A vizelet metabolomja különbözik a sovány és a túlsúlyos labrador retriever kutyák között a takarmányozás alatt

Szerepek konceptualizáció, adatkezelés, hivatalos elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, erőforrások, szoftver, írás - eredeti tervezet

Anatómiai, élettani és biokémiai tagozat, Svéd Agrártudományi Egyetem, Uppsala, Svédország

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

A Svéd Agrártudományi Egyetem Klinikai Tudományok Tanszéke, Uppsala, Svédország

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, szoftver, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Állattáplálkozási és -kezelési tagozat, Svéd Agrártudományi Egyetem, Uppsala, Svédország

Szerepek Adatmegőrzés, nyomozás, írás - áttekintés és szerkesztés

A Svéd Agrártudományi Egyetem Klinikai Tudományok Tanszéke, Uppsala, Svédország

Szerepek konceptualizáció, finanszírozás megszerzése, írás - áttekintés és szerkesztés

Anatómiai, élettani és biokémiai tagozat, Svéd Agrártudományi Egyetem, Uppsala, Svédország

Szerepek Adatkúra, módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

Molekuláris Tudományok Tanszéke, Svéd Agrártudományi Egyetem, Uppsala, Svédország

Szerepek Adatmegőrzés, forrásszerzés, módszertan, erőforrások, szoftver, írás - áttekintés és szerkesztés

Molekuláris Tudományok Tanszéke, Svéd Agrártudományi Egyetem, Uppsala, Svédország

Szerepek konceptualizálás, adatgondozás, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Anatómiai, élettani és biokémiai tagozat, Svéd Agrártudományi Egyetem, Uppsala, Svédország

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Anatómiai, élettani és biokémiai tagozat, Svéd Agrártudományi Egyetem, Uppsala, Svédország

Josefin Söder,
Ragnvi Hagman,
Johan Dicksved,
Sanna Lindåse,
Kjell Malmlöf,
Agback Péter,
Ali Moazzami,
Katja Höglund,
Sara Wernersson

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Söder J, Hagman R, Dicksved J, Lindåse S, Malmlöf K, Agback P és mtsai. (2017) A vizelet metabolomja különbözik a sovány és a túlsúlyos labrador retriever kutyák között a takarmány-provokáció során. PLoS ONE 12 (6): e0180086. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0180086

Szerkesztő: Carlos E. Ambrósio, Állattudományi és Élelmiszeripari Kar, São Paulo Egyetem, BRAZIL

Fogadott: 2016. szeptember 8 .; Elfogadott: 2017. június 11 .; Közzétett: 2017. június 29

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: A tanulmányt anyagilag támogatta a Future Animal Health and Welfare Platform, a Svéd Agrártudományi Egyetem, a svéd Thure F. és Karin Forsberg Alapítvány, a svéd Michael Forsgren Alapítvány és a Formas 222-2014-1341 svéd kutatási tanács. Assoc. Prof. Sara Wernersson, DVM Josefin Söder és Assoc. Prof. Ali Moazzami megkapta a támogatást. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az elhízás egyre nagyobb probléma a kedvtelésből tartott kutyák populációjában [1, 2], utánozva az emberi helyzetet világszerte. A túlsúlyos kutyák az elhízással járó betegségekben szenvednek, például a krónikus betegségek korai kialakulásában, az életminőség romlásában és az élettartam rövidítésében [3, 4], ami erősen motiválja a területen végzett kutatásokat. Kimutatták, hogy a túlsúlyos kutyák metabolikus elváltozásokat mutatnak [5–7], amelyek közül sok elhízott embernél is megtalálható [8]. Az elhízás eredete összetett, a környezeti és életmódbeli tényezőket, amelyek poligenetikus háttérrel járulnak hozzá, javasolják [9]. Az étvágyat szabályozó genetikai mutációt a közelmúltban fedezték fel labrador retriever kutyáknál [10, 11], de a kutya elhízás patogenezise még korántsem ismert.

Az elhízott fenotípusok metabolizmusának vizsgálata metabolomika segítségével ígéretes eredményeket mutatott humán és rágcsáló modellekben [12, 13]. Számos tanulmány azt sugallja, hogy a vizelet metabolitjai megkülönböztethetik a sovány és a túlsúlyos személyeket [14, 15], felfedve az elhízással és a potenciálisan megváltozott anyagcsere útvonalakkal összefüggő metabolitokat. Kutyáknál az ürített vizeletmintákat nem invazív módon lehet otthon és kórházi környezetben is gyűjteni [16, 17], ezért a vizelet mind praktikus, mind informatív biofolyadék a metabolikus vizsgálatok során. A kutya vizelet metabolitprofiljait sikeresen elemezték, összefüggéseket mutatva a fajta, az életkor és az étrend korlátozásával [18–20]. Legjobb tudásunk szerint azonban egyetlen korábbi tanulmány sem számolt be a vizelet metabolomikájának használatáról az étkezés utáni minták vagy a túlsúlyhoz kapcsolódó változások elemzésére kutyákban.

