A steatosis (NAFLD) és a steatohepatitis (NASH) állatmodelljei máj lebeny-specifikus zselatináz-aktivitást és oxidatív stresszt mutatnak

Giuseppina Palladini

1 Pavia Egyetem Belgyógyászati és Terápiás Tanszék, Pavia, Olaszország

2 Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Pavia Egyetem, Pavia, Olaszország

Laura G. Di Pasqua

1 Belvárosi és Terápiás Tanszék, Pavia Egyetem, Pavia, Olaszország

Clarissa Berardo

1 Belvárosi és Terápiás Tanszék, Pavia Egyetem, Pavia, Olaszország

Veronica Siciliano

1 Belvárosi és Terápiás Tanszék, Pavia Egyetem, Pavia, Olaszország

Plinio Richelmi

1 Belvárosi és Terápiás Tanszék, Pavia Egyetem, Pavia, Olaszország

Stefano Perlini

1 Pavia Egyetem Belgyógyászati és Terápiás Tanszék, Pavia, Olaszország

2 Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Pavia Egyetem, Pavia, Olaszország

Andrea Ferrigno

1 Pavia Egyetem Belgyógyászati és Terápiás Tanszék, Pavia, Olaszország

Mariapia Vairetti

1 Belvárosi és Terápiás Tanszék, Pavia Egyetem, Pavia, Olaszország

Társított adatok

A vizsgálat eredményeinek alátámasztására használt adatok kérésre a megfelelő szerzőtől állnak rendelkezésre.

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A felmerülő metabolikus krónikus májbetegségek közül az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) és annak fejlettebb formája, az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) az ipari országok jelentős közegészségügyi problémájává válik [1, 2]. A becsült világméretű prevalencia a NAFLD esetében 4-46%, a NASH esetében pedig 3% -5% [3]. A NAFLD legnagyobb gyakorisága a nyugati országokban figyelhető meg (17–46%), ahol a krónikus májbetegségek morbiditásának és mortalitásának legfontosabb okává válhat [2, 4].

Az állatmodellek elengedhetetlen eszközek a NAFLD patogenezisét és a NASH-ba való haladását vezérlő mechanizmusok azonosításához. Ideális esetben a kísérleti modelleknek tükrözniük kell az emberi NAFLD etiológiáját, betegségének progresszióját és patológiáját. Sajnos a jelenleg rendelkezésre álló modellek, az MCD étrend, a nyugati étrend és a magas zsírtartalmú étrend kiegészítik egymást, és mindegyik részben tükrözi az emberi NAFLD valós képét [5]. A rendelkezésre álló kísérleti modellek genetikai és táplálkozási kategóriákba sorolhatók: a fő genetikai modell a Zucker patkány (fa/fa), az elhízással járó metabolikus szindróma genetikai modellje, míg a leggyakrabban alkalmazott táplálkozási modell metionin- és kolinhiányos étrendet alkalmaz. (MCD diéta) [5]. Ez egy nagyon reprodukálható modell, amely 8 hetes alkalmazás után következetesen indukálja a súlyos NASH fenotípusát [6].

A máj parenchima funkcionális szervezetet mutat, amelyet metabolikus zónának neveznek: a porto-centrális tengely mentén a szinuszoidák között felsorakozott hepatociták strukturális és funkcionális heterogenitást mutatnak [7]. Ezenkívül azonban egyre több bizonyíték van az egyes májlebenyek funkcionális heterogenitására, ami megmagyarázhatatlan interlobuláris variabilitást tár fel, amelyet a különböző lebenyek összehasonlításakor a heterogén károsodás-eloszlás mutat [8]. A májlebenyek között számos különbség található számos májbetegségben és mérgező károsodásban, például kémiai karcinogenezisben, cirrhosisban és acetaminofen toxicitásban [9–11]. Korábban kimutattuk, hogy az ischaemia/reperfúziós és obstruktív kolesztázisos állatmodellekben a máj funkcionális lobar heterogenitása létezik, jelezve, hogy különböző események, például az extracelluláris mátrix (ECM) modulációja és az oxidatív stressz különböző intenzitással fordulnak elő a máj lebenyében [12, 13].

