Az étrend okozta elhízás és glükóz intolerancia kialakulása a C57Bl/6 egerekben magas zsírtartalmú étrendben különféle fázisokból áll

Rowett Táplálkozási és Egészségügyi Intézet, Aberdeen Egyetem, Aberdeen, Egyesült Királyság

Állattani élettani tanszék, Biológiai Kar, Philipps University Marburg, Marburg, Németország

Rowett Táplálkozási és Egészségügyi Intézet, Aberdeen Egyetem, Aberdeen, Egyesült Királyság

Hovatartozás Mozgásszervi kutatási program, Orvostudományi Intézet, Aberdeen Egyetem, Aberdeen, Egyesült Királyság

Élelmiszer-, víz- és kozmetikai osztály, Környezetgyógyászati részleg, Norvég Közegészségügyi Intézet, Oslo, Norvégia

Hovatartozás Mozgásszervi kutatási program, Orvostudományi Intézet, Aberdeeni Egyetem, Aberdeen, Egyesült Királyság

Állattani élettani tanszék, Biológiai Kar, Philipps University Marburg, Marburg, Németország

Lynda M. Williams,
Fiona M. Campbell,
Janice E. Drew,
Christiane Koch,
Nigel Hoggard,
William D. Rees,
Torkamol Kamolrat,
Ha Thi Ngo,
Inger-Lise Steffensen,
Stuart R. Gray

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Williams LM, Campbell FM, Drew JE, Koch C, Hoggard N, Rees WD és mtsai. (2014) A diéta által kiváltott elhízás és glükóz intolerancia kialakulása a C57Bl/6 egerekben magas zsírtartalmú étrendben különféle fázisokból áll. PLoS ONE 9 (8): e106159. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106159

Szerkesztő: Michael Müller, Kelet-Angliai Egyetem, Egyesült Királyság

Fogadott: 2014. március 7 .; Elfogadott: 2014. június 19 .; Közzétett: 2014. augusztus 29

Adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az eredmények alapjául szolgáló összes adat korlátozás nélkül teljes mértékben elérhető. Az adatokat feltöltötte a Figshare szolgáltatásba, és a DOI alatt érhetők el: http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1093830.

Finanszírozás: Az LMW, FMC, JED, CG, GH, ACM, PN, AJF, NH, WDR, SMH finanszírozását a skót kormány Vidéki és Környezetvédelmi Tudományos és Analitikai Szolgáltatások Osztálya (RESAS) finanszírozta. Az AT-t és a KC-t a német kutatási és oktatási minisztérium finanszírozta (hivatkozási szám: 0315087), a HTN-t és az I-LS-t a norvég kutatási tanács finanszírozta (projektszám: 196112/H10. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmány tervezésében, adatgyűjtés és elemzés, közzétételi döntés vagy a kézirat elkészítése.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az elhízás és a kapcsolódó anyagcserezavarok nagyrészt az energiasűrű, magas cukortartalmú és hosszú láncú telített zsírtartalmú ételek túlfogyasztásának következményei. A diéta okozta elhízás inzulinérzékenységhez vezet, és számos tanulmány kimutatta, hogy az elhízás és az inzulinérzékenység alacsony fokú gyulladás jelenlétével függ össze [1], [2]. További bizonyíték a gyulladás elhízásban játszott szerepére olyan tanulmányokból származik, ahol a gyulladás vagy gátolt, ami az inzulinérzékenység megelőzéséhez és a súlygyarapodás csökkenéséhez vezet [3] - [5], vagy a gyulladáscsökkentő utak gátlásához, amely növeli a súlygyarapodást. és a metabolikus szindróma kialakulása [6]. Noha jól bebizonyosodott, hogy az étrendben a hosszú láncú telített zsírsavak inzulinérzékenységet és elhízást okoznak [7], némi vita folyik a bélbél áteresztőképességének és a bélbaktériumok bakteriális lipopoliszacharidjának (LPS) későbbi szivárgásának a lipid által kiváltott szerepéről [8], szemben a lipid túlterhelés és az ektopiás zsírlerakódás szerepével [9], [10] az elhízással kapcsolatos gyulladásban.

Mód

Etikai nyilatkozat

Minden állatkísérletet az 1986-os Animal (Scientific Procedures) törvény engedélyezett, és a Rowett Táplálkozási és Egészségügyi Intézet Etikai Felülvizsgálati Bizottsága jóváhagyást kapott.