A jelenleg rendelkezésre álló metabolomikai adatok többsége az éhezési állapotot képviseli, bár az anyagcsere nagyon dinamikus folyamat. Embereken végzett kutatások bebizonyították, hogy az olyan kihívások alkalmazása, mint az étkezés vagy a testmozgás, növelheti az egyének közötti variációkat és felfedheti az éhomi körülmények között nem észlelhető metabolit-változásokat [21, 22]. A sovány és a túlsúlyos kutyák közötti megkülönböztetés tehát jobban megvalósítható, ha az éhomi állapot mellett az étkezés utáni állapotot is tanulmányozzuk.

Ebben a vizsgálatban a magmágneses rezonancia (NMR) spektroszkópiát többváltozós analízissel kombináltuk egy takarmány-kihívás során a vizelet metabolitjának relatív vizeletkoncentrációjának értékelésére egészséges labrador retriever kutyáknál. A vizsgálat célja egyrészt annak vizsgálata volt, hogy az NMR-alapú metabolomika alkalmazható-e az étkezés utáni és az éhomi vizelet megkülönböztetésére kutyákban, másrészt annak vizsgálata, hogy az éhomi és az étkezés utáni vizeletben különböznek-e a metabolit profilok a sovány és a túlsúlyos kutyák között.

Anyag és módszerek

Állatok

Általános tanulmányterv

Megszereztük az étkezési előzményeket, és minden kutyánként pontoztuk a kutyák számára az asztali maradványok elnyerésének gyakoriságát, valamint a képzési csemegékkel és a rágókkal való jutalmazását (1. táblázat). A kutatásban való részvétel előtt nem módosították a kutyák szokásos házi étrendjét, amely száraz vagy nedves teljes kutyaeledelt és csemegét tartalmaz. A kutyákat a klinikai mintavétel előtti napon 18 órától böjtöltük. A vizsgálati nap reggelén visszatartották a vizet, és a tulajdonos minden kutyából ürített vizeletmintát vett, mielőtt elhagyta otthonát. A klinikára érkezéskor (8 és 9:30 között) ugyanazokat az állatorvosok vizsgálták meg a kutyákat, és éhomi vérmintákat vettek az állapotfelmérés érdekében, majd egy tesztétkezés bevitelével. Az étkezés utáni vizeletmintákat 3 óra múlva gyűjtöttük össze. A vizsgálatot az Uppsala, Svédország állatkísérletekkel foglalkozó etikai bizottsága jóváhagyta (C180/12), és a tulajdonos írásbeli beleegyezését minden kutyához megkapta. A tanulmány az epidemiológiai megfigyelési tanulmányok jelentésének irányelveit követte [23].

Az egészségi állapot és a test állapotának értékelése

A BCS alapján 12 kutyát osztályoztak és csoportosítottak soványnak (BCS 4–5), 16-ot pedig túlsúlyosnak (BCS 6–8) [24]. Amint azt korábban leírtuk [7], az éhomi szérum leptin koncentrációt alkalmazták a test állapotának klinikai pontozásának igazolására [25, 26]. Az átlagos ± standard deviáció (SD) leptin-koncentráció (ng/ml) szignifikánsan magasabb (P = 0,048) volt a túlsúlyos csoportban (5,7 ± 3,5), mint a sovány csoportban (3,4 ± 1,9). Megerősítést nyert, hogy a testtömeg szignifikánsan különbözött a két kutyacsoport között (P = 0,004), míg az életkor és az ideális sovány testtömeg nem különbözött szignifikánsan.

Vizeletmintagyűjtés és takarmányteszt-teszt

A vizeletet a kutyatulajdonosok szabadfogású mintavevő eszközzel gyűjtötték össze (Uripet, Rocket Medical, Washington, Egyesült Királyság). A vizsgálati nap előtt a kutyák legalább háromszor tapasztalták a vizeletmintavételi eljárást, hogy hozzászoktassák őket az eljáráshoz. A vizsgálati napon a természetesen ürített reggeli vizeletet otthon gyűjtötték össze, és szállítás közben jégen hűtötték. A klinikán a vizeletmintákat 2000xg-vel 5 percig + 4 ° C-on centrifugáltuk. A vizeletmintákat ezután leszűrtük (Filtropur S 0,2 um, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Németország), polipropilén csövekbe helyeztük (SC Micro Tube PCR-PT, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Németország) és azonnal -70 ° C-on lefagyasztottuk. C. Három órával a teszt étkezés után az étkezés utáni vizeletet összegyűjtötték a klinikán, és közvetlenül kezelték és lefagyasztották a fentiekkel megegyező módon.

