A rapamicin heti adagolása javítja a túlsúlyt és a biomarkereket elhízott hím egerekben, magas zsírtartalmú étrend mellett

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

Eredmények

A rapamicin hajlamos volt a testtömeg csökkentésére a HF-diéta során

A magas zsírtartalmú étrendben lévő hím egerek három csoportját i.p. injekciók a következő időszakos ütemtervekkel: R1 - 1,5 mg kg -1 hetente háromszor, minden második héten; R2 (heti menetrend) - 1,5 mg kg −1 hét −1; és R3 - 0,5 mg kg −1 hetente háromszor minden második héten (ábra (1. ábra). 1). Ezeket az egércsoportokat HF táplálékkal etették 3 hónapig a jelenlegi vizsgálat megkezdése előtt (Kísérleti eljárások, előtörténet). Tehát a kezelés kezdetekor mindhárom kezelési csoport elhízott volt (1. ábra (1. ábra) 1), és hasonló volt a kontroll HF étrend csoportjához (hasonlítsa össze a súlyokat a 0. héten az 1. ábrán). 1). Amikor ez a kezelés megkezdődött (1. ábra (1. ábra), 1), három rapamicinnel kezelt csoportban átmenetileg csökkent az abszolút testtömeg (1. ábra. 1. ábra). Ezzel szemben a magas zsírtartalmú étrendben lévő kontrollegerek tovább híztak, amíg 8 hónap elteltével platóig nem jutottak (1. ábra (1. ábra és S1 ábra, alátámasztó információk). A kísérlet végére az R2 csoportba tartozó egerek a HF-egereknél kisebb súlyra való hajlamot mutatott (1. ábra. 1. ábra.) Az R2 csoportban statisztikailag szignifikáns, bár átmenetileg csökkent a súlygyarapodás a HF kontrollcsoporttal összehasonlítva (S1. ábra, alátámasztó információk csillagokkal).

Heti testtömeg a kísérlet során. Abszolút testtömeg. Kilenc hónapos hím egereket öt csoportba osztottak: alacsony zsírtartalmú (LF) étrend kontroll egerek és négy magas zsírtartalmú (HF) étrend csoport: kezeletlen kontroll (HF), R1 - 1,5 mg kg -1 rapamicin háromszor/minden második héten; R2 csoport - 1,5 mg kg −1 hetente hetente és R3 csoport - 0,5 mg kg −1 hetente háromszor minden második héten. A kezelést 11 hónapig folytatták, és a súlyt hetente mérték. Felső panel - az egyes csoportok átlagos súlyai vannak feltüntetve. Alsó panel - a rapamicin-kezelési sémák sémái és az alacsony zsírtartalmú és magas zsírtartalmú kontrollcsoportokból származó reprezentatív egerek fényképei.

A rapamicin meghosszabbítja az elhízott hím egerek élettartamát

Az egyes rapamicinnel kezelt csoportok teljes túlélésének elemzése a HF kontroll egerekhez képest feltárta, hogy a rapamicinnel végzett heti kezelés (R2 ütemterv) szignifikánsan megakadályozta a kövér hím egerekben a HF étrenden a morbiditást és a halált (ábra (2A ábra). 2A). Míg a magas zsírtartalmú étrendben lévő kontrollegerek 60% -a elhalt vagy feláldozott morbiditás miatt, az R2 csoport összes egere életben maradt. (A halál okát nem mindig határozták meg, ezért ezeket az adatokat nem közöljük). Nagy statisztikailag szignifikáns különbség volt (P = 0,0063) az egerek teljes túlélésében az R2 csoportban a kontroll HF csoporthoz képest (ábra (2A ábra). 2A). Az elemzéshez vett mindhárom rapamicinnel kezelt csoport túlélési aránya szintén szignifikánsan magasabb volt a kontroll HF csoporthoz képest (P = 0,028, ábra 2B ábra). 2B). Így jelentőséget értünk el az R2 csoport és a három rapamicinnel kapott csoport együttesen, a HF csoporthoz viszonyítva. A kéthetente felváltott kezelések (R1 és R3 csoport) tendenciát mutattak a túlélés növelésére, de statisztikailag nem volt szignifikáns (S2. Ábra, Támogató információk).

A rapamicin meghosszabbította az egerek élettartamát magas zsírtartalmú étrenden. (A). Kaplan – Meier túlélési arány görbe HF étrendben (HF; n = 10) és Rapamicinnel kezelt egerek esetén R2 rend szerint (HF + rapamicin (R2 csoport); n = 9). (B). Kaplan – Meier túlélési arány görbe HF étrendben lévő kontroll egereknél (HF; n = 10) és a rapamicinnel kezelt összes egércsoport (összes csoport) együtt (n = 28).

