden organizmus genomjában kódolják, és fontos funkcióik vannak. Az ilyen nyitott olvasókeretek kis mérete miatt az automatikus genom annotáció gyakran figyelmen kívül hagyja őket. Megvizsgáltuk azt a gént, amelyet hibásan jelöltek meg hosszú, nem kódoló RNS LINC00116-ként, és kimutattuk, hogy ez a gén egy 56 aminosav hosszú peptidet, az Mtln-t kódolja, amely a mitokondriumokban lokalizálódik. Az Mtln kódoló gén inaktiválása az oxigénfogyasztás csökkenéséhez vezet, ami az I. légzési komplex aktivitásának tulajdonítható, és zavarja a sejt lipidösszetételét. Ezt a hatást az NtH-függő citokróm b5 reduktázzal való Mtln kölcsönhatás közvetíti. Ez utóbbi fenokópiák mitokondriális lokalizációjának megzavarása Mtln inaktiváció.

Absztrakt

A kis peptideket kódoló géneket gyakran helytelenül írták le hosszú nem kódoló RNS (lncRNS) génekként. Itt bebizonyítottuk, hogy egy ilyen transzkriptum 56 aminosav hosszúságú peptiddé alakul át akkordokban konzerválva, ami megerősíti a publikált munkát, miközben ez a kézirat felülvizsgálat alatt állt. Az Mtln peptid kimutatható volt az egérsejtvonalak és szövetek mitokondriumaiban. Mitokondriális lokalizációjával összhangban az Mtln hiánya csökkenti az I. mitokondriális légzési lánc komplex aktivitását. Az NADH: ubikinon-oxidoreduktáz integrált komponenseitől és szerelési tényezőitől eltérően az Mtln nem változtatja meg közvetlenül enzimatikus aktivitását. Az Mtln és NADH-függő citokróm b5 reduktáz kölcsönhatása stimulálja az I komplex működését, valószínűleg a membrán kedvező lipidösszetételének biztosításával. Az Mtln vizsgálata rávilágít a kis peptidek fontosságára, amelyek génjeit gyakran helytelenül írhatjuk le lncRNS-ként, a létfontosságú sejtes folyamatok szabályozásában.

Számos kis peptid lokalizálódik a mitokondriumokban, egy olyan organellumban, amelynek fő funkciói az ATP termeléssel párosuló légzés, a Ca 2+ homeosztázis, a sejt redoxpotenciál fenntartása, a szteroidok, a hem, a FeS klaszterek szintézise, ​​az apoptózis indukciója és még sokan mások, végül kontrollálva a sejtek sorsa és a szövetek funkcionális integritása (15). Az emlős mitokondriális proteomja több mint 1100 fehérjéből áll (16), ennek a számnak 5% -a kicsi, kevesebb mint 100 aminosav hosszúságú fehérje (17). Mind a mitokondriális (18, 19), mind a nukleáris genom kódolja a rövid mitokondriális peptideket, amelyek az oxidatív foszforilációs (OXPHOS) komplexek (17) vagy ezek összeállítási tényezőinek (20) szerves komponensei, és jelentős szerepet játszanak a hosszú élettartamban (21), az inzulinrezisztenciában (19) és az apoptózis modulációja (18). A mitokondriumokban élő kis peptideket kódoló gének mutációi kóros kimenetelűek lehetnek, például mitokondriális encephalomyopathiák (22) és Leigh-kór (23).

Itt egy egér peptidet írunk le, amelyet 1500011k16Rik lncRNS-ként hibásan megnevezett génben kódolunk, amely megfelel a humán LINC00116-nak. A peptid mitokondriumokban tartózkodik, és fontos az I. légzési lánc komplex aktivitása szempontjából. Miután a konferencián elsõ beszámolót tettünk ennek a peptidnek a funkciójáról (24), és miközben ezt a kéziratot áttekintették, két csoport hasonló következtetéseket tett közzé a ez a peptid (25, 26), Mitoregulin, Mtln.

Eredmények

A 1500011k16Rik kódolási potenciál elemzése.