Jelen tanulmány célja az volt, hogy feltételezzük a máj lebeny heterogenitását nem alkoholos zsírmájbetegség (NAFLD) és nem alkoholos steatohepatitis (NASH) modellekben, az ECM, a mátrix metalloproteináz (MMP) aktivitásának és a specifikus inhibitoroknak (TIMP) megváltozása szempontjából. és oxidatív stressztartalom, ROS és TBARS képződés.

2. Anyag és módszerek

2.1. Állatok

A Zucker patkányok a NAFLD jól jellemzett modelljét képviselik. Tizennégy 11 hetes hím elhízott (fa/fa) Zucker patkányt és életkornak megfelelő soványt (fa/-) használtunk. Az állatokat (n = 7 csoportonként) Charles River, Olaszország. A NASH kiváltására a legszélesebb körben alkalmazott étrend a metionin-kolinhiányos (MCD) étrend. Tizennégy 8 hetes hím Wistar patkányt MCD diétával (Laboratorio Dottori Piccioni, Milano, Olaszország) vagy kolinnal és metioninnal (kontroll) kiegészített izokalorikus étrenddel etettek 8 hétig. Az állatokat (n = 7 csoportonként) Charles River, Olaszország. A felhasznált állatmodelleket az Olasz Egészségügyi Minisztérium és a helyi Egyetemi Állatgondozási Bizottság hagyta jóvá (dokumentum száma: 2/2012). Az áldozat idején a patkány lobárszerkezete alapján, amelyet Sanger és mtsai. [14], a jobb jobb lebeny (RL), a jobb középső lebeny (ML) és az oldalsó bal lebeny (LL) májmintáit összegyűjtöttük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk (1. ábra); szérum vérmintákat is gyűjtöttek.

A máj lebenyeinek grafikus (sematikus) ábrázolása. Májmintákat gyűjtöttek (∗) a jobb felső lebenyből (RL), a jobb középső lebenyből (ML) és az oldalsó bal lebenyből (LL).

2.2. Vizsgálatok

A májkárosodást az alanin-transzamináz (ALT) és az aszpartát-transzamináz (AST) szérumszint-értékelésével értékeltük egy kereskedelmi készlet (Sigma) alkalmazásával. A TNF-alfa szérumszintjét kereskedelmi ELISA készlettel értékeltük a gyártási eljárások szerint (R&D Systems, Minneapolis, MN). A máj reaktív oxigénfajtáinak (ROS) meghatározását követte a 2 ′, 7′-diklórfluoreszcein-diacetát (H2DCFDA) fluoreszcens 2 ′, 7′-diklórfluoreszceinné (DCF) való átalakítása a korábban leírtak szerint [15]. A lipidperoxidáció mértékét a tiobarbitursav-reaktív anyagok (TBARS) képződése szempontjából a korábban leírtak szerint mértük [16].

2.3. A szöveti források és a májfehérje izolálása

Leölés után a májlebenyeket gyorsan kivágtuk és hideg (4 ° C) pufferbe helyeztük (30 mM hisztidin, 250 mM szacharóz, 2 mM EDTA, pH 7,2) a vér eltávolítása érdekében. A májat lemérjük, majd feldaraboljuk, folyékony nitrogénben lefagyasztjuk és -80 ° C-on tároljuk felhasználásig. A májfehérjét homogenizálással (IKA-Ultraturrax T10) extraháltuk fagyasztott májszövetben, jéghideg extrakciós pufferben (1:10 tömeg/térfogat), amely 1% Triton X-100, 500 mmol/l Tris-HCl, 200 mmol volt./L NaCl és 10 mmol/l CaCl2, pH 7,6 [17]. A homogenátumot ezután centrifugáltuk (30 perc 12 000 fordulat/perc sebességgel 4 ° C-on), és a felülúszó fehérje koncentrációját a kolorimetriás Lowry módszerrel mértük [18]. A mintákat felhasználás előtt -20 ° C-on tároltuk. Az MMP-2 (zselatináz A; EC 3.4.24.24), az MMP-9 (zselatináz B; EC 3.4.24.35), a TIMP-1 és a TIMP-2 fehérjeszinteket kereskedelmi ELISA kit (Abnova) segítségével határoztuk meg.

