A vestibularis rendszer szerepe az elhízásban és a glükóz metabolizmusának károsodásában a magas zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben

Szerepek konceptualizáció, adatkezelés, hivatalos elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, validálás, írás - eredeti tervezet, írás - áttekintés és szerkesztés

Kindai Egyetem Orvostudományi Kar Élettani és Regeneratív Orvostudományi Tanszéke, Osakasayama, Japán

Szerepek Az adatok kezelése

Kindai Egyetem Orvostudományi Kar Élettani és Regeneratív Orvostudományi Tanszéke, Osakasayama, Japán

Szerepek Az adatok kezelése

Kindai Egyetem Orvostudományi Kar Élettani és Regeneratív Orvostudományi Tanszéke, Osakasayama, Japán

Szerepek Az adatok kezelése

Hovatartozás Élettudományi Kutatóintézet, Kindai Egyetem, Osakasayama, Japán

Szerepek Az adatok kezelése

Gifu Egyetem Orvostudományi Egyetem, Élettani Tanszék, Gifu, Japán

Szerepek Az adatok kezelése

Tsukubai Egyetem, Japán, Tsukuba Egyetem, Orvostudományi Kar, Genombiológiai Tanszék

Szerepek konceptualizálás, formális elemzés, finanszírozás megszerzése, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Kindai Egyetem Orvostudományi Kar Élettani és Regeneratív Orvostudományi Tanszéke, Osakasayama, Japán

Naoyuki Kawao,
Yoshimasa Takafuji,
Masayoshi Ishida,
Katsumi Okumoto,
Hironobu Morita,
Masafumi Muratani,
Hiroshi Kaji

Ábrák

Absztrakt

A vestibularis rendszer szabályozza az egyensúlyt, a testtartást, a vérnyomást és a tekintetet. A vestibularis rendszer energia- és glükóz-anyagcserében betöltött szerepe azonban továbbra sem ismert. Megvizsgáltuk a vestibularis rendszer szerepét az elhízásban és a csökkent glükóz-anyagcserében, a magas szacharóz/zsírtartalmú étrendet (HSHFD) tápláló vestibularis elváltozásokkal (VL) rendelkező egerek felhasználásával. A VL-t műtét vagy arzén indukálta. A VL szignifikánsan elnyomta az egerekben a HSHFD által fokozott testzsírt. HSHFD-vel táplált egerekben a VL javította a glükóz intoleranciát. A VL tompította az egerek epididymális fehér zsírszövetében a HSHFD által megemelkedett adipogén faktorok és gyulladásgátló adipokinek szintjét. A β-blokkoló antagonizálta a testzsírt és a glükóz intoleranciát, amelyet a HSHFD fokozott egerekben. Az RNS-szekvenálás elemzésének eredményei azt mutatták, hogy a HSHFD megváltoztatta a gének, például az inzulinszerű növekedési faktor-2 és a glia fibrilláris savas fehérje változását az egerek vestibularis magjaiban a vestibularis rendszeren keresztül. Összegzésképpen itt bemutattuk, hogy a vestibularis rendszer diszregulációja befolyásolja az egerekben a HSHFD által kiváltott elhízott állapotot és károsodott glükóz metabolizmust. A vestibularis rendszer hozzájárulhat a beállított pontok szabályozásához energiafelesleg esetén.

Idézet: Kawao N, Takafuji Y, Ishida M, Okumoto K, Morita H, Muratani M és mtsai. (2020) A vestibularis rendszer szerepe az elhízásban és a glükóz metabolizmusának károsodásában a magas zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben. PLoS ONE 15 (2): e0228685. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0228685

Szerkesztő: Barbara Fam, Melbourne-i Egyetem, AUSZTRÁLIA

Fogadott: 2019. november 2 .; Elfogadott: 2020. január 20 .; Közzétett: 2020. február 3

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt részben támogatta a Takeda Science Foundation támogatása az NK-nak, a Kindai Research Enhancement Grant (21. századi közös kutatási fejlesztési támogatás) támogatása a HK-nak, a tudományos kutatáshoz nyújtott támogatásnak (C: 16K08534, 19K07310 ) az NK-nak, valamint az innovatív területek tudományos kutatásához nyújtott támogatás (15H05935 támogatásszám: „Élet az űrben”) a HK számára a Japán Oktatási, Kulturális, Sport-, Tudományos és Technológiai Minisztériumtól. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A fej lineáris és szöggyorsulását a vestibularis hámsejtek érzékelik, majd a vestibularis neuronokon keresztül továbbítják a vestibularis magokba. A vestibularis magok neuronjai az egyensúlyérzékelés vezérlő központja, és a vestibularis rendszer kapcsolódik más neuronális traktusokhoz, például a vestibulo-oculomotorhoz és a vestibulo-spinalis traktusokhoz, amelyek a szem tekintetét vestibulo-okuláris reflexekkel és testtartással szabályozzák [ 1,2]. Sőt, a vestibularis mag neuronjai kapcsolódnak az autonóm idegrendszerhez, és vestibulo-autonóm reflexként szabályozzák a kardiovaszkuláris rendszert [2,3].