Sok lncRNS feltételezett ORF-eket tartalmaz, amelyek véletlenszerűen fordulnak elő, és nem transzlálódnak funkcionális peptid entitássá. Az egér 1500011k16Rik transzkriptum tartalmaz egy 56 aminosavú ORF-et, amelynek előre jelzett egyszeri áthaladású transzmembrán szegmense van (27), de semmilyen detektálható domén relatív. Számos szekvenciajellemző jelzi a kódolási potenciált. Az 1500011k16Rik-rel (1A. Ábra) homológ gének nukleotidkonzervációjának elemzése 60 gerinces faj (28) között feltárta, hogy a feltételezett ORF régiója a gén leginkább és szinte csak konzervált régiója. Az összesített riboszóma profilalkotási adatok (29) elemzése feltárta a feltételezett ORF jelentős riboszóma lefedettségét (SI függelék, S1A ábra). Az ORF-transzláció feltételezett termékeinek összehangolása magas fokú konzerváltságot mutatott ki az aminosav szintjén (1B. Ábra), magas a szinonimák és a nem szinonimák kodonszubsztitúciói aránya, valamint a korai kereten belüli stop kodonok hiánya (SI függelék, S1. Ábra) B és C). Ennek eredményeként arra a következtetésre jutottunk, hogy a 1500011k16Rik átirat nagy valószínűséggel 56 aminosav hosszú peptiddé alakul át, amelyet a tudományos irodalom konzisztenciája érdekében Mitoregulin (Mtln) (25) néven emlegetünk.

Az Mtln megőrzésének elemzése. (A) Az egér genom területe, amely magában foglalja az 1500011k16Rik gént. Megjelennek az exonok és az ORF helye. A gerincesek (28) védelmi diagramja a térkép alatt látható. (B) Az Mtln peptidszekvenciák összehangolása a gerincesek között.

Az 1500011k16Rik kódolt peptid a mitokondriumban expresszálódik és lokalizálódik.

A 1500011k16Rik egy új polipeptidet kódol. (A) mCherry-jelölt Mtln-peptid konfokális képei; a mitokondriumokat a MitoTracker Green FM, a magokat pedig a Hoechst 33342 festette meg. (Scale bar, 10 μm.) (B) Az NIH 3T3 izolált mitokondriumainak és az endogén Mtln NS0 sejtjeiből származó sejtlizátumok immunblotálása. Tom20-t és β-aktint használtunk terhelés kontrollként. ∆Mtln -1, -2, -3 az NIH 3T3 sejtvonal különböző kiütései. (C) Egérszervi lizátumok immunblotálása az endogén Mtln esetében. A PARK7-et használták terhelésszabályozásként (67).

A légzési komplex I. elektrontranszfer aktivitása sérül a Knockout sejtvonalakon.

Az Mtln mitokondriumok légzésére gyakorolt ​​hatásának teszteléséhez összehasonlítottuk az NIH 3T3 és NS0 sejteket származékaikkal az Mtln-t kódoló inaktivált 1500011k16Rik génnel (SI függelék, S2A ábra). A magas és alacsony mitokondriális membránpotenciállal rendelkező sejtek eloszlását ratiometrikus JC-1 fluoreszcens festék és FACS analízissel teszteltük. A vad típusú és mutáns sejtekben az összes reaktív oxigénfaj (ROS) termelésének szintjét FACS analízissel becsültük 2 ′, 7 ′ –diklór-fluoreszcin diacetát (DCFDA) segítségével. Stein és mtsai. (25) nem látunk szignifikáns különbséget a vad típusú és a knockout sejtek között a ROS termelésben, valamint a membránpotenciál mellett (SI függelék, S4 A és B ábra).

Az Mtln kölcsönhatásba lép a Cyb5r3-mal. (A) A HA-Mtln immunprecipitációja NIH 3T3 sejtekből, majd immunblotolás anti-Mtln antitestekkel (Top) és anti-Cyb5r3 antitestekkel (alul). Címke nélkül Mtln-t expresszáló sejteket használtunk kontrollként. (B) Az I – IV komplexek aktivitása Cyb5r3 (Gly2-Ala2) mutáns sejtekben (∆Cyb5r3mito). Az értékek négy egymástól független, három példányban végzett kísérlet átlaga. A statisztikailag szignifikáns változáshoz a multiplicitással korrigált P érték (P + Balance.

A NADH: ubikinon-oxidoreduktáz csökkent hozzájárulása a mitokondriális légzésbe a NADH-regeneráció alacsonyabb sebességével magyarázható. Az Mtln kiütés NADH/NAD + egyensúlyra gyakorolt ​​hatásának értékeléséhez SoNar fluoreszcens fehérje szenzort alkalmaztunk (31). Megállapítottuk, hogy egyensúlyi állapotban a vad típusú és az Mtln knockout sejtek nem mutatnak szignifikáns különbséget a citoplazmatikus NADH/NAD + redox egyensúlyban (SI függelék, S9A ábra). Ezenkívül úgy döntöttünk, hogy felmérjük a különböző metabolikus szubsztrátok által érintett citoszolban a redox egyensúly változásának dinamikáját (SI függelék, S9 B és C ábra). A teszt azt mutatta, hogy nincs különbség a NADH/NAD + dinamikában a szülői és az Mtln-szegény sejtek között. Megállapíthatjuk, hogy a citoszolos redox egyensúlyt az Mtln abláció nem befolyásolja.

Hogyan befolyásolja az Mtln a Cyb5r3?