2.4. MMP-2 és MMP-9 szimbólum

Az MMP-k lítikus aktivitásának kimutatása céljából a májkivonatokat a mintaterhelő pufferben 400 μg/ml végkoncentrációra normalizáltuk (0,25 M Tris-HCl, 4 tömegszázalék szacharóz, 10 tömegszázalék SDS és 0,1% brómfenol). kék tömeg/térfogat, pH 6,8). Hígítás után a mintákat elektroforetikus gélekre (SDS-PAGE) töltöttük, amelyek 1 mg/ml zselatint tartalmaztak, nem redukáló körülmények között [19], majd ezt követően a szimbólummal, ahogy azt korábban leírtuk [20]. A zymogramokat sűrűségmérővel (GS900 Densitomer; BIORAD, Hercules, CA, USA) elemeztük, és az adatokat optikai sűrűségként (OD) fejeztük ki, 1 mg/ml fehérjetartalomra vonatkoztatva.

2.5. Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± standard hibaként fejezzük ki. A csoportok összehasonlítását párosítatlan t teszttel végeztük. Amikor az adateloszlás a Kolgonorov-Smrna teszt szerint nem volt normális, Mann-Witney tesztet használtunk. Az összes statisztikai eljárást a MedCalc statisztikai szoftvercsomaggal (11.6.0.0 verzió) hajtottuk végre. P 2 (a) és 2 (b) érték). Az MMP-9 aktivitás alacsonyabb volt az ML-ben, mint az LL-ben (2. ábra (b)). Noha nem szignifikáns, az MMP-2 esetében hasonló tendencia fordult elő a kontroll májban (2. ábra (a)). Az MMP-9 aktivitás szignifikáns növekedését találtuk az RL-ben is, összehasonlítva a kontroll patkányok ML-jével és LL-jével (2. ábra (b)). Jelentős növekedést tapasztaltunk az MMP-2 és MMP-9 aktivitásban a NASH állatok RL, ML és LL esetében a megfelelő kontroll állatokhoz képest (2. a) és 2. b) ábra).

A TIMP-1 és a TIMP-2 szint magasabb volt az RL-ben a NASH modellben, összehasonlítva az ML-vel és az LL-vel (3. ábra (a)). Ugyanez a tendencia fordult elő a TIMP-1 kontrollállatoknál is. Alacsonyabb TIMP-2 szintet találtak a NASH patkányokban az RL-ben, összehasonlítva az ML-vel. Ez a tendencia az ML és az RL vonatkozásában fordult elő a kontroll állatokban (3. ábra (b)). Alacsonyabb TIMP-1 szintet találtunk a NASH patkányok RL-, ML- és LL-szintjeiben a megfelelő kontrollállataikkal összehasonlítva (3. ábra (a)). Ugyanez a tendencia fordult elő a TIMP-2 esetében az LL-ben és az ML-ben (3. ábra (b)).

LL-től, ML-től és RL-től kapott TIMP-1 (a) és TIMP-2 (b) májtartalma MCD-ben és kontroll patkányokban. A TIMP-szinteket ng/ml-ben fejezzük ki. Az adatok átlagértékek ± SE. ∗ p 4. ábra (a)). Elhízott és Lean Zucker patkányokban nem volt kimutatható MMP-9 aktivitás. Alacsonyabb MMP-2 aktivitást találtak a NAFLD patkányok RL-jében a megfelelő Lean állatokhoz képest (4. ábra (a)).

A TIMP-1 szignifikánsan magasabb volt az ML-ben, mint a NAFLD patkányok LL-jéhez képest (5. ábra (a)). A TIMP-1 összehasonlítható szintjét a Lean Zucker patkányok lebenyeiben találtuk (5. ábra (a)). Sem az elhízott, sem a Lean Zucker patkányokban nem volt kimutatható különbség a TIMP-2 esetében. Az elhízott Zucker patkányokban összehasonlítható TIMP-1 és TIMP-2 szintet találtunk az RL, az ML és az LL-ben a Lean állatokkal összehasonlítva, kivéve a TIMP-1-et RL-ben (5. (a) és 5. (b) ábra).