A vizelet metabolitjainak NMR spektrális felvétele és azonosítása

Az NMR spektrális felvétel előtt a fagyasztott vizeletmintákat 6 ° C-on felolvasztottuk, és mindegyik mintából 150 μl vizeletet vettünk ki, és összekevertünk 150 μl foszfátpufferrel (150 mM, pH 7,4, 0,01% TSP (3- (trimetil-szilil) - 2,2 ', 3,3'-tetradeuteropropionsav)) 3 mm-es NMR-csőben. Az NMR-analíziseket egy Bruker Avance II 600 MHz-es spektrométeren végeztük, amely QCI H-C/P/N-D kriopróbával és egy SampleJet mintaváltóval volt felszerelve mintahűtő rendszerrel (Bruker Biospin AG, Fällanden, Svájc).

A spektrális felvételhez és feldolgozáshoz a Bruker Biospin AG által szállított TopSpin 3.1 szoftvert használtuk. A felvételhez egydimenziós némító szekvenciát alkalmaztunk, víz előtelítettséggel, 4 másodperces relaxációs késleltetéssel és 128 vizsgálattal minden kísérletnél. Az összes mérést 25 ° C-on végeztük. A felvétel után minden spektrum Fourier-transzformációval történt, szorzást követően 0,5 Hz-es sortágítással, fáziskorrekcióval, korrigálva az alapvonalat, és 0,0 ppm-re vonatkoztatva a TSP-re.

A spektrumokat ezután a ChenomX NMR suite 7.5 adatbázis (Chenomx Inc., Edmonton, Kanada) segítségével elemeztük. Mindegyik spektrumban összesen 47 metabolitot azonosítottak a ChenomX adatbázis segítségével, és koncentrációikat mM-ben meghatároztuk a hozzáadott belső standardhoz (TSP) viszonyítva, az átfedő jelek elszámolása után. Mivel a kreatinin és a karbamid sokkal magasabb koncentrációban volt jelen, mint más metabolitok (a kreatinin akár 1000-szer nagyobb, és a karbamid akár az 5000-szer nagyobb), koncentrációik bármilyen kis változása azt kockáztatta, hogy a többi metabolit relatív arányában nagy változás következett be metabolitok. Ezt a két metabolitot ezért kizárták az adatállományból, ami után 45 metabolit maradt. A vizeletmintákban előforduló különböző koncentrációk figyelembevétele érdekében az éhezési és az étkezés utáni időpontok adatait a következő képlet alkalmazásával alakítottuk át relatív koncentrációkra (az összes mM% -ában): [(metabolit mM)/(mind a 45 mM összege) metabolitok)] x100. Ezért az összes metabolitkoncentráció relatív volt, és a továbbiakban „relatív koncentrációknak” nevezzük őket.

statisztikai elemzések

Páros és párosítatlan t-teszteket, a Wilcoxon jelölt rangú tesztet és a Mann-Whitney U tesztet használták a normálisan és nem normálisan elosztott adatok (életkor, testtömeg, ideális sovány testtömeg, éhomi leptin koncentrációk, vizelet kreatinin koncentrációk, étkezési előzmények és vizelet fajsúly) csoportok vagy időpontok között (GraphPad Prism 5.0, San Diego, Kalifornia, USA). A P értéke 1. ábra. Az éhomi és étkezés utáni időpontok közötti fő komponenselemzés.

Az éhomi és étkezés utáni vizeletminták egyértelmű elválasztást mutattak a fő komponens elemzésben (A). Mind a 45 metabolit és mind a 28 kutya belekerült ebbe a nem korlátozott modellbe. Az 1. fő komponens (PC) a variancia 12% -át, a PC2 pedig 7% -ot magyarázta. A szétválasztás szignifikánsnak bizonyult egy részleges legkisebb négyzetes diszkrimináns analízis (PLS-DA) modellben (a P-értékeket lásd az Eredmények szakaszban), ahol az éhomi és étkezés utáni vizeletmintákat két külön csoportként definiálták. A terhelési diagram (B) megegyezik a fő komponens elemzéssel (A). A PLS-DA modellben az éheztetés és az étkezés utáni vizelet elkülönítésében jelentős mértékben hozzájáruló diszkriminatív metabolitokat (allantoin, taurin, citrát és malonát) félkövér szöveggel és fekete pontokkal emeljük ki.