Gyakran szükséges a fehérjekomplex képződése a komponensek proteolízissel szembeni stabilizálásához. Azonban nem ez a helyzet a Cyb5r3 és az Mtln közötti kölcsönhatás esetében, amint az a Cyb5r3 immunblottozásával kiderült az Mtln knockout sejtekben (SI függelék, S10A ábra). Az Mtln Cyb5r3 lokalizációjára gyakorolt ​​esetleges hatásának értékeléséhez sejtvonalakat használtunk ektopikusan expresszáló Cyb5r3-eGFP fúziós fehérjét. A Cyb5r3 fúziós fehérje lokalizációja mitokondriálisnak tűnt mind a szülői NIH 3T3 sejtvonalban, mind annak származékában, amely nem tartalmaz Mtln peptidet (SI függelék, S10B. Ábra). Ezenkívül nem észlelünk semmilyen különbséget az Mtln szintben vagy a lokalizációban a ∆Cyb5r3mito mutáció során (SI függelék, S10 C és D ábra).

A Cyb5r3 számos különböző szubsztráttal katalizálja a redoxireakciókat, miközben csak a NADH-t használja elektronként, amely a citoszolos NADH egyik fő fogyasztója (32). Az Mtln hatásának tesztelésére a Cyb5r3 NADH oxidáló képességére mérjük annak NADH dehidrogenáz aktivitását egy reakcióban K3-val [Fe (CN) 6], mint hamis elektron akceptorral (SI függelék, S10E. Ábra). Megállapították, hogy a Cyb5r3 képes kivonni egy elektronot a NADH-ból az Mtln jelenlététől.

Két fő folyamat, amely megköveteli a Cyb5r3 membránhoz kötött formáját, a Δ 9 zsírsav deszaturáció (33) és a koleszterin bioszintézis (34). Az Mtln Cyb5r3 aktivitásra gyakorolt ​​hatásának értékeléséhez a lipid metabolizmusban LC-MS elemzést végeztünk az Mtln-hiányos NIH 3T3 és NS0 sejtvonalakról. Minden sejtvonalban több mint 1000 lipidet számszerűsítettünk (Anyagok és módszerek). A több száz lipid mennyisége szignifikánsan és reprodukálhatóan változott (SI függelék, S11A. Ábra) az Mtln kimerülése után két egymástól függetlenül előállított NIH 3T3 eredetű knockout sejtvonalban. A legtöbb glicerolipid felülreprezentált, míg a legtöbb glicerofoszfolipid alulreprezentált az Mtln kiütéskor mind az NIH 3T3, mind az NS0 sejtvonalakban (5A. Ábra).

A lipidkoncentráció változásai a Cyb5r3 mitokondriális lokalizációjának megzavarása miatt (∆Cyb5r3mito). Az Mtln kiütés (x tengely) és a ∆Cyb5r3mito mutáns (y tengely) által indukált log2-szeres változások közötti kapcsolat a vad típushoz képest. Mindegyik pont egy lipidet képvisel, a glicerolipideket (GL), a glicerofoszfolipideket (GP), más lipidosztályokat pedig piros, kék és fekete színnel mutatjuk be. A legkisebb négyzet alakú regressziós vonal piros színnel jelenik meg. A Pearson-korrelációs együttható, annak 95% -os konfidencia intervalluma és P értéke (t teszt) a bal felső sarokban látható.

Vita

A magasabb rendű organizmusok, például az egér és az ember genomjába kódolt rövid peptidek széles választéka a szabályozó molekulák szinte figyelmen kívül hagyott rétegét alkothatja (11, 35, 36). Ebben a munkában mellékeltük egy figyelemre méltó tag, az Mtln mitokondriális peptid kisméretű funkcionális peptid entitásainak listáját, összhangban más csoportok eredményeivel (25, 26), amelyek e munka áttekintése alatt megjelentek. Az Mtln erősen konzervált a gerincesek között, és mint az eredményeinkből kitűnik, a sejtek anyagcseréjében működik.

A kis peptidek többsége úgy fejezi ki funkcióját, hogy egy társfehérjéhez kötődik, vagy a multiprotein komplexek alkotóelemeként működik (10), amint azt a szarkolipin és a foszfolamban (37, 38), a humanin (18), Toddler/ELABELA (39, 40) esetében bemutatták. ) és DWORF (41). Csak néhány kicsi peptidnek van külön enzimatikus funkciója, például a 4-oxalokrotonát tautomeráznak, amelynek monomerje csak 62 aminosavat tartalmaz (42). Ennek a tendenciának megfelelően kimutattuk, hogy az Mtln peptid kölcsönhatásba lép a NADH-val: citokróm b5 oxidoreduktáz 3 (Cyb5r3). Ez utóbbinak a mitokondriális lokalizációjának megzavarása ugyanazon fenotípushoz vezet, mint az Mtln kimerülése az I. légzési komplexum szempontjából oxigénfogyasztásnak és lipidösszetétel változásnak tulajdonítottam. Így az Mtln működhet a Cyb5r3 aktivitásának stimulálásával a mitokondriumokban, amelyek szükségesek a lipid homeosztázis fenntartásához. Egy újabb tanulmány kimutatta, hogy az Mtln kölcsönhatásba léphet más mitokondriális fehérjékkel is (26), mint például a zsírsavak β-oxidációjában részt vevő HADHA és HADHB. Bár a tanulmányunkban és Makarewich et al. (26) különbözőek, mindkettő összefüggő folyamatoknak tulajdonítható, ami azt jelezheti, hogy az Mtln részt vesz a zsírsav-anyagcserében szöveti vagy sejttípusú sajátosságokkal.

