Az alacsony zsírtartalmú étrendre való áttérés javítja az elhízott egerek akut limfoblasztos leukémiájának kimenetelét

Absztrakt

Háttér

Egyre felismertebb, hogy a testsúly és a táplálkozási állapot befolyásolhatja a rák túlélését. Korábban kimutattuk, hogy az elhízott, szingenikus akut limfoblasztos leukémiában (ALL) szenvedő egerek gyengébben reagálnak a kemoterápiás kezelésre, mint a kontroll egerek. Ezért megvizsgáltuk, hogy az étrendi beavatkozás javíthatja-e a leggyakoribb gyermekrák, az ALL kimenetelét.

Mód

A diétával indukált elhízott (DIO) egereknek 60% kalóriatartalmát nevelték fel a zsíros étrendből, és a kontroll egereket szingenikus ALL sejtekkel ültették be. Néhány DIO egeret alacsony zsírtartalmú étrendre váltottak. Az ALL-ből való túlélést kemoterápiás kezelés nélkül vagy azzal együtt értékelték a diéta váltásakor. A DIO egerek sejtjeit az étrend váltása előtt és után az FACS segítségével megvizsgáltuk az AKT, az S6K és az EIF2a BrdU beépülését és foszforilációs állapotát. Hasonló kísérleteket végeztek humán ALL xenograftokkal. Az egér és az emberi ALL sejteket 10% vagy 5% szarvasmarha-magzati szérummal tenyésztettük, és értékeltük a kemoterápiákkal szembeni érzékenységet.

Eredmények

A DIO egerek gyengébb túlélést (17%) kaptak a vinkristin monoterápia után, mint a kontroll egerek 10% alacsony zsírtartalmú étrendben (42%; n = 12/csoport; o = 0,09, log rang). Az elhízott egerek átállítása az alacsony zsírtartalmú étrendre a vinkrisztin megkezdése előtt drámai módon javította a túlélést (92%, o Az l-aszparagináz, az étrendi váltás nem javította a monoterápiában egyik gyógyszerrel kezelt DIO egerek túlélését. Így úgy tűnik, hogy az étrendi beavatkozásnak egyedülálló hatása van az ALL sejt érzékenységének javítására a vinkrisztinnel szemben in vivo.

Következtetések

Itt közöljük, hogy egy diétás beavatkozás javíthatja az összes eredményt egy preklinikai modellben. További munkára van szükség e hatás mechanizmusainak azonosításához és a betegek humán leukémiára gyakorolt lehetséges hatásainak vizsgálatához.

Háttér

Az elhízás növeli számos ráktípus előfordulását, és az elhízott rákos betegeknél nagyobb a kockázatuk a betegségük miatt bekövetkező halálozásnak [1]. 2007-ben két nagy kohorsz retrospektív áttekintése kimutatta, hogy a diagnózis idején az elhízás 50% -kal növeli a relapszus kockázatát a Nemzeti Rákkutató Intézet/Róma magas kockázatú akut limfoblasztos leukémiában (HR-ALL) szenvedő gyermekeknél [2]. metaanalízissel megerősítve [3]. Külön csoportban beszámoltunk arról, hogy az elhízott gyermekek 2,74-szer nagyobb valószínűséggel voltak minimális reziduális betegség (MRD) pozitívak [4], ami a megnövekedett relapszus kockázatát és az eseménymentes túlélés csökkenését jelzi [5]. Sőt, a legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy minden ALL-ből 3 gyermek közül 1 túlsúlyos vagy elhízott volt a diagnózis felállításakor [6, 7].