A sovány és túlsúlyos kutyák egyértelmű elkülönülést mutattak az étkezés utáni vizeletadatlap fő összetevőjének elemzésében (A). Mind a 45 metabolit belekerült ebbe a kötetlen modellbe. Az 1. fő komponens (PC) a variancia 8% -át, a PC2 pedig 4% -ot magyarázta. Az elválasztás szignifikánsnak bizonyult egy részleges legkisebb négyzetes diszkrimináns analízis (PLS-DA) modellben (a P-értékeket lásd az Eredmények szakaszban), ahol a sovány (n = 12) és a túlsúlyos kutyákat (n = 16) két különálló csoportok. A terhelési diagram (B) megegyezik a fő komponens elemzéssel (A). A PLS-DA modellben a sovány és a túlsúlyos kutyák közötti elválasztáshoz jelentős mértékben hozzájáruló diszkriminatív metabolitokat (taurin, allantoin és guanidoacetát) félkövér szöveggel és fekete pontokkal emeljük ki.

A többváltozós megközelítéssel azonosított diszkriminatív metabolitokat továbbvizsgáltuk egyváltozós adatok elemzésével (GraphPad Prism 5.0, San Diego, Kalifornia). Ezt az elemzést az eredmények fiziológiai értelmezésének lehetővé tétele céljából hajtották végre, vagyis annak megállapítására, hogy a megkülönböztető metabolitok vizeletkoncentrációja nőtt vagy csökkent-e az időpontok között, vagy hogy magasabb vagy alacsonyabb-e sovány vagy túlsúlyos kutyákban. A Wilcoxon aláírt rangú tesztet és a Mann-Whitney U tesztet alkalmazták az éhomi és étkezés utáni időpontok (mind a 28 kutyát is beleértve), valamint a sovány és túlsúlyos kutyák közötti étkezés utáni időpontban a normális eloszlású, párosított és páros nélküli összehasonlításra az anyagcseretermék-koncentrációk között. . Nevezetesen csak a PLS-DA modellekben azonosított diszkriminatív metabolitokat vonták be az egyváltozós statisztikai elemzésekbe, és Bonferroni-korrekciókat (P = 0,05/diszkriminatív metabolitok vagy összehasonlítások száma) végeztek a többszörös összehasonlítással járó problémák ellensúlyozására.

Eredmények

Egészségi állapot

A vizsgálatba bevont 28 lényegében egészséges Labrador Retriever esetében sem hematológiai, sem szérum biokémiai úton nem észleltek klinikailag figyelemre méltó rendellenességeket. A vizelet standard szintmérőjének kémiája egészséges kutyák referencia-tartományán belül volt, csakúgy, mint a vizelet fajsúlya (átlag ± SD), amely 1,034 ± 0,01 volt az éhomi mintákban és 1,032 ± 0,01 az étkezés utáni mintákban. A vizelet fajsúlya nem különbözött szignifikánsan az éhomi vizeletben az időpontok, a sovány (1,036 ± 0,01) és a túlsúlyos kutyák (1,033 ± 0,01) között. Az ELISA-val mért átlagos ± SD kreatinin-koncentráció (mM) nem volt szignifikánsan különbözõ az éhezésben (17,2 ± 7,0) az étkezés utáni vizelettel (18,4 ± 7,8) összehasonlítva. Az élettani paraméterek a fizikális vizsgálat során egészséges kutyák referencia-tartományán belül voltak, de 11 kutyánál találtak kisebb egészségügyi problémákat, pl. enyhén merev járás és enyhe sántaság, a parodontitis jelei, tapintható periartikuláris osteophyte-képződés és a bőr furunculosisai. Az ilyen kisebb egészségügyi problémákat mutató kutyák egyike sem volt kizárva, mivel a létfontosságú paraméterek normálisak voltak. A 28 bevont kutyánál összegyűjtött adatok egyikében sem volt hiányzó érték. Az étrend előzményeiben nem találtunk szignifikáns különbséget a sovány és a túlsúlyos kutyák között (1. táblázat).