A vestibularis rendszer és a csontváz szerveinek kapcsolatát illetően korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a vestibularis elváltozások (VL) rágcsálókban a szimpatikus idegrendszeren keresztül csökkentik a csont ásványi sűrűségét (BMD) [4,5]. Luxa és mtsai. számoltak be arról, hogy a labirintektómia fokozta a myofiber remodelációját az egerek egyedüli izomzatában [6]. Nemrégiben kiderült, hogy a gravitációs változások az egerek vestibularis rendszerén keresztül érintik az izmokat és a csontokat [7,8]. Ezek a megállapítások együttesen azt sugallják, hogy a vestibularis rendszer részben a szimpatikus idegrendszeren keresztül szabályozza a mozgásszervi rendszert. A vestibularis rendszer diszfunkciói klinikailag szédülést, vertigo-t és bizonytalanságot okoznak [9]. A hosszú távú űrrepülés rontja az űrhajósok vestibularis rendszerét, akik ortosztatikus intoleranciát és bizonytalanságot tapasztalnak [3]. Azonban a vestibularis rendszer szerepe a metabolikus homeosztázisban még nem került részletesen tisztázásra.

A felesleges energia a fehér zsírszövetben (WAT) lipidként tárolódik, és elhízást okoz, ami a cukorbetegség kockázati tényezője [10]. Az adipociták megkülönböztetik a mesenchymális őssejteket, és az adipogén differenciálódás aktiválódását a peroxiszóma proliferátor által aktivált γ (PPARγ), aP2, hosszú láncú acil-CoA szintetáz (ACSL) 1 és lipoprotein lipáz (LPL) fokozott szintje követi. Elhízás esetén a WAT gyulladásgátló adipokineket, például tumor nekrózis faktor (TNF) -α, plazminogén aktivátor gátló (PAI) -1 és monocita kemoattraktáns fehérjét (MCP) -1, szabadít fel, amelyek károsítják a glükóz anyagcserét az alacsony szint indukciója miatt. fokú szisztémás gyulladás [10]. A zsírszövetből felszabaduló adiponektin és leptin pleiotróp hatást fejt ki a glükóz metabolizmusában [10]. A keringő adiponektin és a WAT-ból előállított leptin negatívan és pozitívan viszonyul a zsírtömeghez, [11,12] Korábbi eredmények azt mutatták, hogy az aktivált hipotalamusz leptin/melanokortin rendszer, a csökkent adiponektin szint és a hiperinsulinémia fokozza a szimpatikus idegi aktivitást az elhízásban [13–15].

Jelen vizsgálatunkban a VL hatását és hatásmechanizmusát vizsgáltuk az elhízásra és a glükóz metabolizmusának károsodására magas szacharóz/magas zsírtartalmú étrend (HSHFD) táplált elhízott egereknél, műtét és mérgező vegyi anyagok által indukált VL-vel, hogy tisztázzuk a a vestibularis rendszer az étrend okozta elhízásban és a glükóz metabolizmusának károsodásában.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Valamennyi állatkísérletet az Országos Egészségügyi Intézet irányelveinek, valamint a Kindai Egyetemen a laboratóriumi állatok használatára és gondozására vonatkozó intézményi szabályoknak megfelelően hajtották végre. Az összes eljárást a Kindai Egyetem Kísérleti Állatvédelmi Bizottsága hagyta jóvá (Engedély száma: KAME-27-029). Minden erőfeszítést megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében. Az egereket felesleges izofluránnal eutanizáltuk.

Állatkísérletek

A hím C57BL/6J egereket a CLEA Japan-tól (Tokió, Japán) szereztük be. Az egereket ad libitumban HSHFD-vel (a kalóriák 28% -át szénhidrátokból és 55% -ot zsírból, Keleti élesztőből, Tokióból, Japánból) vagy normál étrendből (ND) és 9 hetes vízből tápláltuk 4 vagy 8 hétig. 6 órás éhezés után az egereket felesleges izofluránnal eutanizáltuk, és szövetmintákat gyűjtöttünk.

