Az elhízás okozta meddőséget és hiperandrogenizmust korrigálják az inzulinreceptor törlésével a petefészek Theca sejtjében

Absztrakt

Bevezetés

A policisztás petefészek-szindróma (PCOS) heterogén endokrin rendellenesség, amely világszerte a reproduktív korú nők 6–10% -át érinti (1). Az érintett nők körülbelül felének metabolikus diszfunkciója van (pl. Inzulinrezisztencia) elhízás hiányában is (2). Mivel a PCOS-ban jelen lévő kóros tulajdonságok, beleértve a hiperandrogenémiát, a hiperinsulinémiát, a luteinizáló hormon (LH) hiperszekrécióját és a hiperlipidémiát, gyakran együtt élnek, nehéz észrevenni az egyes hormonális és metabolikus rendellenességek relatív hozzájárulását a PCOS-ban fellépő diszfunkciókhoz.

A PCOS multiorganikus és multihormon diszfunkciójának patofiziológiájának feltárása érdekében laboratóriumunk az érintett szervekben meghatározó útvonal-gének szövetspecifikus megszakítását alkalmazta. Korábban beszámoltunk arról, hogy az elhízott egerek hiperinzulinémiája LH hiperszekrécióval, női meddőséggel és hipertesztoszteronémiával jár, hasonlóan néhány PCOS-os nőhöz. Az inzulinreceptor (IR) megszakadása kifejezetten a gonadotrófokban részben helyreállította a termékenységet, ami azt jelzi, hogy a gonadotrófban az inzulinjelzés szerepet játszik az elhízás okozta meddőségben megfigyelhető reproduktív rendellenességekben (3). A meddőségi fenotípust azonban csak részben tudta megmenteni az inzulinjelzés elvesztése a gonadotrófban, ami azt jelzi, hogy az elhízás a reproduktív tengely más részein is hozzájárul a meddőséghez.

A diéta okozta elhízás (DIO) nőstény egerek magas szérum tesztoszteronszintet mutatnak, hasonlóan néhány PCOS-os nőhöz. Az androgén bioszintézis sebességkorlátozó lépését a Cyp17 gén által kódolt citokróm P450 17a hidroxiláz/17, 20 liáz enzim közvetíti (4). Ennek az enzimnek két enzimatikus funkciója van: a progeszteron vagy a pregnenolon 17 a-hidroxilezésének közvetítése, majd az ezt követő dehidroepiandrosztendiondá vagy androsztendiondá történő átalakulás. Nőstény rágcsálóknál a P450Cyp17 aktivitás elsősorban a petefészek theca-interstitialis (TI) sejtjeiben van jelen, így ők az androgén elsődleges forrása, mert az egér mellékvese nem termel androgént (5).

A Cyp17 expresszió nemcsak reagál az agyalapi mirigy LH-jára, hanem más parakrin és endokrin szignálok, például IGF1 és inzulin által is szabályozható. Például a szérum inzulinszintjének csökkentése metformin (6) alkalmazásával csökkentette a szérum 17 a-hidroxi-progeszteron szekrécióját a gonadotropin-felszabadító hormon (GnRH) agonistáira reagálva, ami arra utal, hogy a hiperinsulinemia szerepet játszhat a magas androgénszintézisben. Ezen hatások némelyikét közvetett módon közvetítheti az agyalapi mirigy LH szekréciójának fokozódása; az inzulin azonban kogonadotropinként szolgálhat a petefészekben, hogy hozzájáruljon az elhízás fokozott androgénszintéziséhez. In vitro az inzulin stimulálja a petefészek androgén szekrécióját emberi és állati petefészek sejtekben (7–11). Az IR-ket lokalizálják a petefészek TI sejtjeiben (12, 13), és in vitro in vitro szteroidogenezist közvetítenek (10, 14, 15), önmagában az androgén szekréció stimulálásával vagy az LH által kiváltott androgén szekréció fokozásával (7, 10, 16).

A petefészek szteroidogenezise az inzulinra reagálva jelentkezik a PCOS-ban szenvedő nők petefészkeiben (10), még a perifériás inzulinrezisztencia hátterében is, ami arra utal, hogy a petefészek inzulinszignalizációja másképp szabályozott, mint a hiperinsulinizmus más szerveinek inzulinjelzése. Szövet-specifikus különbségeket tapasztaltak az inzulinrezisztenciában laboratóriumi tanulmányainkban, amelyek igazolták, hogy az elhízott nőstény egerek, akiknek inzulinrezisztenciája van a májban, az izomban és a zsírban, megtartották az agyalapi mirigy és a petefészek inzulinérzékenységét (17). Következésképpen az agyalapi mirigy és a petefészek bazális inzulinszignalizációja fokozódott az elhízással összefüggő hiperinsulinémia esetén.

