A testzsír eltűnése normál patkányokban, amelyet adenovírus által közvetített leptin génterápia indukál

8 ng/ml tartós hiperleptinémiát indukáltunk 28 napig normál Wistar patkányokban, patkány leptin cDNS-t (AdCMV-leptin) tartalmazó rekombináns adenovírus infúziójával. A hiperleptinémiás patkányok táplálékfelvétele 30-50% -kal csökkent, és a kísérleti időszak alatt csak 22 g-ot gyarapított, szemben a kontroll állatokban, akik sóoldatos infúziót vagy rekombináns vírust tartalmaztak β-galaktozidáz gént (AdCMV-βGal), a kísérleti időszakban csak 22 g-ot. A hiperleptinémiás patkányokban a testzsír hiányzott, míg a hiperleptinémiás patkányokkal párosított kontroll patkányokban a testzsír ~ 50% -ot tartott meg. Továbbá, a plazma trigliceridek és az inzulinszintek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a hiperleptinémiás és a páros táplálású kontrolloknál, míg a zsírsav- és glükózszintek hasonlóak voltak a két csoportban, ami a hiperleptinémiás állatok fokozott inzulinérzékenységére utal. Így, annak ellenére, hogy a hiperleptinémiás és a páros táplálékkal ellátott állatoknál csökkent az étkezés és a súlygyarapodás egyenértékű csökkenése, az azonosítható zsírszövetet csak az előbbi csoportban teljesen ablálták, felvetve a leptin specifikus lipoatrofikus aktivitásának lehetőségét.

génterápia

Az ob/ob egerek elhízása az ob gén mutációja által okozott leptinhiány következménye (1), és drámai módon reagál az intraperitoneálisan beadott rekombináns leptinnel végzett injekciós terápiára (2–4). Normál sovány patkányokban a magas leptinszint hatása kevésbé egyértelmű; a hormon nagy dózisai csökkentették a táplálékfelvételt és a testsúlyt, de a hatás kevésbé volt feltűnő, mint a leptinhiányos ob/ob egereknél (2, 4).

A krónikus hiperleptinémia normális állatokban kifejtett hatásainak teljesebb felmérése érdekében megvizsgáltuk a normál patkányok táplálékfelvételét és testtömegét, amelyeknél a rekombináns adenovírus által közvetített génszállítás a plazma leptinszintjének tartós 6-10-szeres növekedését váltotta ki. . 28 napig vizsgált hiperleptinémiás patkányokban 30% -os csökkenést figyeltünk meg a táplálékfelvételben és a testtömeg-növekedés virtuális leállását kísérte a durván azonosítható zsírszövet eltűnése. Szigorú ellentétben a páros táplálású kontrollokban a zsírraktárak csak részleges csökkenése következett be a hasonló mértékű fogyás ellenére.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Patkányleptin klónozása és expressziójának mérése reverz transzkriptáz – PCR segítségével.

A teljes RNS-t 1 g epididymális zsírszövetből (cDNS klónozáshoz) vagy 0,5 g májból (leptin expresszió mérésére) állítottuk elő patkányokból TRIzollal (Life Technologies, Gaithersburg, MD) történő extrakcióval, a gyártó protokolljának betartásával. Oligo-dT-t használtunk az első szálú cDNS-szintézis megkezdéséhez, cDNS-szintézis készlet (CLONTECH) alkalmazásával. Miután az első szál cDNS-t DNáz-mentes RNázzal kezeltük, a leptin génterméket PCR-rel amplifikáltuk upstream sense primer 5′-GGAGGAATCCCTGCTCCAGC-3 ′ és downstream antiszensz primer 5′-CTTCTCCTGAGGATACCTGG-3 ′ alkalmazásával, a patkány leptin génje alapján. (5) szekvencia. Mind a cDNS klónozás, mind a leptin mRNS mérése céljából az amplifikációt egy ciklus alkalmazásával hajtjuk végre 3 percig 94 ° C-on, majd 35 ciklust követünk 92 ° C-on 45 másodpercig, 54 ° C-on 45 másodpercig és 72 ° C-on 1 percig, majd végső meghosszabbítás 70 ° C-on 10 percig. Az RNS minőségének kontrolljaként a β-aktin expresszióját is mértük, ugyanazokkal az amplifikációs feltételekkel, mint a leptin és egy korábban leírt oligonukleotidpár (6).

Rekombináns adenovírus előállítása.