Sebészeti vestibularis elváltozások (sVL)

A hím C57BL/6J egereket (7 hetesek) véletlenszerűen 4 csoportba osztottuk: ND/Sham (n = 8), ND/sVL (n = 8), HSHFD/Sham (n = 8) és HSHFD/sVL (n = 8). A VL műtétet kétoldalúan, a korábban leírt módszer szerint végeztük egereknél 2% izoflurán altatásban [7]. Röviden, a fülcsontokat eltávolítottuk a külső hallójáraton keresztül. Az előcsarnok sérülést okozott, ha egy fogzúzót behelyeztek a belső fül ovális ablakába, majd cautery készülékkel ablálták. A VL-műtétnek a vestibularis rendszerre gyakorolt hatásait egy úszási teszttel értékeltük, amint azt korábban leírtuk [23], amelyben a vestibularis diszfunkcióval rendelkező egerek nem tudtak úszni, és továbbra is megfordultak a meleg víz (35 ° C) alatt. Az ál-egereknél a dobhártyát eltávolították, de a fülcsontok és az előcsarnok megmaradtak. 2 hetes gyógyulási periódus után az egereket 8 hétig ND-vel vagy HSHFD-vel etették.

Arzén által kiváltott vestibularis elváltozások (aVL)

A hím C57BL/6J egereket (9 hetesek) véletlenszerűen 4 csoportba osztották: ND/Kontroll (n = 8), ND/aVL (n = 8), HSHFD/Kontroll (n = 8) és HSHFD/aVL (n = 8). A nátrium-arzanilátot alkalmazó VL-t kétoldalúan indukáltuk a korábban leírt módszerrel [24]. 2% izoflurán érzéstelenítés alatt 10 μl nátrium-arzanilátot (Tokyo Chemical Industry, Tokió, Japán) sóoldatban oldva injektáltunk a középfül üregébe (1,5 mg/fül). Kontroll egerekben azonos térfogatú sóoldatot injektáltunk kétoldalúan. Az egereket ND-vel vagy HSHFD-vel etettük az aVL-kezelés után 1 naptól számított 4 héten keresztül.

Propranolol kezelés

A hím C57BL/6J egereket 4 csoportra osztották: ND/Kontroll (n = 8), ND/propranolol (n = 8), HSHFD/Kontroll (n = 8) és HSHFD/propranolol (n = 8). A propanololt (Sigma, St. Louis, MO, USA) 9 hetes egereknek adtuk be ivóvízzel 0,5 g/l koncentrációban, 8 héten keresztül, a korábban leírtak szerint [8].

Glükóz és inzulin tolerancia tesztek

Glükózt (Wako, Osaka, Japán) 1,5 g/kg-ban és inzulint (Eli Lilly Japan, Kobe, Japán) 0,5 E/kg-ban adtunk intraperitoneálisan egereknek glükóz- és inzulin-tolerancia tesztekhez. A vércukorszintet az injekció beadása előtt és 30, 60, 90 és 120 perccel azután mértük.

A tapadás szilárdságának mérése

Az egerek tapadási szilárdságát ötször mértük meg egy tapadási szilárdságmérővel (1027SM, Columbus Instruments, Columbus, OH, USA), és a kapott eredményeket átlagként fejeztük ki, amint azt korábban leírtuk [25].

Kvantitatív számítógépes tomográfia (QCT)

Miután az egereket 2% izofluránnal altattuk, QCT-vizsgálatot végeztünk röntgen CT-rendszer (Latheta LCT-200; Hitachi Aloka Medical, Tokió, Japán) felhasználásával, a következő paraméterekkel: 500 μA csőáram, 50 kVp csőfeszültség és 48 mm-es axiális látómező, az előzőekben leírtak szerint [7]. A teljes zsír- és izomtömeg, valamint az összes csont ásványianyag-tartalom (BMC) elemzése során CT-képeket (voxelméret 96 × 192 × 1008 μm) nyertünk, és az érdeklődési körzetet az egész testként határoztuk meg. A tibialis trabecularis és corticalis BMD elemzése során 24 μm izotróp voxelméretű CT-képeket kaptunk, és az érdeklődési körzeteket 1680 μm-es szegmensként definiáltuk 96 μm-től a proximális növekedési lemez diafízis felé eső végétől disztálisig és 2160-ig. a diaphysis középső szakaszának μμ-os szegmensei, ill. A CT-képeket LaTheta szoftverrel elemezték (3.41 verzió).

