A rapamicin heti adagolása javítja a túlsúlyt és a biomarkereket elhízott hím egerekben, magas zsírtartalmú étrend mellett

Sejt Stressz Biológia, Roswell Park Rák Intézet, Buffalo, NY, 14263 USA

Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Elm and Carlton sts, Buffalo, NY 14263, USA. Tel .: 716 845 3326; fax: 716 845 3944;

Sejt Stressz Biológia, Roswell Park Rák Intézet, Buffalo, NY, 14263 USA

Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Elm and Carlton sts, Buffalo, NY 14263, USA. Tel .: 716 845 3326; fax: 716 845 3944;

Összegzés

Bevezetés

Eredmények

A rapamicin hajlamos volt a testtömeg csökkentésére a HF-diéta során

A magas zsírtartalmú étrendben lévő hím egerek három csoportját i.p. injekciók a következő időszakos ütemtervekkel: R1 - 1,5 mg kg -1 hetente háromszor, minden második héten; R2 (heti menetrend) - 1,5 mg kg −1 hét −1; és R3 - 0,5 mg kg −1 hetente háromszor minden második héten (1. ábra). Ezeket az egércsoportokat HF táplálékkal etették 3 hónapig a jelenlegi vizsgálat megkezdése előtt (Kísérleti eljárások, előtörténet). Tehát a kezelés kezdetekor mindhárom kezelési csoport elhízott volt (1. ábra), és hasonló volt a kontroll HF diéta csoportjához (hasonlítsa össze a súlyokat a 0. héten az 1. ábrán). Amikor ez a kezelés elkezdődött (1. ábra), három rapamicinnel kezelt csoportban átmeneti csökkenés volt tapasztalható az abszolút testtömegben (1. ábra). Ezzel szemben a magas zsírtartalmú étrendben lévő kontrollegerek tovább híztak, amíg 8 hónap elteltével platóig nem jutottak (1. ábra és S1. Ábra, Támogató információk). A kísérlet végére az R2 csoportba tartozó egerek hajlamosak voltak kevesebbet súlyozni, mint a kontroll HF egerek (1. ábra). Statisztikailag szignifikáns, bár átmeneti csökkenés volt tapasztalható a súlygyarapodásban az R2 csoportban a HF kontrollcsoporthoz képest (S1 ábra, csillagokkal jelölt alátámasztó információ).

A rapamicin meghosszabbítja az elhízott hím egerek élettartamát

Az egyes rapamicinnel kezelt csoportok teljes túlélésének elemzése a HF kontroll egerekhez képest feltárta, hogy a rapamicinnel végzett heti kezelés (R2 ütemterv) jelentősen megakadályozta a kövér hím egerekben a HF-étrenden a morbiditást és a halált (2A. Ábra). Míg a magas zsírtartalmú étrendben lévő kontroll egerek 60% -a elhalt vagy feláldozott morbiditás miatt, az R2 csoport összes egere életben maradt. (A halál okát nem mindig határozták meg, ezért ezeket az adatokat nem közöljük). Nagy statisztikailag szignifikáns különbség volt (P = 0,0063) az R2 csoport egereinek teljes túlélésében a kontroll HF csoporthoz képest (2A. Ábra). Az elemzéshez vett mindhárom rapamicinnel kezelt csoport túlélési aránya szintén szignifikánsan magasabb volt a kontroll HF csoporthoz képest (P = 0,028, 2B. Ábra). Így jelentőséget értek el az R2 csoport és a három rapamicinnel kapott csoport együttesen, a HF csoporthoz viszonyítva. A kéthetente végzett alternatív kezelések (R1 és R3 csoport) hajlamosak voltak a túlélés növelésére, de statisztikailag nem volt szignifikáns (S2. Ábra, Támogató információk).

A p-S6 szintje a túlélő egerekben

Tizenegy hónapos kezelés után, amikor a HF kontrollcsoportban az egerek 60% -a elhunyt, a kísérletet leállítottuk a túlélő egerek vizsgálatára. Mindhárom rapamicinnel kezelt csoportban az egereket feláldoztuk 8 nappal az utolsó kezelés után, hogy kiküszöböljük a rapamicin közvetlen hatását a vizsgált paraméterekre. A tanulmányt a szívre és a májra összpontosítottuk. Korábbi jelentések rámutattak a szívre (a szívizomra), amely szintén nagyon fontos szövet a foszfo-S6 (Hua et al., 2011; Leontieva et al., 2012a, 2013b; Ramos et al., 2012; Flynn et al., 2013; Wu et al., 2013; Zhou et al., 2013). A szív az öregedés egyik leggyakrabban vizsgált szerve, és a rapamicin-kezelés javítja a szív állapotát. Ezenkívül a szív- és érrendszeri betegségek a leggyakoribb halálokok az emberekben. Fontos, hogy korábbi vizsgálataink a szívfoszfo-S6-ot a hosszú élettartam és az állatok hipertrófiájának lehetséges markereként feltételezik (Leontieva et al., 2013b) (Leontieva et al., 2012a; Flynn et al., 2013).

Az R2 csoportban a szív p ‐ S6 szintje statisztikailag alacsonyabb volt, mint a kontroll HF csoportban (3. ábra). A P ‐ S6 az mTORC1 aktivitását tükrözi, amelyről ismert, hogy részt vesz az öregedésben. Megmértük az AKT foszforilációját is az S473-nál, amely részben az mTORC2 aktivitás markere. A p-S6-tal szemben a p-AKT (S473) nem csökkent az R2 csoportban (3. ábra).

Kiértékeltük ezeket a paramétereket a májban is. Egyetértésképpen a máj p-S6 szintje szignifikánsan alacsonyabb volt az R2 csoportban a HF kontrollhoz képest. A szívekhez hasonlóan a p-AKT (S473) májszintjének tendenciája magasabb volt az R2 csoportban, bár ebben a vizsgálatban nem érte el a statisztikai különbséget (4. ábra). Figyelemre méltó, hogy a p-S6 és a p-Akt szintje a vesékben nem különbözött a kontroll és a rapamicinnel kezelt csoportokban, és a p-S6 és a p-Akt szorosan korrelált (S4. Ábra, Támogató információk).

2 éves hím egerek magas zsírtartalmú (HF) diétán: kontroll (HF - kezeletlen) vagy rapamicinnel kezelt (bemutatott R2 és R3 csoport - HF/R2, HF/R3). A számok az egereket jelzik. Az egyenlő terhelést a membrán Commassie Blue-val történő festésével is megerősítettük (S3. Ábra, Támogató információk). (B). A 4A. Ábrán bemutatott adatok mennyiségi elemzése. A p-S6 jel és a p-AKT (Ser473) jelének számszerűsített intenzitása átlag ± SE értékként jelenik meg.

A hetente kezelt egereknél nem voltak metabolikus rendellenességek

Vita

Az mTOR-t az inzulin, az IGF ‐ 1 és a gyulladásos citokinek (Zoncu et al., 2011; Cornu et al., 2012), amelyek mind a gyors öregedés és a rossz egészségi állapot jelzői. Ezenkívül az aktivált mTOR/S6K útvonal inzulinrezisztenciát okozhat (Khamzina et al., 2005; Krebs et al., 2007). Ezért a p ‐ S6 alacsonyabb éhomi szintje jelezheti a lassabb öregedést és az anyagcsere-egészséget. Vizsgálatunk valószínűleg alábecsülte a rapamicin pozitív hatásait, mert a metabolikus paramétereket csak 2 évesen életben maradt egereknél értékelték. Míg az R2 csoport összes egere túlélte a kísérlet végéig, a kontroll csoportban csak az egerek 40% -a élte túl. A kontroll HF csoportban a rövidebb élettartamú (definíció szerint kevésbé egészséges és gyorsabb öregedésű) egerek nem éltek túl, ezért nem vettek részt a p ‐ S6 és metabolikus paraméterek vizsgálatában.

Ez a tanulmány kiindulópont a rapamicin intermittáló ütemezésének további értékeléséhez, valamint az életük meghosszabbításának potenciáljának növeléséhez az adagok és a gyakoriság módosításával. A rapamicinnel történő időszakos kezeléssel meghosszabbított életet tovább fokozhatja az étrend, az antidiabetikus metformin (Anisimov et al., 2011a; Martin ‐ Montalvo et al., 2013) és lehetőség szerint testmozgás. Ezek a módszerek együttesen javíthatják az egészséget és növelhetik az idősödő emberek élettartamát.

Kísérleti eljárások

Valamennyi állatkísérletet a Roswell Park Cancer Institute Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának előírásaival összhangban végeztük.

Őstörténet [előző tanulmány (Leontieva et al., 2013c)]: A 9 hónapos hím egereket (C57BL/6NCr törzs) 5 csoportra osztottuk: az egyik csoport standard laboratóriumi (5% zsírtartalmú, alacsony zsírtartalmú) (LF) étrendet kapott. Négy másik csoport magas zsírtartalmú, 60% -os étrendben részesült (Research Diets, Inc., Cat # D12492, rágcsáló étrend 60% kCal% zsír; New Brunswick, NJ, USA) (HF) 3 hónapig. A HF-diéta ezen négy csoportja a következő volt: HF-csoport - kontroll (HF), az R1 csoport orálisan alacsony dózisú resveratrolt kapott; Az R2 csoport orálisan alacsony dózisú rapamunét kapott; és az R3 csoport resveratrol és rapamune kombinációját kapta, az előzőekben leírtak szerint (Leontieva et al., 2013c).

Jelenlegi tanulmány

Egy héttel az első vizsgálat befejezése után a kísérleti csoportokat (R1 – R3) rapamicinnel (LC Laboratories) kezelték i.p. injekcióval, a következő ütemezés szerint: az R1 csoport 1,5 mg kg -1-et kapott háromszor/héten/kéthetente; Az R2 csoportba minden héten 1,5 mg kg −1 hetet –1 injektáltak; és az R3 csoportnak 0,5 mg kg -1-et adtak be háromszor/hét/minden második héten. A kezelést 11 hónapig folytatták, és a súlyt hetente mérték. Az utolsó kezelés utáni nyolcadik napon az egereket egy éjszakán át éheztettük és felöltük. Vért gyűjtöttünk a nap végén, mielőtt az ételt egy éjszakai éhgyomorra eltávolítottuk volna. Másnap reggel éheztetett vért gyűjtöttek és egereket áldoztak fel. A biokémiai elemzéshez ennek megfelelően előállított és éheztetlen plazmát készítettünk.