A teljes leptint kódoló régiót tartalmazó 640 bp-os PCR-fragmenst a gyártó protokollja szerint ligáltuk a pCR TM 2.1-hez (Invitrogen). A szekvenciaelemzés megerősítette, hogy több klón tartalmazta az intakt leptin cDNS-t. Egy BamHI- és Xbal-korlátozott leptin cDNS-fragmenst, amely 60 bp 5'-nem transzlált régiót és 76 bp 3'-nem-transzlált régiót tartalmazott, ligáltunk hasonlóan kezelt pACCMVpLpA-hoz (7). A kapott plazmidot pJM17-gyel (8) együtt transzfektáltuk 293 sejtbe kalcium-foszfát/DNS együttes kicsapással, hogy előállítsuk az új rekombináns vírust, amelyet AdCMV-leptinnek nevezünk, a korábban leírt módszerekkel (9). A vírus DNS-t izoláltuk, és a leptin gén inzert jelenlétét PCR-rel igazoltuk a fent leírt primerek alkalmazásával, valamint Southern-blottolással oligonukleotiddal (5′-CGGATACCGACTGCGTGTGTGAAATGTCAT-3 ’), amely komplementer a patkány leptin cDNS-jével. Az AdCMV-leptin készleteit amplifikáltuk és tisztítottuk (9) szerint, és -70 ° C-on PBS-ben tároltuk 0,2% BSA-val és 10% glicerinnel 1-3 × 1012 plakkképző egység/ml koncentrációban. Előkészítettünk egy olyan vírust, amely a bakteriális β-galaktozidáz gént tartalmazta a citomegalovírus promoter (AdCMV-βGal) irányítása alatt (10).

Sejtkultúra.

Emberi embrionális vese 293 sejtet szaporítottunk 60 mm-es (kotranszfekcióhoz) vagy 150 mm-es (vírusállományok amplifikálásához) tenyésztő edényekben Dulbecco módosított Eagle-táptalajában (DMEM), kiegészítve 10% marha magzati szérummal, 100 egység penicillinnel/ml és 10 μg sztreptomicin/ml 37 ° C-on/5% CO2-nál. Az összes tápközegkomponens a GIBCO/BRL volt.

Állatok.

A hím Wistar patkányokat a Charles River Breeding Laboratories cégtől szereztük be. Az adenovírus infúziós vizsgálatok előtt minden patkány standard patkány chow-t kapott (Teklad F6 8664; Teklad, Madison, WI) ad libitum és szabadon hozzáférhetett a vízhez. A „páros táplálású” állatokat ugyanannyi táplálékkal látták el, mint amennyit az AdCMV-leptinnel infúzióban kezelt állatok naponta bevittek a 2A. Ábrán bemutatott kísérletek során.

Plazma leptin, táplálékfelvétel és testtömeg. A plazma leptinszintet (A), a táplálékfelvételt (B) és a testtömeget (C) Wistar patkányokon mértük, amelyek AdCMV-leptin, AdCMV-βGal vagy fiziológiás sóoldat infúzióit kapták, és Wistar patkányokban, páronként AdCMV-leptinhez táplálva. -infúziós patkányok. Az értékek átlag ± SEM értéket jelentenek négy állat esetében minden csoportban.

Vírusinfúzió normál Wistar patkányokban.

A polietilén csövet (PE-50; Becton Dickinson) 9 hetes, ~ 250-300 g Wistar patkányok bal nyaki artériájában rögzítették nátrium-pentobarbitális érzéstelenítésben (50 mg/kg; Abbott) és szubkután alagúton keresztül exteriorizálták. Az állatokat kabátba helyeztük, és a csöveket összekötöttük egy hevederrel és egy forgócsappal (Harvard Bioscience, South Natick, MA). A csöveket heparinizált sóoldattal (1000 egység/dl) töltöttük, amíg a vírus infúziója meg nem kezdődött 3 nappal a műtét után. Az infúzió előtt az adenovírus mintákat sóoldatban szuszpendáltuk, és 0,2 μm-es szűrőn átszűrtük. Két milliliter AdCMV-leptint vagy AdCMV-βGal-t, amelyek összesen 1 × 10 12 plakkképző egységet tartalmaznak, vagy második kontrollként 2 ml sóoldatot önmagában, 10 perc alatt infundáltuk az eszméleténél lévő állatokhoz. Az állatokat egyedi anyagcsere-ketrecekben (Nalgene) vizsgáltuk, és naponta mértük a táplálékfelvételt és a testtömeget.

Plazma mérések.

Vérmintákat gyűjtöttünk a farokvénából EDTA-val bevont kapilláris csövekbe, hetenként, az adenovírus infúziója után 72 órával. A plazmát -20 ° C-on tároltuk a leptin-vizsgálatig. A plazma leptint a Linco leptin assay készlet (Linco Research Immunoassay, St. Charles, MO) alkalmazásával vizsgáltuk. A plazma inzulint standard módszerekkel vizsgáltuk. A szabad zsírsavakat (FFA) egy készlettel mértük a gyártó ajánlásai szerint (Boehringer Mannheim).

A szövet előkészítése.