Erre a tevékenységre, amint bemutattuk, a mitokondriális OXPHOS rendszer összefüggésében működő I. légzőkomplexre van szükség, az izolált I komplex vagy az I + III komplexek NADH oxidáz aktivitására azonban nem. Ez a megfigyelés összhangban áll Stein és mtsai. (25), bemutatva az Mtln-hiány hatását a CI-t tartalmazó, de CI-t tartalmazó légzési lánc szuperkomplexek képződésére a CI összeállítására, valamint a CI és CIII komplexek társulására.

Több funkciót tulajdonítottak a Cyb5r3-nak. Az oldható Cyb5r3 izoform (43) eritrocita-specifikus methemoglobin reduktáz aktivitásán kívül (43), amely valószínűleg nem releváns a vizsgálatunk szempontjából, a membránra rögzített Cyb5r3 szerepet játszik a zsírsavak deszaturációjában (33), a koleszterin bioszintézisében (34), valamint a lipogenezisben (44 ⇓ –46) és a gyógyszer-anyagcserében részt vevő amidoxim-rendszer.

Anyagok és metódusok

A pX458 plazmid (59) alapján hoztuk létre a géninaktiválás és a genomszerkesztés konstrukcióit. Knockin konstrukciókat Csipkerózsika transzpozon vektorok alapján hoztunk létre (60, 61). A ROS termelés monitorozását tapadó és szuszpenziós sejtekben a Wojtala és munkatársai által javasolt protokoll szerint végeztük. (62) Az oxigénfogyasztás mértékét a leírás szerint mértük (63). A tenyésztett sejtekből származó mitokondriumokat differenciál centrifugálással izoláltuk. A Cyb5r3 enzimatikus aktivitását izolált mitokondriumokban határoztuk meg a NADH-függő ferricianid redukció monitorozásával (64). A lipid-analízishez szükséges metabolit-extrakciót a leírtak szerint végeztük (65). A nem célzott lipidóm profilozást pozitív ionizációs módban végeztük (66). Az állatmunkát a Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem állatetikai bizottsága hagyta jóvá.

A tanulmány módszertanáról további részletek az SI függelékben találhatók.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Alex Lebedeffnek a kézirat szerkesztésében nyújtott segítségét; Ksenia Smirnova a sejtnövekedésben nyújtott segítségéért; Nikolai Anikanov és Elena Stekolschikova lipidek extrakciójának és tömegspektrometriás mérésekhez kettős knockout sejtvonalakhoz; és Dr. Yi Yang a pcDNA3.1-SoNar és a pcDNA3.1-iNapC vektorok biztosításáért. A.C. köszönetet mond a Boehringer Ingelheim Fondnak egy utazási támogatásért, amely részt vesz egy európai molekuláris biológiai laboratórium tanfolyamán. Köszönetet mondunk a Skolkovo Tudományos és Technológiai Intézetnek a publikációs díjak és a nyílt hozzáférés díjának finanszírozásáért is. Ezt a munkát az Orosz Alapkutatási Alapítvány (RFBR) támogatásai támogatták (17-04-01904 és 18-29-07005) (P.S. és A.C. részére); Orosz Tudományos Alapítvány (RSF) 17-75-30027 (P.S.) támogatás a genomszerkesztéssel kapcsolatos munkáért; és a Moszkvai Állami Egyetem Tudományos Iskolája (O.D.). Az egereken végzett kísérleteket az orosz tudományos minisztérium támogatása támogatta. 14.W03.31.0012. P.V. támogatta az elnök ösztöndíja (SP-4132.2018.4). Az Mtln-törlés munkája nem változtatja meg a citoszolos NADH/NAD + egyensúlyt az RSF 17-15-01175 (D.B.-nek) és az RFBR 18-54-74003 (V.B.) támogatásával.

Lábjegyzetek

  • ↵ 1 Kinek lehet címezni a levelezést. E-mail: mikhail.vyssokikhgmail.com vagy petyagenebee.msu.ru .