Molekuláris
Gyógyszer
Jelentések

  • Journal Home
  • Jelenlegi probléma
  • Közelgő kérdés
  • Legolvasottabb
  • Legtöbbször idézett (dimenziók)
    • Az elmúlt két év
    • Teljes
  • Legtöbbször idézett (CrossRef)
    • Az elmúlt év 0
    • Teljes
  • Közösségi média
    • Múlt hónap
    • Múlt év
    • Teljes
  • Archívum
  • Információ
  • Online benyújtás
  • Információ a szerzőknek
  • Nyelv szerkesztése
  • Információ a bírálók számára
  • Szerkesztési irányelvek
  • Szerkesztőbizottság
  • Célok és hatály
  • Kivonatolás és indexelés
  • Bibliográfiai információk
  • Információ a könyvtárosoknak
  • Információ a hirdetők számára
  • Újranyomtatások és engedélyek
  • Lépjen kapcsolatba a szerkesztővel
  • Általános információ
  • A Spandidosról
  • Konferenciák
  • Munkalehetőségek
  • Kapcsolatba lépni
  • Felhasználási feltételek
  • Szerzői:
    • Binggui Zhang
    • Rongqi Wang
    • Jinghua Du
    • Jingya Niu
    • Rui Zhang
    • Shunjiang Xu
    • Xuemin Niu
    • Qingfu Zhang
    • Yuemin Nan

  • Ezt a cikket a következők említik:

    Absztrakt

    Bevezetés

    Az alkoholmentes steatohepatitis (NASH), amely az alkoholmentes zsírmájbetegségek (NAFLD) spektrumának része, inzulinrezisztencia és diszlipidémia jellemzi, és fibrózissá, cirrhosussá, májelégtelenséggé és hepatocelluláris carcinomává válhat (1). A közelmúltban a NASH-t a súlyos májműködési zavarok vezető okaként ismerték el, és ennek eredményeként egyre nagyobb figyelmet keltett. A NASH sikeres megelőzése és kezelése korai stádiumban nagyban függ a betegségben rejlő molekuláris mechanizmusok jobb megértésétől. Különböző tényezők, köztük a lipid metabolizmus diszregulációja, inzulinrezisztencia, immunválasz, gyulladás és oxidatív stressz járulnak hozzá a NASH patogeneziséhez (2,3).

    mikrorns-199a-5p

    A metionin-kolinhiányos (MCD) étrend a laboratóriumi állatoknál általánosan alkalmazott módszer a NASH kiváltására, amely máj steatózist okoz gyulladással, amely morfológiailag megegyezik az emberek NASH-jával (4,5). E modell alkalmazásával kimutatták, hogy az oxidatív stressz hozzájárul az NASH előrehaladásához az immunválaszok stimulálásával, jelezve az adaptív immunitás lehetséges szerepét a betegség patogenezisében (6). A steatohepatitis pontos okát azonban továbbra sem ismerik pontosan.

    A mikroRNS-ek (miRNS-ek) alapvető szerepet játszanak a cukorbetegségben és a NAFLD-ben, és a miRNS-expresszió korrekcióját akár upregulációval, akár gátlással javasolják, mint ígéretes kezelést a metabolikus szindrómában, és enyhíthetik a betegség progresszióját (7). A miRNS-ek az egyszálú, nem kódoló kis RNS-ek, általában 22 nukleotid hosszúságúak, amelyek a fehérje expresszióját a poszttranszkripciós szinten szabályozzák, a fehérjét kódoló mRNS-ekhez teljes vagy részleges kötődés révén (8). Jelenleg 2042 érett emberi miRNS-t azonosítottak (miRBase 19.0, 2012. október 17.), amelyek az emberi gének több mint egyharmadát szabályozzák (9). A miRNS-ek számos patofiziológiai eseményhez kapcsolódnak, például szövetek fejlődéséhez, differenciálódásához, sejtproliferációjához és apoptózisához (10,11).

    Beszámoltak arról, hogy a miR-33a és a miR-33b részt vesz a koleszterin és a lipid homeosztázis szabályozásában azáltal, hogy szabályozza a szterin-szabályozó elemet kötő fehérje (SREBP) expresszióját (12). Ezenkívül a miR-375-ről kiderült, hogy csökkenti az inzulin szekrécióját és befolyásolja az inzulin downstream jelátvitelt (13). Különösen az emberi májban kifejezetten expresszálódó bőséges miRNS, a miR-122 leütése bizonyította, hogy csökkenti a hepatitis C vírus fehérje replikációját, miközben indukálja a hem-oxigenáz 1 expresszióját (14). Ezenkívül a miRNS-221/222 aktivált sztellátumsejtek szabályozása és elősegítette a májfibrózis progresszióját (15). A miR-199a-5p/3p bősége szintén összefüggésben áll a májfibrózis progressziójával (16).