Valamennyi állatot nátrium-pentobarbitális altatásban leöltük. A szöveteket azonnal feldaraboltuk, sterilizált és jéghűtéses 10 mM foszfát-puffer sóoldattal mostuk és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A szöveteket az RNS extrakciójáig -70 ° C-on tartottuk.

Morfológia.

A perfundált pancreata Bouin fixált, paraffinba ágyazott sorozatait hematoxilin/eozinnal festettük és fénymikroszkóppal vizsgáltuk.

EREDMÉNYEK

Leptin mRNS szint a májban.

Az intakt rágcsálóknak beadott rekombináns adenovírusokkal végzett korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a riporter gén expressziójának> 99% -a megtalálható a májban (10). Ezen megállapítás alapján megvizsgáltuk a leptin gén expresszióját normál 9 hetes Wistar patkányok májmintáiban, amelyek intravénás katéteren keresztül vagy AdCMV-leptin vírus, vagy kontrollként az AdCMV-βGal vírus infúzióját kapták. a bakteriális β-galaktozidáz génje. Huszonnyolc nappal a vírus infúziója után a leptin mRNS nem volt kimutatható AdCMV-βGal-nal kezelt állatokban, de erősen expresszálódott AdCMV-leptinnel kezelt patkányok mintáiban (1. ábra). Így a leptin transzgén hatékonyan expresszálódott a májban, és ez a szövet volt a leptin termelésének valószínű helye az ezt követő vizsgálatokban.

A leptin mRNS expressziója a májban. A patkányokat rekombináns adenovírusokkal infundáltuk, amelyek a patkány leptin cDNS-jét (AdCMV-leptin) vagy a β-galaktozidáz gént (AdCMV-βGal) tartalmazták. A májmintákat a vírusinfúzió után 28 nappal gyűjtöttük össze, és a leptin és a β-aktin mRNS expressziójának reverz transzkriptáz-PCR analízisének vetettük alá. A leptin mRNS-t csak az AdCMV-leptinnel kezelt állatok májmintáiban mutatták ki.

Plazma-leptin szintek.

Az átlagos plazma leptinszint az AdCMV-βGal-nal kezelt állatokban és a sóoldattal infúziós állatokban átlagosan 0,8 ± 0,2, illetve 1,5 ± 0,2 ng/ml volt. Az AdCMV-leptinnel kezelt patkányokban ezzel szemben az átlagos plazma leptinszint 3 napon belül 8 ± 0,4 ng/ml-re emelkedett, és ezen a szinten vagy annak közelében maradt a megfigyelés 28 napja alatt (2A. Ábra).

Az elsődleges hiperleptinémia hatása az élelmiszer-bevitelre és a testtömegre.

A test megjelenése és a zsírraktárak hiánya hiperleptinémiás patkányokban. A teljes test megjelenését (felső) és az epididymális zsírt a boncolt állatokban (alsó) összehasonlítottuk sóoldatban (kontroll), AdCMV-leptinnel és AdCMV-βGaL infúzióval ellátott patkányokban, valamint AdCMV-leptinnel kezelt állatokban párosított patkányokban. . Az epididymális zsírraktárakat nyilakkal azonosítják (alsó). A fényképek csoportonként négy állat eredményeit reprezentálják.

Plazma glükóz, inzulin és FFA szintek.

A megemelkedett FFA-szintekről ismert, hogy inzulinrezisztenciát okoznak (11–14), és serkentik az inzulin szekrécióját (15). Mivel a zsírszövet eltűnése hiperleptinémiás patkányokban megszünteti a plazma FFA fő forrását, összehasonlítottuk a plazma FFA, a glükóz és az inzulin szintjét a különböző csoportokban a farokvénából származó vérmintákban 1200 és 1400 óra között. Huszonnyolc nappal az AdCMV-βGal vagy sóoldatos infúzió után az FFA-szint átlagosan 0,75 ± 0,1, illetve 0,80 ± 0,1 mM volt. A plazma trigliceridek (TG) ezekben a csoportokban átlagosan 111 ± 21, illetve 101 ± 9 mg/dl voltak. Hiperleptinémiás patkányokban a testzsír eltűnése után az FFA átlagosan 0,34 ± 0,03 mM, a TG pedig átlagosan 29 ± 4 mg/dl. Pár etetésű hipoleptinémiás patkányokban az FFA átlagosan 0,38 ± 0,03 mM, a TG pedig átlagosan 58 ± 12 mg/dl. A vércukorszint minden csoportban normális volt. A hiperleptinémia előtt átlagosan 28 ± 4 mikron/ml értékű plazma inzulin 28,4 napon 8,4 ± 1 mikrot/ml volt, ami feltehetően a célszövetek nagyobb érzékenységét tükrözi az inzulin hatására. Az inzulinszint kisebb mértékben csökkent a páros táplálású kontrollokban (18,4 ± 6,0 mikroliter/ml). Ezeket az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze.