Nagy figyelmet fordítottak az étrendnek a rák kimenetelében betöltött szerepére. A metaanalízis kimutatta, hogy a magas színvonalú étrendet fenntartó rákos túlélők általános halandósága alacsonyabb, bár a rák kiújulásának nincs jelentős csökkenése [8]. Kevésbé világos, hogy az étrendi beavatkozás a rákkezelés során javíthatja-e az eredményt. A kalóriakorlátozás nagy figyelmet kapott ebben a térségben, mivel a PI3K/Akt/mTOR tengely aktiválásával hatékonyan képes csökkenteni az inzulinszerű 1-es növekedési faktort (IGF-1), amely stimulálja a sejtek anyagcseréjét [9, 10]. A nem transzformált sejtek erre az alacsony tápanyagszintre reagálnak az mTOR aktivitás csökkentésével és nyugalmi állapotba lépéssel, amely megvédheti őket néhány kemoterápiától; a rákos sejtek azonban gyakran mutatják a PI3K/Akt/mTOR konstitutív aktiválódását [11]. Ez a konstitutív aktiváció nem modulálható tápanyag-korlátozással, ami a rákos sejtek visszatartott vagy fokozott kemoszenzitivitásához vezet [12, 13]. Valószínűleg további mechanizmusok is hozzájárulnak a kalória-korlátozás jótékony hatásaihoz, ideértve az üzemanyag-rendelkezésre állás csökkenését, a gyulladás csökkentését és az alacsonyabb oxidatív stresszt [9, 14].

Kidolgoztunk egy egérmodellt, amely összefoglalja azt a klinikai megfigyelést, miszerint az elhízott gyermekeknek rosszabb az ALL eredménye; a magas zsírtartalmú étrend-indukált elhízott (DIO) egerekbe, amelyekbe szingenikus ALL-t ültettek be, a vinkristinnel (VCR) vagy az l-aszparaginázzal végzett kezelést követően gyengébb volt a túlélési eredmény [15, 16]. Az azonban, hogy az elhízás hatása az egerek vagy betegek ALL-kimenetelére visszafordítható-e, továbbra sem ismert. Míg a kalóriakorlátozás kimutatta, hogy javítja a kemoterápia hatékonyságát a szilárd daganatok egérmodelljeiben [12], a leggyakoribb gyermekkori rákban, az akut limfoblasztos leukémiában nem tesztelték. Ezért úgy terveztük meg a jelen tanulmányt, hogy teszteljük, javíthatja-e az étrendi beavatkozás az elhízott egerek ALL eredményét.

Mód

Sejtkultúra

Az egér pre-B ALL sejtjeit korábban izoláltuk egy BCR/ABL transzgénikus egérből („8093 sejt” [17]), és GFP-vel transzdukáltuk. Az emberi leukémia sejtvonalak közé tartozott a BV173 (pre B Ph + ALL, ATCC) és a Nalm-6 (B sejt prekurzor leukémia, ATCC). A sejteket az Arizonai Egyetem Genetikai magja hitelesítette 2016 novemberében, és negatívnak bizonyult mikoplazma szempontjából. Nyolcezer kilencvenhárom sejtet tenyésztettek McCoy 5A táptalajában (Invitrogen), kiegészítve 1 mM nátrium-piruváttal, 2 mM Glutamax-szal, 10 μg/ml gentamicinnel és 5% vagy 10% FBS-sel (Denville Scientific vagy Omega Scientific). Az emberi sejtvonalakat RPMI 1640-ben (Invitrogen) tenyésztettük, a fentiek szerint kiegészítve. A kemoterápiás érzékenységi kísérleteket 72 órán keresztül végeztük, a túlélő életképes sejteket vakon megfigyelők három példányban, tripánkék kizárással, manuálisan vagy Countess II-vel (ThermoFisher) számlálták. A LAX7 sejtek páciens eredetű, normál kariotípusú ALL sejtek, amelyeket NSG egereken (az alábbiakban ismertetett egerek) való áthaladással tágítottak és xenograftként használtak [18]. A sejteket OP-9 sztrómasejteken tenyésztettük 20% FBS-sel, 100 NE/ml penicillinnel és 100 μg/ml sztreptomicinnel kiegészített αMEM-mel.

Egér modellek

A magas zsírtartalmú étrend okozta elhízott (DIO) és a kontroll C57Bl/6J egereket a Jackson Laboratories-tól (Bar Harbor, MI, USA) vásároltuk. Az egereket 60% (elhízott) vagy 10% (kontroll) kalóriával nevelték a zsírtartalmú étrendből (Research Diets, D12492, illetve D12450B). Mivel a nőstény egerek ebben a modellben nem válnak annyira elhízottá, és nem állnak rendelkezésre, mint a Jackson Laboratories DIO egerei, ezekhez a vizsgálatokhoz csak hím egereket használtak. Hím NSG egerek (NOD.Cg-Prkdc szidás Il2rg tm1Wjl/SzJ) a NOD/SCID IL2-receptor gamma lánc kiütő egerek, amelyeket általában xenograftként használnak. Az NSG egereket elhízottá tették szelektív selejtezés és magas zsírtartalmú étrend alkalmazásával, a korábban leírtak szerint [19].