Állatok

Glükóz tolerancia

Az intraperitoneális glükóz-tolerancia teszteket (IPGTT) 5 órán át tartó éhgyomor után nem gyógyuló eljárásként végeztük (n = 6–8). Vérmintát (0 perc) vettünk az intraperitoneális IP glükózinjekció előtt (1,5 mg/testtömeg-g). Az ezt követő vérmintákat a farokvénából 15, 30, 60 és 120 perc múlva vettük, és Accu chek Aviva vércukorszintmérővel (Roche Diagnostics, Burgess Hill, Egyesült Királyság) mértük. A görbe alatti területet (AUC) a trapézszabály alkalmazásával számítottuk ki [23].

Immunhisztokémia

Az állatok külön csoportját szívpunkcióval leöltük Euthatal (nátrium-fenobarbitál) által kiváltott terminális érzéstelenítésben 500 mg/kg injektált IP koncentrációban. A májat, az epididymális WAT-ot és a gastrocnemius izmokat 4% paraformaldehidben rögzítettük immunhisztokémiai és/vagy olajvörös O-festés céljából (n = 6–8). A szöveteket lefagyasztottuk, és krioszekciókat vágtunk az olajvörös O festés érdekében. Az immunhisztokémiai szövetek viaszba ágyazódtak, a metszeteket kivágták és viasztalanították, mielőtt patkány antiegér F4/80 antitesttel festették (AbD Serotec, Kidlington, Egyesült Királyság). A további lépéseket a Vectastain Elite ABC Kit használatával hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint (Vector Laboratories, Peterborough, Egyesült Királyság). A mikroszkóp képeinek elemzését Image Pro-plus rendszer segítségével (Media Cybernetics, Silver Springs, MD, USA) végeztük.

Valós idejű PCR vizsgálatok

A szöveteket folyékony nitrogénben fagyasztottuk le valós idejű PCR céljából. A teljes RNS-t a májból, a WAT-ból és az ileumból extraháltuk RNeasy Mini Kit (Qiagen, Crawley, Egyesült Királyság) alkalmazásával, beépítve a DNase emésztést. A teljes RNS-t izoláltuk a gastrocnemius izomból TRIzol reagens alkalmazásával (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). A kivont teljes RNS-t NanoDrop spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies) számszerűsítettük. A minőséget Agilent Bioanalyser (Agilent Technologies) segítségével értékelték.

A gén expressziójának értékelésére a gastrocnemius izomban TaqMan szondákat terveztek az Universal ProbeLibrary ProbeFinder 2.45-ös verziójából egérhez (Universal ProbeLibrary, Roche). Primer szekvenciák voltak; GAPDH előre 5′-CCTTGAGATCAACACGTACCAG-3 ’, hátramenet; 5'-CGCCTGTACACTCCACCAC-3 '; TNF-α előre 5'-CTGTAGCCCACGTCGTAGC-3 ', hátramenet 5'-TTGAGATCCATGCCGTTG-3'; IL-6 előre 5'-GCTACCAAACTGGATATAATCAGGA-3 ', hátramenet 5'-CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA-3'; IL-1β előre 5'- TGTAATGAAAGACGGCACACC-3 ', hátramenet 5'-TCTTCTTTGGGTATTGCTTGG-3'; és a Sigma-Aldrich-től (Gillingham, Dorset, Egyesült Királyság) vásároltuk. A reakciókat 10 µl LightCycler 480 szondák MasterMix alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó utasításainak megfelelően. Valós idejű PCR vizsgálatokat a LightCycler 480 rendszer (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) alkalmazásával végeztünk. A ciklusos program 10 perces előinkubálásból állt 95 ° C-on, majd 45 ciklusban, amelyek 10 másodpercig 95 ° C-on, és 30 másodpercig 60 ° C-on tartottak. A Ct számot a Lightcycler 480 rendszer 5-ös verziójú szoftverével mértük (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország).

Kiszámítottuk a referencia génhez, az izomhoz és az ileumhoz tartozó GAPDH-t, a májban és a WAT-ban a transzkriptum szintjét (ΔCt). A kísérleti csoportok GAPDH-hoz vagy B2M-hez viszonyított hajtás expressziójának változását a ΔΔCt értékekből számítottuk (n = 6–8). Mivel ezek az értékek arányok, nincsenek standard hibák.

Kétdimenziós gélelektroforézis (2-DE)

A 2-DE-t lényegében a korábban részletesen elvégeztük, néhány módosítással [24]. Az első dimenzióban a plazmafehérjék elválasztásához Bio-Rad, 11 cm-es, immobilizált pH-gradiens (IPG) csíkokat (pH 3–10) használtunk. A csíkokat rehidrációs pufferben (7 M karbamid; 2 M tiokarbamid; 4% w/v CHAPS; 2% w/v biolit; és 50 mM DTT) rehidráltuk 200 µg fehérjemintát tartalmazó Bio-Rad IEF sejtben, majd fókuszáltuk.

Az első dimenzió után az IPG csíkokat friss egyensúlyi pufferben (6 M karbamid; 2% w/v SDS; 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8; 20% v/v glicerin; és 130 mM DTT) inkubáltuk 10–15 percig. szobahőmérsékleten, mielőtt átvisszük egy második kiegyenlítő pufferbe (6 M karbamid; 2% w/v SDS; 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8; 20% v/v glicerin; és 135 mM jód-acetamid) 10–15 percig szobahőmérsékleten hőfok. Ezután a csíkot az előregyártott Criterion XT Bis-Tris 3–12% IPG + 1 lyukú gélkazetta tetejére vittük, és 5 µl All Blue Precision Protein Standards (Bio-Rad) -t töltöttünk a referenciakútba. A géleket 200 V-on futtattuk, amíg a bróm-fenol-kék el nem érte a gél alját. A géleket rögzítettük és Coomassie Blue-val festettük (n = 5).

Az egér plazmafehérjéinek azonosítása

A 2-DE géleket Progenisis Samespots szoftverrel (Nonlinear Dynamics Ltd, Egyesült Királyság) elemeztük. Azok a foltok, amelyek a P normalizált átlagos térfogatának különbségét mutatták 1. ábra.

A. A HF-vel táplált egerek testsúlya szignifikánsan különbözött az LF-vel táplált egerek testtömegétől a 3 napos etetés óta (P 2. ábra.

A, B & C. Olajvörös O képelemzésével mért májlipid önkényes egységekben (AU). A. a festés lineárisan nőtt az étrenden eltöltött idővel HF-vel táplált egerekben 1 héttől (P 3. ábra.

A. A plazma-triacil-glicerin (TAG) szignifikánsan alacsonyabb volt a HF-vel táplált egerekben mind a 3. napon, mind az 1. héten diétán (P 4. ábra.

HIRDETÉS. Intraperitoneális glükóztolerancia tesztek (IPGTT) LF-vel etetett egerekben •, HF-et tápláló egerekben és PF-et táplált egerekben ▪ a HF-étrendet csak az LF-vel táplált egerek kalóriabevitelével táplálták, 3 nap múlva, 1, 12 és 16 hét múlva. a diéta kezdete. Az IPGTT-t nem helyreállítási eljárásként hajtották végre, mivel az éhgyomorra és a glükóz beadásának hatása egy ideig megváltoztathatja a génexpressziót. (n = 6–8). E. Az LF és a HF egerek teljes AUC% -os különbségének összehasonlítása az idõ során, kétirányú ANOVA alkalmazásával azt mutatta, hogy amikor a 3 napos és a 16. hét idõpontokat vettük figyelembe, az étrend és az idõ jelentősen befolyásolta a glükóz toleranciát (F1,58 = 94,56, P 5. ábra.

A. A plazma leptin szintje szignifikánsan magasabb volt a HF-el táplált egerekben 3 napos étrend után (P 6. ábra. Az egér plazma 2D Coomassie festett gélje 3 nap után a HF diétán. Bio-Rad, 11 cm, immobilizált pH-gradiens (IPG) csíkok (pH 3–10) használtuk a plazmafehérjék elválasztására az első dimenzióban.

Az első dimenzió után az IPG csíkot az előregyártott Criterion XT Bis-Tris 3–12% IPG + 1 lyukú gélkazetta tetejére és 5 µl Minden kék precíziós fehérje szabványt (Bio-Rad) töltöttük a referenciakútba. A géleket fixáltuk és Coomassie Blue-val festettük. A számozott pontok jelzik azokat, amelyek átlagos normál térfogata szignifikánsan eltér (P 7. ábra.

A. A haptoglobin plazmafehérje-szintje (P 1. táblázat. Fehérje-azonosítás LC/MS/MS-vel a 3 napos egerek 2DE géljein lévő foltok között, amelyek a HF-ben átlagosan normalizált térfogatban szignifikánsan különböztek az LF-vel táplált egerektől (n = 5).

Gyulladásos markerek a plazmában

Az IL-6 plazmaszintje emelkedett a HF-vel táplált egerekben 3 napos étrend után (P 8. ábra.

A. Az IL-6 plazmaszintje 3 nap múlva emelkedett HF diétán (P 9. ábra.

A. A SerpinA3N gén expressziója a májban szignifikánsan felfelé volt szabályozva egy HF étrendben, 3 napon keresztül tesztelve (P 10. ábra.

A. A májban az F4/80 festés tetszőleges egységként (AU) mért területe szignifikánsan megnőtt a HF-vel táplált egerekben a tesztelt összes időpontban (P 11. ábra.

A. Az IL-1β gén expressziója az izomban 3 napos HF diéta után változatlan volt, de a 12. héten felfelé szabályozott volt (P 12. ábra.