Plazma TG-, FFA-, glükóz- és inzulinszintek AdCMV-leptin- és AdCMV-βGal-infúziós Wistar patkányokban a vírus infúziója előtt és után, sóoldattal infúziós kontrollokban és normális patkányokban, amelyek AdCMV-leptin-infúziójú patkányokban párosak

Hasnyálmirigy morfológia.

A plazma inzulin csökkenése hiperleptinémiás patkányokban vagy az inzulin hatásának javulását tükrözheti az alacsony FFA szint miatt, vagy a markáns hiperleptinémia okozta β-sejt károsodást. Az AdCMV-leptinnel infúziós vagy kontroll patkányokból vett hematoxilin/eozinnal festett hasnyálmirigy-szakaszok szigeteinek vizsgálata nem mutatott morfológiai különbségeket.

VITA

A jelenlegi tanulmányban rekombináns adenovírus technológiát alkalmaztunk a hiperleptinémia normális állatokban kifejtett hatásainak bemutatására. Míg az a megállapítás, hogy a megnövekedett keringő leptinszint csökkent táplálékfelvételt és testtömeg-növekedést eredményez a normoleptinémiás kontrollokhoz képest, összhangban van a korábbi munkával (2–4), a hatás nagysága nem volt várható, és nem tulajdonítható az alacsonyabb étel hatásainak. önmagában. A látható testzsír teljesen eltűnt az AdCMV-leptin állatokban, ezt a megállapítást nem közelítették meg azoknál az állatoknál, akiket páros táplálásban használtak a hiperleptinémiás csoporttal.

Feltételezzük, hogy ez a különbség a hiperleptinémia termogén hatásának eredménye (3), de felveti a szabályozatlan hiperleptinémia specifikus hatásának lehetőségét az adipociták zsírraktározására. Ezenkívül, míg a hiperleptinémiás és a páros táplálékkal kezelt állatokban az FFA szint hasonlóan csökkent a két kontrollcsoporthoz (AdCMV-βGal vagy sóoldattal infúzióban beadott állatok) képest, és a glükózszint minden állatban normális maradt, a hiperleptinémiás állatokban a plazma inzulin és TG szintek, mint a párosan etetett állatok vagy a kontrollok. Ezek az eredmények alátámasztják azt a nézetet, hogy a zsírraktárak relatív rezisztenciája a táplálékfelvétel terápiás korlátozásával szemben az emberi elhízás esetén leptinpótlással enyhíthető, amint azt korábban javasolták (1).

A hiperleptinémiás patkányok alacsony TG- és FFA-értéke a megnövekedett inzulinérzékenység bizonyítékaival társult, ami a normál vércukorszintben nyilvánul meg annak ellenére, hogy a plazma inzulinszintje 60% -kal csökkent. A TG szerényebb csökkenése a páros táplálású kontrollokban és a normál zsírraktárak ~ 50% -ának megtartása az inzulinszint sokkal kisebb csökkenésével járt, mint a hiperleptinémiás patkányokban. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az inzulinérzékenység összefügg a szövetzsír szintjével, és összhangban állnak azzal a ma általánosan elfogadott nézettel, miszerint a fokozott szöveti FFA zavarja a glükóz metabolizmusát (11–14) és növeli az inzulinszekréciót (15, 16). Ebben a tanulmányban nem magyarázzák azt a mechanizmust, amely révén a plazma FFA a „lipoatrophiás” hiperleptinémiás patkányokban ugyanazon a szinten marad, mint a páros táplálású kontrollokban. Talán ez a lipolízis magas arányát tükrözi a maradék zsírsejtekben, amelyeket még nem teljesen ürítettek ki a zsírból.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Dr. Daniel Foster, Scott Grundy és J. Denis McGarry a kézirat kritikai olvasásáért, Kay McCorkle, Donna Lehman és Falguni Trieu a kiemelkedő technikai támogatásért. Doris Himelrick, Kay Naughton és Susan Kennedy titkársági segítséget nyújtott. Ezt a munkát a National Institutes of Health Grants DK02700-37 és a P50H2598801, a National Institute of Health/Juvenile Diabetes Foundation Diabetes Interdiszciplináris Kutatási Program támogatása és az Veteránügyi Főosztály Intézményi Kutatási Támogatásának támogatása SMI 821–109 támogatta. R.O. támogatja az American Physiological Society/Genentech Inc. ösztöndíj.

Lábjegyzetek

Whom Kinek kell kinyomtatni az újranyomtatási kérelmeket: Gifford Laboratories for Diabetes Research, Y8.212 terem, Texasi Egyetem délnyugati orvosi központja, Dallas, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75235-8854.

Rövidítések: FFA, szabad zsírsav (ok); TG, triglicerid (ek).