    Különösen a keringő miRNS-eket javasolták hasznos eszközként a májbetegségek diagnosztizálásában (17, 18). A miR-29c, miR-34a, miR-155 és miR-200b, máj miRNS expressziós szintjének változásai a NASH patofiziológiai és patomorfológiai jellemzőinek különbségeivel társultak (19). Ezenkívül egy, a NASH-hoz társuló máj miRNS-ek megváltozott expressziós szintjét vizsgáló vizsgálat során összesen 23 miRNS-ről számoltak be, hogy nem expresszáltak vagy túlexpresszáltak a NASH-ban, és ezeknek a miRNS-eknek a várható céljai befolyásolták a sejtek proliferációját, az anyagcserét, a fehérje transzlációját, apoptózis, gyulladás és oxidatív stressz (20).

    Jelen tanulmányban a máj miR-199a-5p, miR-122 és miR-221 expressziós szintjét a NASH egér modelljében vizsgáltuk reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR) alkalmazásával. A miR-199a-5p célgénjeit bioinformatikai eszközök, például TargetScan 6.2, miRanda és PITA jósolták. A NASH-val kapcsolatos funkciókkal rendelkező 1. nukleáris receptor corepressor (NCOR1) az összes algoritmus által megjósolt miR-199a-5p célgénként jelent meg. Az NCOR1 egy nagy, többdoménes fehérje, amelyet a nukleáris receptorok toboroznak a transzkripciós represszió közvetítésére, és szerepet játszik a cirkadián és metabolikus fiziológia epigenetikai szabályozásában a hiszton-dezacetiláz 3 (21) és más fiziológiai útvonalak aktiválásával, beleértve a rák elősegítését is. (22).

    Jelen tanulmányban az NCOR1-et in vitro vizsgáltuk a miR-199a-5p elnémításával és túlexpresszálásával LX-2 humán májstellátum sejtekben (HSC).

    Anyagok és metódusok

    Állatok, diéták és kísérleti tervezés

    Hat hetes C57BL/6J hím egereket a Kínai Orvostudományi Akadémia (Peking, Kína) Kísérleti Állatközpontjából szereztek be, és 12 órás fény/sötét ciklus alatt, 24 ° C-on tartották, szabadon hozzáférve a tisztítotthoz. víz és szokásos étrend. Két hét akklimatizálás után az egereket véletlenszerűen két csoportra osztották, vagy MCD-diétával (ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA), vagy kolin-bitartáttal (2 g/kg) és DL-metioninnal (3 g) táplálkozva./kg; ICN Biomedicals) nyolc hétig. Az állati táplálékot felhasználás előtt 4 ° C-on tárolták, és ad libitum volt elérhető. A nyolc hetes expozíció végén a retro-orbitális vénákból vett vérmintákat gyorsan összegyűjtötték biokémiai elemzés céljából, majd az egereket méhnyak diszlokációval leölték. A nyolc hetes expozíció végén az egereket feláldoztuk. A májat kivágtuk, folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk és felhasználásig -80 ° C-on tároltuk, vagy szövettani elemzés céljából 10% -os formalinban rögzítettük. Valamennyi kísérleti eljárást a Hebei Orvostudományi Egyetem állatkísérleti etikai bizottsága hagyta jóvá (Shijiazhuang, Kína).

    Biokémiai elemzés

    A szérum alanin-aminotranszferáz (ALT) és az aszpartát-aminotranszferáz (AST; Shanghai Kehua Bio-Engineering Co., Ltd., Shanghai, Kína) szintjét, a máj gyulladásos károsodásának megbízható mutatóit Olympus AU5400 automatikus kémiai analizátorral (Olympus Corporation, Tokió) mértük, Japán) a gyártó utasításainak megfelelően.

    Szövettani elemzés

    A paraffinba ágyazott májszakaszokat (5 μm) hematoxilinnal és eozinnal, valamint Masson-féle trichrommal festettük a máj steatosisának és fibrózisának értékelésére, a korábban leírtak szerint (23, 24). A NAFLD szövettani pontozását a Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network Patológiai Bizottságának kritériumai alapján határozták meg (25).

