Az eperfa levél- és gyümölcskivonat kombinált kezelése javítja az elhízással kapcsolatos gyulladásokat és oxidatív stresszt a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízott egerekben

Hyun Hwa Lim

1 Élelmezési és táplálkozási tanszék, Kyung Hee Egyetem, Szöul, Korea.

Soo Jin Yang

2 Élelmiszer- és táplálkozási és humánökológiai kutatóintézet, Chonnam Nemzeti Egyetem, Gwangju, Korea.

Jurij Kim

3 Táplálkozástudományi és Élelmezésgazdálkodási Tanszék, Ewha Womans Egyetem, Szöul, Korea.

Myoungsook Lee

4 Élelmezési és Táplálkozási Tanszék és Elhízástudományi Kutató Intézet, Sungshin Női Egyetem, Szöul, Korea.

Yunsook Lim

1 Élelmezési és táplálkozási tanszék, Kyung Hee Egyetem, Szöul, Korea.

Absztrakt

Bevezetés

A legtöbb jelenlegi elhízás elleni gyógyszer potenciális mellékhatásokkal jár. Így számos tanulmány olyan természetes vegyületekre összpontosított, amelyeknek nincsenek káros mellékhatásai, de potenciálisan előnyösek az elhízott betegek számára. Az eperfa levél és gyümölcs hosszú ideje a keleti orvostudomány részét képezi, és felvetették, hogy előnyösek az elhízás, a cukorbetegség és a dyslipidaemia megelőzésében vagy kezelésében. 12–16 Egy korábbi tanulmány arról számolt be, hogy az eperfa levelek etanol-kivonata csökkenti a testtömeget, és melanin-koncentráló hormon-1 antagonistaként működik az étrend okozta elhízott egerekben. 12 Számos tanulmány azt is kimutatta, hogy az eperfa levelei gátolják az aktivált B-sejtek nukleáris faktor kappa-könnyűlánc-fokozójának (NF-κB) aktiválódását, amelyet a tumor nekrózis faktor alfa (TNF-α) indukál az érrendszeri endothelsejtekben 17, és szabályozzák a gyulladásos folyamatokat. reakció és oxidatív stressz azáltal, hogy elnyomja a nitrit és tiobarbitursav (TBA) reaktív anyagok termelését a vérben és a szövetekben. 18 Az eperfa gyümölcsében található antocianinok képesek felszabadítani a szabad gyököket és gátolni az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) oxidációját. Ezenkívül az eperfa gyümölcs enyhíti a gyulladást a lipopoliszacharid (LPS) által stimulált elsődleges egér makrofágokban és ízületi gyulladásban szenvedő patkányokban. 20,21

A mai napig a meglévő terápiás bizonyítékok többsége egyetlen dózisú vagy eperfa levél- vagy gyümölcsfajtán alapuló kísérleteken alapul, és az eperfa levél és gyümölcs koktél jótékony hatásait korábban nem vizsgálták az elhízás kutatásában. Feltételeztük, hogy az eperfa levél- és gyümölcs koktél jótékony hatással lehet az elhízás megelőzésére vagy kezelésére a gyulladásos válasz és az oxidatív stressz modulálásával. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez összehasonlították az elhízás, a gyulladás és az oxidatív stressz válaszait az eperfa levélkivonat (MLE) és az eperfa gyümölcs kivonat (MFE) különböző arányaira és dózisaira a magas zsírtartalmú (HF) étrend okozta elhízás rágcsáló modelljében.

Anyagok és metódusok

Növényi anyag és kitermelés

Az eperfa levelét és gyümölcsét a YangPyeong Mezőgazdasági Fejlesztési és Technológiai Központtól (YangPyeong-gun, Dél-Korea) gyűjtötték. A szárított leveleket és gyümölcsöket 70% -os etanollal extraháltuk. Az elegyet leszűrjük, rotációs bepárlóban bepároljuk és liofilizáljuk. A termés az eperfa levelek és gyümölcsök kiinduló száraz tömegének 20, illetve 28% -a volt.

Állatok

A hím C57BL/6 egereket (Orient Bio, Seongnam, Dél-Korea) állandó hőmérsékleten (22 ± 1 ° C) tartottuk, 12 órás sötét/világos ciklus mellett, vízhez és élelemhez ad libitum hozzáféréssel. Egy hetes akklimatizációs periódus után az egereket véletlenszerűen két csoportra osztották: (1) kontroll étrend és (2) HF étrend. Mindegyik csoportot kontroll-diétával (D12450B, 10% kcal zsír; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) vagy HF diétával (D12451, 45% kcal zsír; Research Diet) etettük 9 hétig, ill.