MINDEN túlélési kísérlet

Az összes implantációs kísérletet DIO és kontroll egereken végeztük

20 hetes kor. Ekkor 10 000 GFP + pre-B-sejtes ALL 8093 sejtet implantáltak retro-orbitálisan. Az ALL beültetés után 6 vagy 7 nappal, a kísérlet függvényében, a DIO egereket randomizáltuk, hogy folytassák a magas zsírtartalmú étrendet, vagy átálltak a kontroll étrendre (10% zsírkalória, ad libitum esetén). Néhány kísérletben a vinkristinnel (0,5 mg/kg/hét intraperitoneális) történő monoterápiát a 7. napon kezdték, és ezt az adagot minden héten a testtömeghez igazították. Hasonló kísérleteket végeztek l-aszparaginázzal (800 NE/kg/nap, hétfő – péntek) vagy dexametazonnal (8 mg/kg/nap, hétfő – péntek). Más kísérletek során DIO és kontroll NSG egereket ültettek be LAX7 sejtekbe, és 17 napos beültetési periódus után a DIO egerek fele átállt a kontroll étrendre. A 18. napon vinkristinnel, l-aszparaginázzal és dexametazonnal kezelték (ugyanazok az adagok, mint fent), és 4 hétig folytatták. Az összes túlélési kísérletben az egereket naponta ellenőrizték a táplálékfelvétel és a testsúly szempontjából, valamint a progresszív leukémia kialakulását (bénulás, görnyedt testtartás, tapintható tömeg> 1 cm, rossz ápolás stb.), Ekkor eutanizálták őket.

Szövetbegyűjtés és áramlási citometria

Adatelemzés

Kaplan Meier túlélési görbéket készítettünk és összehasonlítottunk Cox regresszióval. A táplálékfelvételt kézzel mértük egérketrec segítségével, és napi átlagként vagy háromnapos mozgóátlagként jelentettük, az eredmények szerint. Az életképes sejteket és a BrdU-val vagy más antitestekkel jelölt sejtek arányát összehasonlítottuk az étrend-váltó és a DIO egerek között kétoldalas, páros t-tesztek segítségével. Az EC50-érték kiszámításához normalizált dózis-válasz adatokat illesztettünk az alábbi egyenletbe: \ (\% életképes sejtek = \ frac ^> \). Minden elemzést a GraphPad Prism és a Microsoft Excel alkalmazásával hajtottunk végre.

Eredmények

Az étrend korlátozása az összes sejtet érzékennyé teszi a vinkrisztinnel szemben

Annak eldöntésére, hogy az étrend váltása javíthatja-e az ALL kezelés eredményét, 16 DIO és 8 nem elhízott kontroll egeret ültettünk szingenikus ALL sejtekkel (0. nap; 1a. Ábra). A 7. napon a DIO egerek felét alacsony zsírtartalmú étrendre cserélték, míg a többit a szokásos étrenden folytatták (végső n = Csoportonként 8). Ezeknek az egereknek az étrend nem befolyásolta a progresszív ALL-ig eltelt időt (1b ábra). Más egércsoportokban a VCR-t a 7. napon kezdték el, és a VCR-dózist hetente állították be a testtömeg alapján. Ebben a kísérletben az alacsony zsírtartalmú étrendre váltott DIO egerek élték meg a legjobban, ami lényegesen jobb volt, mint a magas zsírtartalmú étrenden tartott egereknél (o 1. ábra

Az állatok étrendi korlátozása nagyszámú hormonális, fizikai, fiziológiai és anyagcsere-változáshoz vezet, amelyeket in vitro nem lehet teljesen modellezni. Az FBS korlátozása azonban szimulálhatja a növekedési faktorok csökkenését, amely a kalóriakorlátozással és a súlycsökkenéssel figyelhető meg. Az FBS-koncentráció csökkentése növelte a VCR citotoxicitását (2a. Ábra); az FBS 5% alatti koncentrációja azonban rontotta a sejtek növekedését és életképességét. Ezért 5% FBS-t használtunk, amely nem befolyásolta szaporodási sebességüket, de lényegesen érzékenyebbé tette őket a VCR-re (2b. Ábra, c). Hasonló VCR-szenzibilizációt figyeltünk meg humán ALL sejtvonalakon, a BV173 és a Nalm6 esetében is (2d – f. Ábra).