A p-S6 szintje a túlélő egerekben

Tizenegy hónapos kezelés után, amikor a HF kontrollcsoportban az egerek 60% -a elhunyt, a kísérletet leállítottuk a túlélő egerek vizsgálatára. Mindhárom rapamicinnel kezelt csoportban az egereket feláldoztuk 8 nappal az utolsó kezelés után, hogy kiküszöböljük a rapamicin közvetlen hatását a vizsgált paraméterekre. A tanulmányt a szívre és a májra összpontosítottuk. Korábbi jelentések rámutattak a szívre (a szívizomra), amely szintén nagyon fontos szövet a foszfo-S6 mérésére (Hua és mtsai, 2011; Leontieva és mtsai, 2012a, 2013b; Ramos és mtsai, 2012; Flynn és mtsai., 2013; Wu és mtsai, 2013; Zhou és mtsai, 2013). A szív az öregedés egyik leggyakrabban vizsgált szerve, és a rapamicin-kezelés javítja a szív állapotát. Ezenkívül a szív- és érrendszeri betegségek a leggyakoribb halálokok az emberekben. Fontos, hogy korábbi vizsgálataink a szívfoszfo-S6-ot mint a hosszú élettartam és az állatok hipertrófiájának lehetséges markereit vonják maguk után (Leontieva et al., 2013b) (Leontieva et al., 2012a; Flynn et al., 2013).

Az R2 csoportban a szív p-S6 szintje statisztikailag alacsonyabb volt, mint a kontroll HF csoportban (3. ábra. 3. ábra). A P-S6 az mTORC1 aktivitását tükrözi, amelyről ismert, hogy részt vesz az öregedésben. Megmértük az AKT foszforilációját is az S473-nál, amely részben az mTORC2 aktivitás markere. A p-S6-tal ellentétben a p-AKT (S473) nem csökkent az R2 csoportban (ábra (3. ábra 3).

p-S6 a túlélő egerek szívében. (A). Alacsony zsírtartalmú (LF) vagy magas zsírtartalmú (HF) étrenden végzett egerek szívéből származó fehérje-lizátumok immunblot-analízise: kontroll (HF - kezeletlen) vagy rapamicinnel kezelt (bemutatott R2 csoport - HF/R2). Az immunblotot a jelzett antitestekkel hajtottuk végre. A számok az egereket jelzik. (B). Ábrán bemutatott adatok kvantitatív elemzése. 3A. 3A. A p-S6 jel (bal panel) és a p-AKT (Ser473) (jobb panel) jelének számszerűsített intenzitása átlag ± SE.

Kiértékeltük ezeket a paramétereket a májban is. Egyetértésképpen a máj p-S6 szintje szignifikánsan alacsonyabb volt az R2 csoportban a HF kontrollhoz képest. A szívekhez hasonlóan a p-AKT (S473) májszintjének tendenciája magasabb volt az R2 csoportban, bár ebben a vizsgálatban nem érte el a statisztikai különbséget (4. ábra. 4. ábra). Figyelemre méltó, hogy a vesékben a p-S6 és a p-Akt szintje nem különbözött a kontroll és a rapamicinnel kezelt csoportokban, és a p-S6 és a p-Akt erősen korrelált (S4. Ábra, Támogató információk).

p-S6 és p-Akt a túlélő egerek májában. (A). A máj májfehérje - lizátumainak immunblottanalízise

2 éves hím egerek nagy zsírtartalmú (HF) diétán: kontroll (HF - kezeletlen) vagy rapamicinnel kezelt (bemutatott R2 és R3 csoport - HF/R2, HF/R3). A számok az egereket jelzik. Az egyenlő terhelést a membrán Commassie Blue-val történő festésével is megerősítettük (S3. Ábra, Támogató információk). (B). Ábrán bemutatott adatok kvantitatív elemzése. 4A. A p-S6 jel és a p-AKT jelének (Ser473) számszerűsített intenzitása átlag ± SE.

A hetente kezelt egereknél nem voltak metabolikus rendellenességek

Metabolikus paraméterek túlélt egerekben. A súlyokat és az anyagcsere paramétereket (leptin, IGF1, trigliceridek, glükóz és inzulin) az éhgyomri plazmában határoztuk meg, és átlagként ± SE-ként tüntettük fel. Az éheztetett vért reggel összegyűjtötték az éjszakai koplalás után.