Kísérleti terv

Miután az elhízást a HF diéta indukálta 9 héten keresztül, az egereket nyolc csoportra osztottuk (n = 6 csoportonként) az alábbiak szerint: (1) sovány kontroll (CON), (2) HF diéta által kiváltott elhízott kontroll (HF), (3) HF-étrend az MLE és az MFE 1: 1 arányában 200 (L1: 1), (4) 500 (M1: 1) és (5) 1000 (H1: 1) mg/kg dózisban naponta, és (6) HF diéta az MLE és az MFE 2: 1 arányában 200 (L2: 1), (7) 500 (M2: 1) és (8) 1000 (H2: 1) dózisban mg/kg naponta. A kezeléseket 12 héten keresztül naponta gyomorszondán keresztül adtuk be. A testtömegeket és a táplálékfelvételt a kezelési időszak alatt rögzítettük. A kísérleti periódus végén az állatokat egy éjszakai böjt után intraperitoneális Zoletil/Rompun-nal érzéstelenítettük, és a posztkavális vénából vért gyűjtöttünk. Ezután a szöveteket elkülönítettük és -80 ° C-on tároltuk az elemzésig. Ez a vizsgálati protokoll megfelelt a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó nemzeti egészségügyi intézeteknek, és a Kyung Hee Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága jóváhagyta.

Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt

A kezelési periódus után az egereket egy éjszakán át 16 órás böjtnek vetettük alá. Ezután glükózoldatot (2 g/kg) injektáltunk intraperitoneálisan. A vércukorszintet 0, 15, 30, 60, 90 és 120 perccel mértük a glükózfertőzés után glükométerrel.

Biokémiai elemzés

A plazma trigliceridek (TG), az összkoleszterin (TC) és a nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-C) szintjét enzimatikusan mértük kereskedelmi készletekkel (Bio Clinical System, Anyang, Dél-Korea). Az aterogén indexet (AI) a következő módon becsültük meg: AI = (plazma TC - plazma HDL-C)/plazma HDL-C.

A lipidperoxidáció mérése

A malondialdehid (MDA) szintjét a lipidperoxidáció markerként mértük TBA módszerrel. Májhomogenizátumokat (200 μL) 0,15 M kálium-klorid pufferrel, 0,2 ml 8,1% -os nátrium-dodecil-szulfáttal, 3 ml 20% -os ecetsav – 0,8% TBA keverékkel és 600 μl vízzel adunk hozzá, majd 95 ° C-on melegítjük. 60 percig. Jeges hűtés után 1 ml vizet és 5 ml n-butanol és piridin (15: 1, v/v) elegyet adunk hozzá, és 2500 g-on 10 percig centrifugáljuk. A felülúszók abszorbanciáját 532 nm-en mértük.

Szövettani elemzés

Szövettani metszeteket készítettünk és hematoxilinnal és eozinnal festettük. A foltos részeket optikai mikroszkóppal (HS-100) figyeltük meg. Az epididymális adipocyták átlagos méretét Image J szoftver segítségével mértük (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Western blot elemzés

Májlizátumokat készítettünk, és a fehérjéket nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk, és polivinilidén-fluorid membránokra vittük. A membránokat blokkoltuk, és TNF-α, interleukin-1β (IL-1β), foszfo-nukleáris faktor-kappa B inhibitor alfa (p-IKBα), réz-cink szuperoxid-diszmutáz (Cu-ZnSOD), glicerinaldehid elleni antitestekkel inkubáltuk. -3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA), C-reaktív fehérje (CRP), glutation-peroxidáz (Gpx) (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), indukálható nitrogén-oxid-szintáz (iNOS), hem-oxigenáz-1 (HO-1) és mangán SOD (MnSOD; Stressgen, Victoria, BC, Kanada). A membránokat ezután torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestnek tettük ki (Santa Cruz Biotechnology). A detektálást fokozott kemilumineszcenciás reagenssel (Santa Cruz Biotechnology) végeztük. A Western blot képeket lumineszcens képelemzővel (Gbox; Syngene, Frederick, MD, USA) kaptuk, és a sáv intenzitását számszerűsítettük. A denzitometriás elemzés kiértékeli a fehérje sáv relatív mennyiségét és számszerűsíti az eredményeket az optikai sűrűség szempontjából. A fehérje expresszió szintjét a GAPDH értékére normalizáltuk.