Az étrend korlátozása nem változtatja meg az l-aszparaginázra vagy a dexametazonra adott összes választ in vivo

Hasonló ALL túlélési kísérleteket végeztek a fentiek szerint, de l-aszparagináz vagy dexametazon monoterápiát alkalmaztak a 7. naptól kezdve. A diétaváltásnak nem volt kimutatható hatása a túlélésre ezekben a kísérletekben (3a., B. Ábra). Az FBS-restrikció növelte a 8093 sejt érzékenységét a dexametazon iránt (EC50 9,1 ± 2,3 vs. 16,3 ± 3,7 nM, o = 0,02), és hajlamos volt növelni az l-aszparagináz iránti érzékenységet (EC50 0,80 ± 0,22 vs. 1,30 ± 0,21 NE/ml, o = 0,13; 3c., D) ábra, de az Ara-C-re vagy a daunorubicinre nem (1. kiegészítő fájl: S1. Ábra). Ezenkívül a vinkristin, l-aszparagináz és dexametazon (VDL) kombinációjával kezelt humán ALL xenograftolt NSG egerekkel végzett túlélési kísérletek azt mutatták, hogy az étrendben korlátozott egereknek nem volt különbségük a DIO vagy a kontroll egerek túlélésében (2. kiegészítő fájl: ábra S2). Tehát az étrendi korlátozás hatása az ALL szenzibilizálására az in vivo kemoterápiás kezelésre viszonylag specifikusnak tűnik a VCR-re.

Az étrend korlátozása nem érzékenyíti az egér ALL sejtjeit a dexametazonra vagy az l-aszparaginázra. a, b Az egerek túlélése a dexametazonnal kezelt étrendcsoportokban (a, n = 5–6) vagy l-aszparagináz (b, n = 6). c, d Életképes sejtek 72 óra elteltével tenyésztő táptalajban 5 vagy 10% FBS-sel önmagában vagy 70 nM dexametazonnal (c) vagy 2,5 NE/ml L-aszparagináz (d), n = 3

Az étrend korlátozása nem változtatja meg a gazdasejt vagy az ALL sejtek sejtciklusának sebességét

Annak megvizsgálására, hogy az étrendi korlátozás megváltoztatja-e a sejtek érzékenységét a VCR-re az ALL vagy a gazdasejt ciklus sebességének megváltoztatásával, a sejteket DIO egerek csoportjaiból gyűjtöttük össze az étrend váltása előtt vagy után, 4 órával a BrdU injekciók után. Az ALL-et és a gazdasejteket FACS-szel elválasztottuk a DIO egerek lépétől és csontvelőitől az ALL beültetés után (minden diéta-váltás előtt), a 8. napon (1 nappal a diéta váltása után) vagy a 14. napon (7 nappal az étrend váltása után). Meghatároztuk a GFP + ALL sejtek százalékos arányát az S fázisban, és összehasonlítottuk az ugyanazon szövetekből származó GFP-gazdasejtekkel (splenociták vagy velősejtek). Az S fázisban lévő sejtek százalékos aránya magasabb volt a lép ALL sejtekben, mint a nem ALL sejtekben, de hasonló a csontvelőből származó ALL és nem ALL sejtek között (3. kiegészítő fájl: S3. Ábra). A diétaváltás egyik sejttípusban sem változtatta meg jelentősen ezt a százalékot.

Az étrend korlátozása nem változtatja meg az AKT jelátvitelt a gazda vagy az ALL sejtekben

Annak megállapításához, hogy az étrend korlátozása miként változtathatja meg a releváns intracelluláris jelátviteli utakat, az elhízott és elhízott diétás egerek lép- és velő eredetű sejtjeit (a fentiekben leírtak szerint) EIF2a/pEIF2a, AKT/pAKT és S6K/pS6K antitestekkel jelöltük, és áramlási citometria. Mindkét szövetből származó ALL sejteknél a legtöbb mintában magasabb volt ezeknek a fehérjéknek a foszforilációs szintje, mint a gazdasejtekben (3. kiegészítő fájl: S3. Ábra), ami megerősítette a rákos sejtek magasabb anyagcseréjét. Az étrendváltásnak azonban nem volt szignifikáns hatása ezen fehérjék egyikének foszforilációs állapotára sem a gazda, sem az ALL sejtekben.

Vita

Itt közöljük, hogy az elhízott egerek váltása magas zsírtartalmú étrendről alacsony zsírtartalmú étrendre 17 és 92% között javítja az összes túlélést a vinkrisztinkezeléssel. Ez az első olyan tanulmány, amelynek tudatában van egy étrendi beavatkozás tesztelése a hematológiai rosszindulatú daganat kezelésének kimenetelén.

Más tanulmányok azt értékelték, hogy az étrendi beavatkozás befolyásolhatja-e a szilárd rák kezelésének eredményét. Kimutatták, hogy a DIO egerek magas zsírtartalmú táplálékról alacsony zsírtartalmú étrendről történő átállítása a dacarbazinnal kezelt egereknél javítja a melanoma túlélését a dakarbazinnal kezelt egerekben [20]. A nagyon alacsony szénhidráttartalmú ketogén étrendet kezelhetetlen epilepsziában szenvedő betegeknél alkalmazzák, és csökkentik a vércukorszintjét, de emelkedik a keringő szabad zsírsavak és ketonok mennyisége [21]. Ezeknek a diétáknak 12 különálló egérrák-modellben [22] mutattak ki daganatellenes hatást, és ezeket a betegeknél értékelik. A koplalás és a rövid távú éheztetés szintén javította az egerekben a szilárd daganatok sokféle kezelésének kimenetelét [12]. Hogy ezek a diéták mennyire lesznek hatékonyak a rákos betegeknél, azt még várni kell.

Eredményeink összhangban vannak a retrospektív adatokkal, amelyek azt mutatják, hogy az elhízás visszafordítása összefüggésbe hozható javuló ALL-eredménnyel fiatalokban. Orgel és mtsai. Megfigyelték, hogy minden olyan betegnek, aki spontán fogyott és kezelése során elhízott kategóriából nem elhízott kategóriába változott, jobb volt a kimenetele, mint azoknak, akik elhízottak maradtak a kezelési kurzus> 50% -ánál [23]. Ezen megfigyelés és jelenlegi eredményeink alapján klinikai beavatkozási vizsgálatot indítottunk enyhe étrendi korlátozással és fokozott fizikai aktivitással újonnan diagnosztizált ALL-ben szenvedő gyermekeknél (IDEAL Weight in ALL Trial; NCT 02708108). Ez és hasonló tanulmányok kritikus jelentőségűek annak meghatározásában, hogy mely rákok reagálnak az étrendi beavatkozásokra, és mely specifikus beavatkozások melyik rák esetében működnek.

Míg a gyermekkori ALL kezelése a túlélés jelentős javulásához vezetett, még mindig vannak ilyenek

A gyermekek 8% -a, akik évente visszaesnek ettől a betegségtől [27]. Ezenkívül bizonyos ALL altípusú gyermekek, serdülők és felnőttek, valamint elhízott betegek fokozottan ki vannak téve a relapszus és a halálozás kockázatának. Tekintettel a jelenlegi kemoterápiás kezelések jelentős toxicitására, fontos alternatív megközelítéseket vizsgálni az ALL kimenetelének javítása érdekében további kemoterápiás szerek hozzáadása nélkül.

Következtetések

Az elhízott egerek ALL-ről történő átállítása a magas zsírtartalmú étrendről az alacsony zsírtartalmú étrendre lényegesen javította a túlélést a VCR-kezeléssel, bár nem l-aszparagináz- vagy dexametazon-kezeléssel. Azt a megállapítást, hogy egy diétás beavatkozás egy preklinikai modellben javíthatja az ALL kezelés kimenetelét, tovább kell vizsgálni, hogy annak potenciális hasznát mind elhízott, mind nem elhízott betegeknél értékelni lehessen.