A böjt és az étkezés utáni időpontok összehasonlítása

Mind a 28 kutya többváltozós PCA-modelljében egyértelmű különbség volt az éhgyomri és az étkezés utáni időpontok között a relatív metabolitkoncentrációban (1A. Ábra). A szignifikáns szétválasztást a PLS-DA modellben is megerősítettük, a két időpontot előre definiált csoportként használva (PLS-DA 1 komp: R 2 Y = 0,4, Q 2 Y = 0,32; CV-ANOVA: P = 0,00006). VIP elemzéseket használva az éhgyomri és az étkezés utáni időpontok közötti diszkriminatív metabolitokat allantoinként, taurinként, citrátként és malonátként azonosítottuk (2. táblázat). Összehasonlítva a PCA-diagramot (1A. Ábra) a megfelelő betöltési ábrával (1B. Ábra), kiderült, hogy a taurin és a citrát koncentrációja nőtt, az allantoin és a malonát koncentrációja csökkent az étkezés után az éhomi vizelettel összehasonlítva. Az egyváltozós elemzések összhangban voltak a többváltozós modellekkel, kivéve a malonátot, amely a Bonferroni-korrekció után nem volt szignifikáns (P 2. táblázat. Diszkrimináns metabolitok az éhomi és az étkezés utáni idõpontok között a 28 bevont labrador retriever kutyában.

Karcsú és túlsúlyos kutyák összehasonlítása

A testállapot-pontszámot (BCS) ugyanaz az állatorvos (JS) értékelte, és 12 sovány (BCS 4-5) és 16 túlsúlyos (BCS 6–8) labrador retriever kutyát takarmányozásnak vetettek alá. A relatív taurin-koncentrációkat úgy számítottuk ki, hogy a taurin moláris koncentrációját normalizáltuk a kutya mintáinak mind a 45 metabolitjának teljes moláris koncentrációjához (az értékek átlag ± SD (az összes mM% -ában)). A Mann-Whitney U tesztet alkalmazták a sovány és túlsúlyos kutyacsoportok összehasonlítására az éhomi, illetve az étkezés utáni időpontban. Jelentőségi szint P 3. táblázat. Diszkrimináns metabolitok sovány és túlsúlyos Labrador Retriever kutyák között étkezés utáni vizeletben.

Vita

Ebben a tanulmányban NMR-alapú metabolomikát használtunk a vizelet metabolitprofiljának elemzésére egészséges hím Labrador Retriever kutyákban a takarmány-provokációs teszt során. Világos különbséget találtunk az éhgyomri és az étkezés utáni vizeletminták között, bizonyítva, hogy ez a módszertan vizeletanalízishez használható, amikor metabolikus eseményeket vizsgálnak kutyák táplálékfelvételére reagálva. Ezenkívül többváltozós modellezéssel szignifikáns különbségeket észleltek a sovány és túlsúlyos kutyák metabolizmusában az étkezés után, az éhomi vizeletben azonban nem. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a túlsúlyhoz és az elhízáshoz kapcsolódó metabolikus változások a kutyáknál az étkezés utáni időszakban hangsúlyosabbak lehetnek, mint az éhomi eseményekben, ami összhangban van az emberi vizsgálatok általános eredményeivel [21, 22]. Például Krug és mtsai bebizonyították, hogy a normális éhgyomri állapotban nem megfigyelhető diszkrét metabotípusok felfedhetők az egészséges önkéntesekben különböző metabolikus kihívások után [22], Pellis és mtsai pedig képesek voltak azonosítani az étkezés utáni plazmában az elhízással kapcsolatos metabolikus változásokat, amelyek nem voltak kimutathatóak éheztetett, zavartalan körülmények [21].

Tanulmányi korlátozások

Következtetések

Ez a tanulmány kimutatta, hogy az NMR-alapú metabolomika meg tudja különböztetni az étkezés utáni 3 órás vizeletet az éhgyomri vizelettől, és így felhasználható a metabolikus események értékelésére a kutyák táplálékfelvételére reagálva. A takarmánykihívás után különbségeket találtunk a vizelet metabolitprofiljaiban a sovány és túlsúlyos kutyák között, mind a lipid, mind a fehérje anyagcseréjéhez kapcsolódva. E különbségek többsége éhomi körülmények között nem volt kimutatható, ami arra utal, hogy az étkezés utáni vizelet metabolitjai hasznosabbak lehetnek, mint az éhgyomri metabolitok, a kutyák túlsúlyához és elhízásához kapcsolódó metabolikus változások azonosításához. A túlsúlyos kutyákban észlelt alacsonyabb vizeletbeli taurin-koncentráció a lipid anyagcserében bekövetkezett változásokat jelezheti, ezért a túlsúlyos kutyákban a taurin további vizsgálatokat érdemel.