Májtartalom a TIMP-1 (a) és a TIMP-2 (b) LL-től, ML-jétől és RL-jétől NAFLD és Lean patkányokban. A TIMP-szinteket ng/ml-ben fejezzük ki. Az adatok átlagértékek ± SE. ∗ p 6. ábra (a)). Éppen ellenkezőleg, kontroll patkányokban alacsonyabb ROS-tartalmat találtak az RL-ben az LL-hez képest (6. ábra (a)). Magasabb máj TBARS-szinteket figyeltek meg az LL-ben az RL-hez és az ML-hez képest NASH és kontroll állatokban. Jelentős növekedést találtak a TBARS-ban, amikor a NASH patkányokban az LL, az ML és az RL-t összehasonlítottuk a megfelelő kontrollállataikkal (6. ábra (b)).

Az LL-től, ML-től és RL-től kapott ROS (a) és TBARS (b) májszintje NASH és kontroll patkányokban. Az adatok átlagértékek ± SE. ∗ p 7. ábra (a)). Ugyanez a tendencia fordult elő Lean Zucker patkányoknál is (7. ábra (a)). Alacsonyabb ROS-szintet találtunk, amikor a NAFLD patkányokból nyert LL, ML és RL értékeket összehasonlítottuk a megfelelő Lean csoporttal (7. ábra (a)). Magasabb TBARS-szintet találtak az LL-ben mind elhízott, mind Lean és Zucker patkányokban, összehasonlítva a megfelelő ML-vel és RL-vel (7. ábra (b)). Alacsonyabb TBARS-szintet találtunk, amikor az Obese Zucker patkányokból nyert LL, ML és RL értékeket összehasonlítottuk a Lean csoport megfelelő lebenyeivel (7. ábra (b)).

Az LL-től, az ML-től és az RL-től kapott ROS (a) és TBARS (b) májszintje NAFLD és Lean patkányokban. Az adatok átlagértékek ± SE. ∗ p 1. táblázat). Ugyanez vonatkozott a TNF-alfa koncentrációra, a Kupffer-sejtek aktiválódásának indexére is (1. táblázat). Zucker patkányoknál csak az ALT növekedését tapasztalták az elhízott állatoknál (1. táblázat); nem találtunk különbséget a szérum TNF-alfa koncentrációjában az elhízott és a Lean Zucker állatok között (1. táblázat). Összehasonlítva a NAFLD modellt a NASH modellel, szignifikánsan alacsonyabb TNF-alfa szintet találtunk az Obese Zucker patkányokban, összehasonlítva az MCD patkányokkal (1. táblázat).

Asztal 1

Szérumenzimek és TNF-alfa NASH és NAFLD patkányokban.

ALTAST TNF-alfa(U/L) (U/L) (pg/ml)

NASH	Ellenőrzés	30,8 ± 2	97,8 ± 2	26,8 ± 2,2
MCD	166,2 ± 23 ∗	245,1 ± 39 ∗	36,7 ± 2,6 ∗ §
NAFLD	Lean Zucker	66,2 ± 4,3	112,3 ± 2,8	10,2 ± 0,5
Elhízott Zucker	114,5 ± 20 °	116,1 ± 10	9,5 ± 0,4

∗ p § p 8. ábra). Bár a különböző lebenyekben megfigyelt eltérő anyagcsere-viselkedés oka megoldatlan rejtély, ez a tanulmány alátámasztja a máj lebenyek közötti funkcionális heterogenitás egyre növekvő bizonyítékát, amelyet már más májbetegségeknél is megfigyeltek, ugyanaz a tendencia a NAFLD-ben és a NASH-ban is előfordult.

A májlebenyök heterogenitásának sematikus ábrázolása a NASH és a NAFLD modellekben (MMP-k, mátrix metalloproteinázok; TIMP-k, metalloproteináz ROS szöveti inhibitorok, reaktív oxigénfajok; TBARS, tiobarbitursav-reaktív anyagok).

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Massimo Costa úrnak az ügyes technikai segítséget, Nicoletta Bredának a szerkesztési segítséget, és Anthony Baldry professzornak az angol nyelv felülvizsgálatát.

Adatok elérhetősége

A vizsgálat eredményeinek alátámasztására használt adatok kérésre a megfelelő szerzőtől állnak rendelkezésre.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

A szerzők közreműködése

Giuseppina Palladini és Laura G. Di Pasqua egyformán járultak hozzá.