Statisztikai analízis

Asztal 1.

Az eperfa levelek és gyümölcs kivonatok kombinált kezelésének hatása a testtömeg-gyarapodásra, az élelmiszer-bevitelre és annak hatékonysági arányára C57BL/6 egerekben magas zsírtartalmú étrendet tápláltak

Testtömeg-növekedés (g 12 hétig) Élelmiszer-bevitel (g/nap) FER (%)

CON	4,42 ± 0,25 a	2,44 ± 0,07	2,16 ± 0,12 a
HF	12,80 ± 0,85 d	2,41 ± 0,12	5,95 ± 0,68 d
L1: 1	6,93 ± 0,82 abc	2,27 ± 0,01	3,64 ± 0,43 abc
M1: 1	7,73 ± 1,01 BC	2,22 ± 0,09	4,15 ± 0,56 BC
H1: 1	8,59 ± 0,82 c	2,41 ± 0,06	4,23 ± 0,39 BC
L2: 1	5,92 ± 1,29 abc	2,22 ± 0,01	3,17 ± 0,68 abc
M2: 1	5,60 ± 0,92 ab	2,50 ± 0,35	2,79 ± 0,53 ab
H2: 1	8,40 ± 0,80 BC	2,16 ± 0,01	4,62 ± 0,43 cd

Az értékek átlag ± SEM (n = 6).

2. táblázat.

Plazma lipidprofilok C57BL/6 egerekben, eperfa levelek és gyümölcs kivonatok kombinált kezelésével

TC (mg/dL) HDL-C (mg/dL) TG (mg/dL) AI

CON	106,02 ± 9,06 a	65,92 ± 5,62	69,98 ± 5,46 a	0,66 ± 0,03 a
HF	163,38 ± 8,77 b	62,03 ± 6,38	154,37 ± 14,51 b	1,54 ± 0,32 b
L1: 1	137,90 ± 6,60 ab	69,11 ± 6,58	87,14 ± 19,39 a	1,09 ± 0,15 ab
M1: 1	130,54 ± 12,98 ab	74,76 ± 5,50	82,90 ± 13,25 a	0,79 ± 0,21 a
H1: 1	137,46 ± 9,24 ab	67,29 ± 5,07	65,43 ± 7,45 a	0,94 ± 0,22 a
L2: 1	143,99 ± 13,81 b	73,86 ± 5,62	90,20 ± 9,47 a	0,95 ± 0,12 a
M2: 1	137,28 ± 13,40 ab	77,04 ± 8,85	93,37 ± 11,62 a	0,74 ± 0,10 a
H2: 1	140,19 ± 4,74 ab	75,17 ± 1,91	93,32 ± 12,69 a	0,91 ± 0,10 a

Az értékek átlag ± SEM (n = 6).

3. táblázat.

Az eperfa levelek és gyümölcs kivonatok kombinált kezelésének hatása a zsír zsírperoxidációra a C57BL/6 egerek májában

MDA koncentráció (nM)

CON	18,51 ± 0,79 a
HF	25,31 ± 3,38 b
L1: 1	17,22 ± 1,11 a
M1: 1	17,98 ± 1,93 a
H1: 1	18,00 ± 1,93 a
L2: 1	17,33 ± 2,66 a
M2: 1	18,04 ± 1,75 a
H2: 1	17,46 ± 1,71 a

Az értékek átlag ± SEM (n = 6).

A szövettani elemzés (A) máj (eredeti nagyítás, 40 ×) és (B) - epididymális zsírszövetek (eredeti nagyítás, 20 ×), és (C) az epididymális adipocita méretének számszerűsítése. Az értékek átlag ± SEM (n = 6). abcd A változón belüli különbözõ betûk szignifikánsan különböznek a P-n 3. ábra). A máj CRP szintje magasabb volt a HF csoportban, mint a sovány kontrolloké, de az MLE és MFE kezelést követően a szintek jelentősen csökkentek. A máj CRP szintje az M2: 1 csoportban a legalacsonyabb volt az összes kezelési csoport között. A májban az érett IL-1β szint magasabb volt a HF csoportban, mint a sovány kontrollokban. Ezzel szemben a máj IL-1β szintje a kontroll szintre csökkent minden kezelési csoportban. Bár a máj iNOS szintje nem volt szignifikáns különbség a sovány kontrollok és a HF csoport között, az L2: 1 és az M2: 1 csoportokban szignifikánsan csökkent. A máj p-IKBα szintje emelkedett a HF csoportban a sovány kontrollokhoz képest, de ezek a szintek minden kezelési csoportban jelentősen csökkentek. A p-IKBα szint csökkenése nagyobb volt a 2: 1 arányú csoportokban, mint az 1: 1 arányú csoportokban. Az M2: 1 csoportban a p-IKBα szint volt a legalacsonyabb az összes kezelési csoport között.

Oxidatív stressz markerek a C57BL/6 egerek májában eperfa levelek és gyümölcskivonatok kombinált kezelésével: (A) reprezentatív Western blotok az oxidatív stressz markerekhez. (B) A hem-oxigenáz-1 (HO-1), a mangán-szuperoxid-diszmutáz (MnSOD) és a réz-cink SOD (CuZnSOD) denzitometriás elemzése. A fehérje expresszió szintjét a GAPDH értékére normalizáltuk. Az értékek átlag ± SEM (n = 6). abc A változón belüli különbözõ betûk szignifikánsan különböznek a P 22 értéknél, és fontos szerepet játszanak a cukorbetegség kezelésében a máj glükoneogenezisének szabályozásával, 23 ami eperfa levelek antidiabetikus hatását sugallja. Az eperfa leveleiben található flavonoidok csökkentik a plazma TG, TC és LDL koleszterinszintjét a magas koleszterinszintű étrend által kiváltott hiperlipidémiás patkányokban. 24,25 Ezenkívül az eperfa gyümölcs javítja a vér lipidprofilját és a lipid anyagcserét hiperlipidémiás patkányokban. Eredményeink hasonlóan azt mutatták, hogy a kombinált MLE és MFE kezelések szignifikánsan csökkentették a plazma TG szintjét és csökkentették az atherogenitást, amint azt a csökkent AI mutatja a HF csoportba tartozókkal összehasonlítva, kivéve az L1: 1 értéket. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kombinált MLE és MFE kezelések additív vagy szinergikus előnyökkel járhatnak a TG és a koleszterin anyagcsere javításában elhízott patkányokban.

A megnövekedett máj TG-raktárak további zsírfelhalmozódást okoznak a hiperlipidémiás egerekben. Szövettani vizsgálatunk kimutatta, hogy a HF csoportban lévő májokban makrovesicularis és microvesicularis steatosis alakult ki, míg az MLE és MFE 1: 1 és 2: 1 arányú etetésével patkányok csökkent májzsír felhalmozódást mutattak. Továbbá az adipocita hipertrófiát az MLE és az MFE kezelések gátolták, ami összhangban volt a korábbi megállapításokkal, miszerint a három gyógynövény (Melissa officinalis L., Morus alba L. és Artemisia capillaris Thunb) csökkenti a zsírszövet tömegét azáltal, hogy táplálkozás által indukált elhízottaknál gátolja az angiogenezist. egerek. 28 Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az MLE és az MFE kezelések hatékonyan elnyomják a zsírmáj és az adipocita hipertrófiáját.

Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy az MLE és az MFE kombinált kezelésének nagyobb az elhízás elleni hatása, mint egyetlen MLE-kezelésnek. Így a jelen tanulmányban az MLE és az MFE különböző arányait és dózisait kombinációban alkalmaztuk a HF diéta által kiváltott elhízott egereken, hogy meghatározzuk a legjobb arányt és dózist az elhízás kezelésére és a kapcsolódó stresszorok csökkentésére. Összegzésképpen elmondhatjuk, hogy az MLE és az MFE kombinált kezelése hatékony volt az elhízás, az azzal összefüggő gyulladás és oxidatív stressz ellen. Az MLE és az MFE 2: 1 aránya jobb volt, mint a biokémiai fejlesztések 1: 1 aránya. A közepes dózis (500 mg/kg naponta) a 2: 1 arányú csoportok között volt a legjobb az elhízás és az ezzel összefüggő gyulladás és oxidatív stressz kezelésére. Ezenkívül a magas dózis (1000 mg/kg naponta) nem ajánlható az elhízásra gyakorolt szelektív káros hatás miatt. Összességében azt javasoljuk, hogy az MLE és az MFE kombinált kezelése javította a gyulladásban és az oxidatív stresszben szerepet játszó stresszorok több típusát a HF diéta okozta elhízott egerekben.

Elismerés

Ezt a tanulmányt a Koreai Élelmiszeripari, Mezőgazdasági, Erdészeti és Halászati Technológiai Tervezési és Értékelési Intézet támogatásával támogatták (811003-03-1-SB120).