Szövettani elemzés

Az epididymális WAT-ot 4% paraformaldehidben rögzítettük 24 órán át, paraffinba ágyazva és 4 μm vastag szakaszokra vágtuk. A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festettük, és mikroszkóppal (E800; Canon, Tokió, Japán) fényképeztük CCD kamerával. Legalább 350 adipocita keresztmetszetét planimetriával számszerűsítettük ImageJ alkalmazásával, vak módon.

Valós idejű PCR elemzés

A teljes RNS-t az RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A cDNS-t nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával szintetizáltuk (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Valós idejű PCR-analízist végeztünk egy ABI PRISM 7900HT (Thermo Fisher Scientific) és Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával, a korábban leírtak szerint [25]. A valós idejű PCR-hez használt primereket az S1 táblázatban mutatjuk be. A célgének relatív mRNS-szintjét ΔΔCt módszerrel elemeztük és 18S rRNS-szinttel normalizáltuk.

Vérkémia

A szérum inzulin, leptin és adiponektin szintjét egér inzulin enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlet (AKRIN-011T katalógusszám, FUJIFILM Wako Shibayagi, Gunma, Japán), egér/patkány leptin Quantikine ELISA készlet (Cat. MOB00, R&D systems, Minneapolis, MN, USA), illetve egér/patkány adiponektin enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlet (katalógusszám: AKMAN011, FUJIFILM Wako Shibayagi), ill.

RNS szekvenálás

Egymilliméter vastag koronaszeleteket kaptunk egér agyából egér agymátrix segítségével (Muromachi Kikai, Tokió, Japán). A vestibularis magokat lyukasztóval gyűjtöttük össze az Allen Mouse Brain Atlas szerint [26]. A teljes RNS-t biopsziás mintákból TRIzol-reagenssel (Thermo Fisher Scientific) extraháltuk, és egy Agilent Bioanalyzer segítségével értékeltük az RNS 6000 Pico Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) alkalmazásával. Az rRNS kimerülését és a könyvtárszintézist a NEBNext rRNS Depletion Kit (E6310, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) és a NEBNext Ultra Directional RNS Library Prep Kit (E7420, New England Biolabs) felhasználásával végeztük 500 ng teljes RNS-ből. A könyvtár minőségét az Agilent Bioanalyzer segítségével ellenőriztük a DNS nagy érzékenységű készletével (Cat. No. 5067–4626, Agilent). Minden könyvtárat Illumina (2 × 36 bp páros végű olvasás) és NextSeq500 High Output Kit v2 (Illumina, San Diego, CA, USA) segítségével szekvenáltunk. A FASTQ fájlokat a CLC Genomics Workbench-be (10.1.1-es verzió, Qiagen, Germantown, MD, USA) importálták. Az olvasmányokat mm10 egér referenciagenomra térképeztük fel, és 49 585 annotált génre számszerűsítettük. A transzkriptum kilobázisonkénti olvasása millió leképezett olvasás (RPKM) értékét kvantilis módszerrel normalizáltuk.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlagként ± az átlag standard hibájaként fejezzük ki. A jelentős különbségeket kétirányú varianciaanalízissel elemeztük, amelyet Tukey-Kramer teszt követett. A 0,05 alatti P értékeket szignifikánsnak tekintettük. A statisztikai elemzéseket GraphPad PRISM 7.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) alkalmazásával végeztük.

Eredmények

Az sVL hatása a HSHFD által kiváltott elhízásra

A testtömeg, a teljes zsírtömeg és az adipocita mérete az epididymális WAT-ban szignifikánsan magasabb volt a HSHFD-vel táplált egerekben, mint az ND-vel táplált egerekben (1A. És 1B. Ábra). Az sVL szignifikánsan csökkentette a testtömeget, a teljes zsírtömeget és a zsírsejtek méretét, amelyet a HSHFD fokozott, de nem befolyásolta a kalória-bevitelt HSHFD-vel vagy anélkül (1A. és 1B. ábra). Az sVL elnyomta az HSSFFD által fokozott ACSL1 mRNS-szinteket az egerek epididymális WAT-jában (1C. ábra), míg a HSHFD nem befolyásolta a PPARγ, aP2 vagy LPL mRNS-szintjét az egerek epididymális WAT-jában (1C. ábra). A teljes izomtömeg szignifikánsan alacsonyabb volt a HSHFD-vel táplált egerekben, és az sVL szignifikánsan csökkentette a teljes izomtömeget HSHFD-vel vagy anélkül (1D. Ábra). Noha a HSHFD-etetés nem befolyásolta a tallók és a gastrocnemius izmok szöveti súlyát vagy a tapadás erejét egerekben, az sVL szignifikánsan csökkentette a gastrocnemius izomzatának szöveti súlyát ND- vagy HSHFD-vel táplált egerekben (1D ábra). Ami a csontot illeti, a HSHFD 8 héten át tartó etetése nem befolyásolta az egerek teljes BMC-t vagy tibialis trabecularis és corticalis BMD-jét (1E ábra). Az sVL szignifikánsan csökkentette az összes BMC-t és a tibialis trabecularis BMD-t ND-vel és HSHFD-vel táplált egerekben (1E ábra).