Vita

Itt mutattuk be először, hogy a rapamicin meghosszabbította az elhízott egerek élettartamát magas zsírtartalmú étrenden. A túlélés jelentős növekedését értük el a rapamicin időszakos adagolásával. A legkiemelkedőbb hatást hetente egyszer kezelt egereknél figyelték meg. Ebben az (R2) csoportban az összes egér túlélte a kísérlet végéig. A rapamicin beadásának két másik ütemezése (minden második héten: R1 és R3) tendenciát mutatott a mortalitás csökkenésére, bár statisztikai szignifikanciát nem sikerült elérni. Mindazonáltal a túlélés mind a három rapamicinnel kezelt csoportban együttesen (80%) szignifikánsan magasabb volt (P ábra 4C, 4C, a p-S6 éhezési szintje magasabb volt idős egerekben, mint fiatal egerekben (Sengupta et al., 2010a). hogy a p-S6 szintek megkülönböztetik a nyugalmat az öregedéstől (Blagosklonny, 2012a; Leontieva és mtsai, 2012b), a p-S6 koplalási szintje az öregedés potenciális markere lehet. A szívizom p-S6 szintje korrelál a testmérettel és általában magasabb a hímivarúaknál, mint a nőstény egereknél (Leontieva et al., 2012a). Ez egybevág azzal a megfigyeléssel, hogy a nagy hímek általában rövidebb ideig élnek, mint a nőstények és a kis egeretörzsek. Összességében ezek az adatok alátámasztják azt az elképzelést, hogy az mTOR/S6K útvonal mind a növekedést, mind az öregedést ösztönzi (Blagosklonny & Hall, 2009).

Az mTOR-t az inzulin, az IGF-1 és a gyulladásos citokinek aktiválják (Zoncu et al., 2011; Cornu et al., 2012), amelyek mindegyike a gyors öregedés és a rossz egészségi állapot markere. Továbbá az aktivált mTOR/S6K útvonal inzulinrezisztenciát okozhat (Khamzina et al., 2005; Krebs et al., 2007). Ezért a p-S6 alacsonyabb éhomi szintje jelezheti a lassabb öregedést és az anyagcsere-egészséget. Vizsgálatunk valószínűleg alábecsülte a rapamicin pozitív hatásait, mert a metabolikus paramétereket csak 2 évesen életben maradt egereknél értékelték. Míg az R2 csoport összes egere túlélte a kísérlet végéig, a kontroll csoportban csak az egerek 40% -a élte túl. A kontroll HF csoportban a rövidebb élettartamú (definíció szerint kevésbé egészséges és gyorsabb öregedésű) egerek nem éltek túl, ezért nem vettek részt a p-S6 és az anyagcsere paraméterek vizsgálatában.

Ez a tanulmány kiindulópont a rapamicin intermittáló ütemezésének további értékeléséhez, valamint az életkiterjesztési potenciáljuk növeléséhez a dózisok és a gyakoriság módosításával. A rapamicinnel történő időszakos kezeléssel meghosszabbított élettartam tovább fokozható étrenddel, az antidiabetikus gyógyszerrel, a metforminnal (Anisimov et al., 2011a; Martin-Montalvo et al., 2013), és ha lehetséges, testmozgással. Ezek a módszerek együttesen javíthatják az egészséget és növelhetik az idősödő emberek élettartamát.

Kísérleti eljárások

Valamennyi állatkísérletet a Roswell Park Cancer Institute Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának előírásaival összhangban végeztük.

Őstörténet [előző vizsgálat (Leontieva et al., 2013c)]: A 9 hónapos hím egereket (C57BL/6NCr törzs) 5 csoportba osztottuk: az egyik csoport standard laboratóriumi chow-t kapott (5% zsír, alacsony zsírtartalmú) (LF) diéta. Négy másik csoport magas zsírtartalmú, 60% -os étrendben részesült (Research Diets, Inc., Cat # D12492 rágcsáló-étrend 60% kCal% zsír; New Brunswick, NJ, USA) (HF) 3 hónapig. A HF-diéta ezen négy csoportja a következő volt: HF-csoport - kontroll (HF), az R1 csoport orálisan alacsony dózisú resveratrolt kapott; Az R2 csoport orálisan alacsony dózisú rapamunét kapott; és az R3 csoport resveratrol és rapamune kombinációját kapta, a korábban leírtak szerint (Leontieva et al., 2013c).