A rapamicint (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) etanolban oldottuk 15 mg mL-1 koncentrációban (törzs), majd 0,15 mg mL -1-re hígítottuk 5% Tween-80, 5% PEG 400 és 4% etanolt tartalmazó PBS-ben.

Immunblot elemzés

A szöveteket homogenizáltuk, és immunoblot-tást végeztünk a korábban leírtak szerint (Leontieva et al., 2012a). Nyúl antiphospho S6-ot (Ser 240/244), antiphospho-AKT-t (Ser473), teljes AKT-t és anti-S6-ot használtunk a korábban leírtak szerint (Leontieva et al., 2012c) és a Cell Signaling Biotechnology-tól (Danvers, MA, USA) vásárolta; monoklonális anti-β-aktin-peroxidázt (AC-15) és egér anti-GAPDH antitesteket Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA), illetve Invitrogen-től (Grand Island, NY, USA) szereztünk be.

A vérplazma glükózszintjét Accu-Chek Aviva csíkokkal mértük (McKesson, Atlanta, GA, USA).

Az inzulin, az IGF1, a leptin és a triglicerid koncentrációját a vérplazmában mértük inzulin (egér) ultraibens érzékeny ELISA készlet (ALPCO Diagnostics, Salem, NH, USA), IGF1 (egér/patkány) ELISA készlet (ALPCO), egér Leptin ELISA készlet alkalmazásával. (Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL, USA), illetve a triglicerid kolorimetriás vizsgálati készlet (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). Az adatokat standard tartományok és négy paraméteres logisztikai illesztés vagy lineáris regresszió segítségével elemeztük.

Statisztikai analízis

T teszt és korrelációs elemzések [Pearson r együttható és P érték (kétfarkú)] a GraphPad Prism 5.00-as verziójával, Windows, GraphPad Software, San-Diego, Kalifornia, USA. www.graphpad.com.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az RPCI támogatta. A szerzők köszönetet mondanak Wei Tan-nak az egerek túlélésének statisztikai elemzésében nyújtott segítségért.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.

Finanszírozás

Ezt a munkát a Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, NY, USA) finanszírozta.

Szerzői hozzájárulások

Az OVL kísérleteket hajtott végre, elemezte az adatokat és megírta az írást. A GMP kísérleteket hajtott végre és elemezte az adatokat. Az MVB megtervezte a tanulmányt, elemezte az adatokat és megírta a dolgozatot.

Fájlnév Leírás

acel12211-sup-0001-FigS1.jpgimage/jpg, 890,2 KB	S1. Ábra A kezdeti testtömeg százaléka.
acel12211-sup-0002-FigS2.jpgimage/jpg, 850,6 KB	S2. Ábra Kaplan – Meier túlélési görbék kontroll egereknél HF étrenden (HF, n = 10) és R1 (n = 10) és R3 (n = 9) ütemezéssel kezelt egereknél.
acel12211-sup-0003-FigS3.jpgimage/jpg, 622 KB	S3. Ábra Commassie Kékkel festett májblot-membrán, amelyet a 4A. Ábra mutat be az egyenlő terhelés megerősítése érdekében.
acel12211-sup-0004-FigS4.jpgimage/jpg, 984,3 KB	S4. Ábra A p-S6 és a p-AKT szintje a túlélő egerek veséjében.
acel12211-sup-0005-FigS5.jpgimage/jpg, 1 MB	S5. Ábra A hím egerek vérplazmájában éhgyomri és éheztetlen glükóz és inzulin szintje.
acel12211-sup-0006-FigS6.jpgimage/jpg, 802,7 KB	S6. Ábra Korreláció az éhomi plazma metabolikus paraméterei között.
acel12211-sup-0007-FigS7.jpgimage/jpg, 875 KB	S7. Ábra Kaplan – Meier túlélési görbék.
acel12211-sup-0008-TableS1.xlsMS Excel, 14 KB	S1. Táblázat Túlélési görbe magas zsírtartalmú kontroll (HF) és magas zsír + rapamicinnel kezelt 2. csoport (HF + rapamicin (2. csoport)).
acel12211-sup-0009-TableS2.xlsMS Excel, 15,5 KB	S2. Táblázat Túlélési görbe magas zsírtartalmú kontroll (HF) és magas zsír + rapamicinnel kezelt csoportok (HF + rapamicin minden csoport).

Kérjük, vegye figyelembe: A kiadó nem felelős a szerzők által szolgáltatott bármilyen kiegészítő információ tartalmáért vagy működéséért. Bármilyen kérdést (a hiányzó tartalom kivételével) a cikk megfelelő szerzőjéhez kell irányítani.