    RT-PCR és mRNS elemzés

    A teljes RNS-t a májszövetekből TRIzol-reagenssel (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk, és NanoDrop 1000 spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) számszerűsítettük. A cDNS szintézist 2 μg teljes RNS és Moloney egér leukémia vírus reverz transzkriptáz alkalmazásával hajtottuk végre oligo dT primerekkel (Fermentas, Burlington, ON, Kanada) vagy miRNS RT primer készlettel (Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangzhou, Kína). Az RT-PCR-t egy ABI 7500 PCR rendszeren (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) végeztük SYBR-Green PCR készlet (Beijing CoWin Biotech Co., Ltd., Beijng, Kína) felhasználásával. A miRNS-ek expressziós szintjét normalizáltuk az U6 kis mag RNS szintjére, a célgének expressziós szintjét pedig a β-aktin szintjére. Az egyes miRNS és célgének relatív expressziós szintjét a 2 -ΔΔCt módszerrel értékeltük (26). Az összes RT-PCR reakciót három példányban hajtottuk végre. Az alkalmazott alapozók a következők voltak: NCOR1 előre: 5'-CCCATTTCCAGCGTGTTAGTG-3 'és hátramenet: 5'-AAGGTGAAGCAT TTTGGTCATCT-3'; β-aktin előre: 5′-GAGACCTTCAACACCCCCAGC-3 ′ és hátramenet: 5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3 ′.

    Bioinformatikai elemzés

    Egy korábbi tanulmány (27) és a Gene Expression Omnibus alapján megállapítottuk, hogy a miR-199a-5p-t a TargetScanMouse v6.2 (www.targetscan.org) segítségével számítási előrejelzés céljából választottuk ki a célgének felsorolásának létrehozására. A miR-199a-5p célpontok funkcionális elemzéséhez a megjósolt célgének dúsítási elemzését hajtottuk végre az Annotation, Visualization and Interrogated Discovery (DAVID) adatbázis segítségével (28). A dúsítási elemzést az összes ismert gén ontológiai (GO) kifejezéssel és a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; www.genome.jp/kegg) útvonalakkal végeztük.

    Western blottolás

    A szövetmintákat 1% fenil-metánszulfonil-fluoridot tartalmazó radioimmunprecipitation assay pufferrel extraháltuk, és a fehérjekoncentrációkat Bradford-módszerrel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) mértük. Az egyenlő fehérjemennyiségű mintákat (50 μg/üreg) SDS-PAGE alkalmazásával elválasztottuk, és elektroblotolás útján polivinilidén-difluorid membránokra (Amersham PLC, Amersham, Egyesült Királyság) vittük át. A membránokat egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on az NCOR1 elleni elsődleges nyúlantitestekkel [foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) 1: 1 000 arányban hígítva); Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA], transzformáló növekedési faktor (TGF) -β1 (1: 1 000 hígítás PBS-ben; Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) vagy α-simaizom aktin (α-SMA; 1 hígítás: 1000 PBS-ben; Abcam). A jeleket a β-aktinra normalizáltuk, amelyet a Sigma-Aldrich-től vásárolt antitestekkel detektáltunk (PBS-ben 1: 1 000 arányban hígítva; St. Louis, MO, USA). Kecske-nyúl IRDye800 szekunder antitesttel (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) végzett inkubálás után a membránokon detektált sávokat Odyssey ™ infravörös képalkotóval (LI-COR Biosciences, Inc., Lincoln, NE, USA) számszerűsítettük.

    Sejtkultúra és transzfekció

    Az LX-2 HSC-ket az American Type Culture Collection-től (Rockville, MD, USA) szereztük be. A HSC-k a fibrogén sejttípusok, amelyek hozzájárulnak a kollagén felhalmozódásához krónikus májbetegségek során, és értékes eszközöket jelentenek a májbetegségek elemzésében. Az LX-2 sejteket Dulbecco módosított Eagle táptalajában tenyésztettük 10% magzati szarvasmarha-szérummal, 100 U/ml penicillinnel és 100 g/l sztreptomicinnel 37 ° C-on, párásított környezetben, 5% CO 2 -val. A sejteket 2 × 105 sejt/ml sűrűséggel beoltottuk, és 100% mol/l miR-199a-5p utánzattal, miR-199a-5p inhibitorral vagy a megfelelő kontrollokkal végzett transzfekció előtt 50% -os összefolyásig növesztettük (Guangzhou RiboBio Co ., Ltd.) a Lipofectamine ® 2000 (Invitrogen Life Technologies) alkalmazásával. A transzfektált sejteket 48 órán át tenyésztettük és összegyűjtöttük a teljes RNS és fehérje extrakcióhoz. A mintákat -80 ° C-on tároltuk, hogy később RT-PCR vagy Western blot vizsgálatokban felhasználjuk őket. Mindegyik kezelést legalább három ismétlésben végeztük.

    Statisztikai analízis

    1.ábra

    A C57BL/6J egerek májszakaszai kontroll és MCD étrendet tápláltak nyolc hétig. (A) Hematoxilin és eozin festés; (B) Masson trichrom festése. Eredeti nagyítás, × 200. MCD, metionin-kolin-hiány.