Jelenlegi tanulmány

Egy héttel az első vizsgálat befejezése után a kísérleti csoportokat (R1 – R3) rapamicinnel (LC Laboratories) kezelték i.p. injekcióval, a következő ütemezés szerint: az R1 csoport 1,5 mg kg -1-et kapott háromszor/héten/kéthetente; Az R2 csoportba minden héten 1,5 mg kg −1 hetet –1 injektáltak; és az R3 csoportnak 0,5 mg kg -1-et adtak be háromszor/hét/minden második héten. A kezelést 11 hónapig folytatták, és a súlyt hetente mérték. Az utolsó kezelés utáni nyolcadik napon az egereket egy éjszakán át éheztettük és felöltük. Vért gyűjtöttünk a nap végén, mielőtt az ételt egy éjszakai éhgyomorra eltávolítottuk volna. Másnap reggel éheztetett vért gyűjtöttek és egereket áldoztak fel. A biokémiai elemzéshez ennek megfelelően előállított és éheztetlen plazmát készítettünk.

A rapamicint (LC Laboratories, Woburn, MA, USA) etanolban oldottuk 15 mg ml-1 koncentrációban (törzs), majd 0,15 mg ml-1-re hígítottuk 5% Tween-80, 5% PEG 400 és 4% etanolt tartalmazó PBS-ben.

Immunblot elemzés

A szöveteket homogenizáltuk, és immunoblot-eljárást hajtottunk végre a korábban leírtak szerint (Leontieva et al., 2012a). Nyúl antiphospho S6-ot (Ser 240/244), antiphospho-AKT-t (Ser473), teljes AKT-t és anti-S6-ot használtunk a korábbiakban leírtak szerint (Leontieva et al., 2012c), és a Cell Signaling Biotechnology-tól (Danvers, MA, USA); monoklonális anti-β-aktin-peroxidázt (AC-15) és egér anti-GAPDH antitesteket Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA), illetve Invitrogen-től (Grand Island, NY, USA) szereztünk be.

A vérplazma glükózszintjét Accu-Chek Aviva csíkokkal mértük (McKesson, Atlanta, GA, USA).

Az inzulin, az IGF1, a leptin és a triglicerid koncentrációját a vérplazmában mértük inzulin (egér) ultraibens érzékeny ELISA készlet (ALPCO Diagnostics, Salem, NH, USA), IGF1 (egér/patkány) ELISA készlet (ALPCO), egér Leptin ELISA készlet alkalmazásával. (Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL, USA), illetve a triglicerid kolorimetriás vizsgálati készlet (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). Az adatokat standard tartományok és négy paraméteres logisztikai illesztés vagy lineáris regresszió segítségével elemeztük.

Statisztikai analízis

A T-tesztet és a korrelációs elemzéseket [Pearson r együttható és P-érték (kétfarkú)] a GraphPad Prism 5.00 verziójával hajtottuk végre a Windows, a GraphPad Software, a San-Diego Kalifornia, USA. www.graphpad.com.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az RPCI támogatta. A szerzők köszönetet mondanak Wei Tan-nak az egerek túlélésének statisztikai elemzésében nyújtott segítségért.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.

Finanszírozás

Ezt a munkát a Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, NY, USA) finanszírozta.

Szerzői hozzájárulások

Az OVL kísérleteket hajtott végre, elemezte az adatokat és megírta az írást. A GMP kísérleteket hajtott végre és elemezte az adatokat. Az MVB megtervezte a tanulmányt, elemezte az adatokat és megírta a dolgozatot.

segítő információ

További támogató információk a cikk online verziójában találhatók a kiadó webhelyén.

S1. Ábra A kezdeti testtömeg százaléka.

S2. Ábra Kaplan – Meier túlélési görbék kontroll egereknél HF étrenden (HF, n = 10) és R1 (n = 10) és R3 (n = 9) ütemezéssel kezelt egereknél.

S3. Ábra Commassie Kékkel festett májblot-membrán, amelyet a 4A 4A. Ábra mutat be az egyenlő terhelés megerősítésére.

S4. Ábra A p-S6 és a p-AKT szintje a túlélő egerek veséjében.

S5. Ábra A hím egerek vérplazmájában éhgyomri és éheztetlen glükóz és inzulin szintje.

S6. Ábra Korreláció az éhomi plazma metabolikus paraméterei között.

S7. Ábra Kaplan – Meier túlélési görbék.

S1. Táblázat Túlélési görbe magas zsírtartalmú kontroll (HF) és magas zsír + rapamicinnel kezelt 2. csoport (HF + rapamicin (2. csoport)).

S2. Táblázat Túlélési görbe magas zsírtartalmú kontroll (HF) és magas zsír + rapamicinnel kezelt csoportok (HF + rapamicin minden csoport).