(A) Az éhomi vércukorszintet és a szérum inzulinszintet 8 héttel az ND vagy a HSHFD táplálás megkezdése után mértük. (B, C) A vércukorszint reakciói a glükóz (B) és az inzulin (C) egyetlen intraperitoneális injekciójára színlelt műtétben és sVL egerekben 8 héttel az ND vagy HSHFD táplálás megkezdése után. Kiszámítottuk a görbe alatti területet (AUC) 120 percig. (D) A teljes RNS-t az álműtét és az sVL egerek májszöveteiből extraháltuk 8 héttel az ND vagy a HSHFD táplálás megkezdése után. Ezután valós idejű PCR-analízist hajtottak végre. Az adatokat a 18S rRNS szintjéhez viszonyítva fejezzük ki. * P 3. ábra. Az aVL hatása a zsírtömegre és a glükóz anyagcserére 4 hétig HSHFD-vel táplált egerekben.

(A) A testtömegre és a kalóriabevitelre vonatkozó adatok a kontroll (Cont) és aVL egerekből, akiket ND vagy HSHFD tápláltak. A testsúlyt 4 héttel az ND vagy a HSHFD táplálás után mértük. A táplálékfelvételt 3 napig gyűjtötték a 26. és 28. napon az ND vagy HSHFD táplálás megkezdése után, és azt az átlagos napi kalóriabevitel reprezentatívjaként mutatták. (B) A zsír tömegét a kontroll egész testében és az aVL egerekben QCT-vel értékeltük 4 héttel az ND vagy a HSHFD táplálás megkezdése után. Az epididymális fehér zsírszövet (WAT) szövet tömegét 4 héttel az ND vagy a HSHFD táplálás után mértük. (C) A teljes RNS-t extraháltuk a kontroll epididymális WAT-ból és aVL egerekből 4 héttel az ND vagy a HSHFD táplálás megkezdése után. Ezután valós idejű PCR-analízist hajtottak végre. Az adatokat a 18S rRNS szintjéhez viszonyítva fejezzük ki. (D) Az éhomi vércukor- és inzulinszintet 4 héttel az ND vagy a HSHFD táplálás megkezdése után mértük. (E, F) A vércukorszint reakciói a glükóz (E) és az inzulin (F) egyetlen intraperitoneális injekciójára kontroll és aVL egerekben 4 héttel az ND vagy HSHFD táplálás megkezdése után. Kiszámítottuk a görbe alatti területet (AUC) 120 percig. * P 4. ábra. Az sVL és az aVL hatása az adipokin szintre HSHFD-vel táplált egerekben.

(A) A teljes RNS-t az álműtét és az sVL egerek epididymális WAT-jából extraháltuk 8 héttel az ND vagy a HSHFD táplálás megkezdése után. Ezután valós idejű PCR-analízist hajtottak végre. Az adatokat a 18S rRNS szintjéhez viszonyítva fejezzük ki. 8 héttel az ND és a HSHFD táplálás megkezdése után álmûtétbõl és sVL egerekbõl szérummintákat vettünk. A szérum leptin és az adiponektin szintjét kvantifikáltuk. (B) A teljes RNS-t extraháltuk a kontroll epididymális WAT-ból (Cont) és aVL egerekből 4 héttel az ND vagy HSHFD táplálás megkezdése után. Ezután valós idejű PCR-analízist hajtottak végre. Az adatokat a 18S rRNS szintjéhez viszonyítva fejezzük ki. Szérummintákat gyűjtöttünk a kontroll és aVL egerekből 8 héttel az ND és a HSHFD táplálás megkezdése után. A szérum leptinszintek számszerűsítését elvégeztük. * P 5. ábra. A propranolol kezelés hatása a zsírtömegre és a glükóz anyagcserére 8 hétig HSHFD-vel táplált egerekben.