Az anatómiai és funkcionális bizonyítékok tehát indokolttá tették az inzulinszignalizáció fiziológiai és kóros szerepének elemzését a theca sejtekben a petefészek fejlődésében és működésében. Ezért kifejlesztettünk egy egérmodellt, amelyben az IR-t specifikusan törölték a petefészek TI sejtjeiből CRE/LoxP technológia segítségével.

Kutatási tervezés és módszerek

Egér modellek

A Floxed-IR egereket Dr. C. Ron Kahn-tól szereztük be, és korábban leírták őket (18). A Cyp17iCre egereket Bridges et al. (19) A Cyp17IR knockout (KO) egereket (Cyp17IRKO) úgy állítottuk elő, hogy homozigóta nőstényt (Cyp17iCre -/-; fl/fl-IR) heterozigóta hím (Cyp17iCre +/−; fl/wt-IR) egerekkel pároztunk. DIO egereket állítottunk elő az előzőekben leírtak szerint (17), amelyekben a 2 hónapos nőstény egereket 60% magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) táplálták. Genotipizáló egereket (Cyp17iCre -/-; fl/fl vagy fl/wt-IR) használtunk kontrollként. Az egerek testtömegét és egy éjszakán át éheztetett glükózt 6 hónapos korban mértük. Minden eljárást a Johns Hopkins állatgondozási és felhasználási bizottság jóváhagyásával hajtottunk végre.

Genotipizálás és DNS-kivonás

IR-hez való primereket írtak le (20). Ezek a primerek felismerik a vad típusú (WT) sávot (280 bp), a fl/fl sávot (320 bp) és a KO sávot (220 bp). A Cyp17iCre primerek a következők voltak: cypcre-F, TCTGATGAAGTCAGGAAGAACC; és cypcre-R, GAGATGTCCTTCACTCTGATTC (19). A DNS-t a korábban leírt módon extraháltuk (21).

Hormonális és glükózvizsgálatok

GnRH stimulációs és glükóz tolerancia teszt

Az LH és a tüszőstimuláló hormon (FSH) bazális reggeli szintjét Luminex assay-vel mértük, a korábban leírtak szerint (21). Az inzulint és a leptint Luminex assasy-val (17) mértük egy éjszakán át éheztetett egerekből. Az androsztenediont, a tesztoszteront és az ösztradiolt a Virginia Egyetem Reprodukciós, Ligand Assay és Analysis Core Kutatóközpontja méri. Az LH-t a GnRH stimuláció után is mértük, ahogy azt korábban leírtuk (3). Az éjszakán át éheztetett egerekbe 2 g/testtömeg-kg (testtömeg-kg) szőlőcukrot injektáltunk, és a glükózt 0, 15, 30, 60, 90 és 120 percen belül regisztráltuk, a korábban leírtak szerint (17).

Pubertás és termékenységi vizsgálat

A pubertást és az ösztrikus ciklikusságot a korábban leírtak szerint elemeztük (21). A termékenységet a korábban leírtak szerint értékeltük (3,21). Röviden: az 5 hónapos nőstény egereket bizonyítottan termékeny hím egerekkel pározták, és a termékenységi rátákat a terhességet eredményező négy párzási vizsgálat százalékában értékelték, ahogy azt korábban leírták (3).

Kvantitatív valós idejű PCR

A petefészek RNS-t Trizol (Invitrogen, Grand Island, NY) kivonatolta a gyártó protokollja szerint. A teljes RNS-t (1 ug) reverz átírással (iScript cDNS Synthesis Kit; BioRad, Hercules, CA) írtuk cDNS-be. A petefészekben az androgéntermeléssel kapcsolatos gének (Cyp17, Cyp19, StAR és LHR) mRNS-szintjét iQ SYBR green segítségével mértük a gyártó protokollja szerint (Bio-Rad). A Cyp17 primerjei az 5'-GATCTAAGAAGCGCTCAGGCA3 'és az antiszensz 5'-GGGCACTGCATCACGATAAA-3' (22), a Cyp19 sense 5'-TTGGAAATGCTGAACCCCAT-3 'és az antiszensz 5'-CAGAATGAT ′ -CCCAAAGAAGGCATAGCAAG-3 ′ és antiszensz 5′-GCTGAATCCCCCAAACTTCT-3 ′, valamint LH receptor (LHR) érzék esetén 5′-GACCAAAAGCTGAGGCTGAGA és antiszensz 5′-CAATGTGGCCATCAGGT.

Taqman kvantitatív PCR-t (Bioresearch Technologies, Novato, CA) IR-re végeztünk, és belső kontrollként GAPDH-t használtunk. Az infravörös primerek az 5'-ATGGGCTTCGGGGAGAGGA-3 'és az antiszensz 5'-GGATGTCCATACCAGGGCC-3' voltak, az 5'-TGAGACGACGGCTGTGCCTT-3 'szondával 5-karboxifluoreszcein-1) Black Hole Quen és a GAPDH esetében az sense 5′-GGGCATCTTGGGCTACACT-3 ’és az antiszensz 5′-GGCATCGAAGGTGGAAGAGT-3’ volt az 5′-AGGACCAGGTTGTCTCCTGCGA-3 ’szondával, amelyet CAL Fluoro Red 610 és BHQ-2 jelölt. A reakciókat az előzőekben leírtak szerint hajtottuk végre (21).

Western blot, inzulinjelző vizsgálat és petefészek kultúra

Az éjszakán át éheztetett egereket rendszeres humán inzulinnal (1,5 egység/ttkg) vagy PBS-sel injektáltuk. A petefészket az injekció beadása után 10 perccel összegyűjtöttük, és theca és granulosa sejt (GC) szétválasztására (25) vagy teljes petefészek inkubációra használtuk. Röviden, a theca és a GC elválasztásához a petefészket a bursából vettük, és McCoy 5A táptalajába (Life Technologies, Grand Island, NY) merítettük, amely 25 mmol/L HEPES-t, 0,1% BSA-t és antibiotikumot tartalmaz (26). A petefészket kézzel szúrták ki egy 26-os tűvel és egy finom hegyű csipesszel. A GC-ket felszabadítottuk a táptalajba, és 250 g-on 5 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. A pelleteket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A petefészek többi, dúsított TI/stromális sejtnek tekintett sejtjét rövid ideig centrifugáltuk és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk.

A fehérjekoncentrációk mérését és a Western blot elemzést a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (17). Röviden: minden egyes egér petefészkéből 5 μg izolált theca sejtet töltöttünk a gélre a Western blot elemzés elvégzéséhez. Elsődleges antitestként foszforilezett (p) AKT (Ser473) vagy AKT nyúl poliklonális antitestjét, IR-β elleni nyúl monoklonális antitestet (4B8; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), nyúl monoklón antitestet citokróm P45017A1 (Cyp17; Abcam, Cambridge, MA), nyúl poliklonális antitest LHR-vel (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia) és egér monoklonális antitest a C4 aktin klónhoz (EMD Millipore, Billerica, MA). A pAKT-t és az összes AKT-t Western-blot-analízissel vagy Bio-Rad Bio-Plex Pro Assays-sel is mértük a Luminex 200-ban (Austin, TX). A pTyr-IRS1 fehérje expressziót pIRS1 Milliplex Map Phospho IRS1 Mapmates készlettel (EMD Millipore) mértük a Luminex 200-ban. Alternatív megoldásként a petefészket 24 lyukú szöveti tenyésztő lemezen inkubáltuk, ahol szöveti tenyésztőhelyek (Millicell-CM, 0,4 μm pórusméret; EMD Millipore) (27,28) McCoy 5A táptalajával. A táptalajt 3 órás inkubálás után (0 óra) gyűjtöttük, és a petefészket friss táptalajjal inkubáltuk 1,6 NE/ml humán koriongonadotropinnal (hCG). A táptalajt ezután 24 órával később (24 óra) összegyűjtöttük.

Szövettan és immunfestés

A petefészket diszsztrotikus egerekből boncoltuk, 10% -os formalin-foszfát-pufferban rögzítettük, és a Johns Hopkins Medical Laboratories (szövettani csoport) teljes egészében 5 μm vastagságúra metszette. Minden 10. szekciót összegyűjtöttünk, és a petefészek metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festettük. A corpora lutea-t (CL), a preantrális tüszőt és az antral folliculust megszámoltuk és Zeiss mikroszkóppal megvizsgáltuk. Az immunfestéshez az egereket egy éjszakán át éheztettük, és 1,5 egység/kg testtömegű inzulint injektáltunk hozzájuk. A petefészkeket 10 perc injekció után összegyűjtöttük és 4% paraformaldehidben rögzítettük. Minden petefészket optimális vágási hőmérsékletű közegben lefagyasztottunk és 5 μm-re vágtuk. A metszeteket primer (pAkt [Ser473]; Cell Signaling Technology) és szekunder antitest kecske anti-nyúl IgG Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Eugene, OR) inkubáltuk, ahogy azt korábban leírtuk (21). A metszeteket AxioCamMR kamerával fényképezték és exportálták az AxioVision szoftverbe.

Statisztikai analízis

Az adatokat párosítatlan Student t teszttel elemeztük GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, Kalifornia) alkalmazásával, kivéve, ha kifejezetten megcímeztük. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki.