Biliáris koleszterin kiválasztás: Új mechanizmus, amely szabályozza az étrend koleszterin felszívódását

Közreműködött: Jan L. Breslow

Absztrakt

Az állatokat páratartalom- és hőmérséklet-szabályozott helyiségben helyeztük el 12 órás sötét/12 órás fényciklussal a Rockefeller Egyetem Laboratóriumi Állatkutató Központjában. Hacsak másként nem jelezzük, az állatokat 3 hétig etettük 0,02–1 tömeg% koleszterint tartalmazó Picolab (Bouncbrook, NJ) Rodent Chow 20 (5053) pellettel. A koleszterinnel való dúsítást a kristályos koleszterin etil-éterben történő feloldásával érték el, amelyet aztán chow-étrendhez (0,02% koleszterin) kevertünk, és az állatoknak pellet formájában tálaltuk.

A koleszterin felszívódásának mérése.

Az étrendi koleszterin bevitel és a koleszterin tömeg felszívódásának mérése.

A táplálékfelvételt az élelem mérlegelésével mértük, mielőtt az állatokat metabolikus ketrecbe helyeztük és 24 órával azután. Az étrendi koleszterinbevitelt úgy számoltuk, hogy megszoroztuk a táplálékfelvételt az étrendben lévő koleszterin százalékával, és ezt napi koleszterin/testtömeg-g-ban fejeztük ki. A bélből naponta felszívódó étkezési koleszterin tömegét úgy számítottuk ki, hogy az étrendi koleszterinbevitel értékét megszoroztuk az étrendi koleszterin felszívódásának százalékával, és mg/koleszterin/testtömeg-g-ban kifejezve.

Epe aspiráció és a máj koleszterin tartalmának mérése.

Az egereket 6 órán át éheztettük, majd altattuk. A hasüreget ventrális bemetszésen keresztül tesszük ki, és az epehólyag epét leszívjuk. Az epét 4 ° C-on tároltuk, és 14 napon belül elemeztük a koleszterin-, epesav- és foszfolipidtartalmat az alábbiakban leírtak szerint. A májat összegyűjtöttük, lemértük, és 2 ml ddH20-ban homogenizáltuk, és a gázkromatográfiához belső standardként előre meghatározott mennyiségű koprostanolt adtunk. Homogenizálás után 5 ml kloroform/metanol (2: 1, térfogat/térfogat) hozzáadunk, a mintákat erőteljesen vortexeljük és centrifugáljuk, majd a szerves fázist átvisszük és két különálló, friss csőbe osztjuk. Az egyik csőben a koleszterin-észter hidrolízisét 2 ml 1 M KOH 95% -os etanolban történő hozzáadásával és 1 órán át 85 ° C-on történő melegítéssel hajtjuk végre. A hidrolizált és a nem hidrolizált mintákat Perkin – Elmer gáz-folyadék kromatográfban töltött szilícium-dioxid-kapilláris oszlopba fecskendeztük a teljes és a szabad koleszterinszint mérésére. A koleszterin-észtert az összes és a szabad koleszterin közötti különbségként számoltuk. Az adatokat mg koleszterin/g nedves máj tömegben fejezzük ki.

Az epe összetételének elemzése.

Az epe-koleszterint és az epesavakat enzimatikusan mértük Sigma Diagnostics kereskedelmi készletekkel (352, illetve 450-A), a foszfolipideket pedig Wako Commercial GmbH készlettel.

A koleszterin-7α-hidroxiláz és a máj-hidroxi-3-metilglutaril CoA reduktáz (HMGR) aktivitásának mérése.

A széklet epesav-elemzése.

25 mg fagyasztva szárított ürülék és nor-deoxikolsav (9,5 μg 100 μl metanolban) keverékét 1 ml 0,5 N nátrium-hidroxidhoz adjuk, és 1 órán át 60 ° C-on melegítjük. Szobahőmérsékletre történő lehűlés után a termékeket 1 ml vízzel hígítjuk, és négyszer 2 ml hexánnal extraháljuk. A vizes fázist jégben lehűtjük, 50% -os sósavval pH 1-re savanyítjuk, és négyszer 3 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist vízzel semlegesre mossuk és nitrogénatmoszférában 55 ° C-on bepároljuk. A terméket 3% metanolos sósavval kezeljük 4 órán át szobahőmérsékleten, az oldószert 55 ° C-on nitrogénatmoszférában bepároljuk, és a maradékot trimetil-szililezésnek vetjük alá 100 μl Sil-Prep-szel (Alltech Associates) 30 percig. 55 ° C. Nitrogén atmoszférában történő bepárlás után a képződött trimetil-szilícium-éter-metil-észtereket 200 μl hexánban oldjuk, és 1-2 μl-t használunk a gáz-folyadék kromatográfiához (27). Szükség esetén az epesavak trimetil-szilícium-éter-metil-észtereinek tömegspektrumát a korábban leírtak szerint határoztuk meg (28).

EREDMÉNYEK

Az első kísérletet a széklet β- [3H] szitosztanol és [14C] koleszterin kiválasztásának időbeli lefolyásának vizsgálatára tervezték az egérben. Ebben a kísérletben az állatokat metabolikus ketrecekbe helyeztük, és jelzett keverékkel szondáztattuk, és az ürüléket 4 egymást követő napon keresztül naponta összegyűjtöttük és a módszerekben leírtak szerint dolgoztuk fel. Amint az 1. ábrán látható, ilyen körülmények között a széklet β- [3H] szitosztanol több mint 98% -a és a [14C] koleszterin 86% -a nyerhető vissza az ürülék első 24 órájában. Ez azt jelzi, hogy egy 24 órás gyűjtés elegendő az egér koleszterin felszívódásának mérésére, és ezt használták az összes későbbi kísérlethez.

A [3H] β-szitosztanol és a [14C] koleszterin napi ürülékürítése. A C57BL/6 hímeket [3H] β-szitosztanollal és [14C] koleszterinnel szoptattuk, és metabolikus ketrecekbe helyeztük, és az ürüléket naponta 4 egymást követő napon át gyűjtöttük. A napi [3H] és [14C] kiválasztás százalékos arányát a székletben 4 nap alatt kinyert összes címke összeséből ábrázoljuk (átlag ± SD, n = 5).

Az étrendi koleszterin abszorpció szabályozásának mechanizmusának vizsgálatához a C57BL/6 egereket növekvő mennyiségű koleszterinnel etették, és az étkezési koleszterin minden szintjén a százalékos felszívódást mérték. Amint a 2A. Ábra mutatja, az étrendi koleszterinszint növekedésével az étrendben felszívódó koleszterin százalékos arányban csökken. A 0,02% koleszterin étrendhez képest az 1% koleszterin diéta 50% -kal csökkent az étrendi felszívódó százalékban. Az étrendi napi felszívódó koleszterin tömegének és az étrendben lévő koleszterin tömegszázalékának a felvétele telített görbét eredményezett, amelyet 0,4 tömegszázalék Km és napi 0,65 mg koleszterin/testtömeg-g Vmax jellemez, amint az az ábrán látható. 2B. Tehát a C57BL/6 egerekben az étrend koleszterin felszívódása telíthető folyamatnak tűnik.

Az akut étkezési koleszterin kapcsoló hatása a koleszterin felszívódásának százalékára. A C57BL/6 egereket 3 hétig kondicionáltuk 0,5% koleszterinnel, és mértük a koleszterin felszívódását (szilárd oszlop). Ugyanazokat az állatokat további 3 hétig etettük ugyanazzal az étrenddel, radioaktívan jelölt keverékkel szoptattuk, és azonnal utána 0,02% koleszterinszintre váltottunk. A következő 24 órában 0,02% koleszterinszintű étrend fogyasztása közben székletet gyűjtöttünk és mértük a koleszterin felszívódását (nyitott oszlop). (Átlag ± SD, n = 5.)

Az étrendi koleszterin hatása a máj HMGR és 7α-hidroxiláz aktivitására és az epe összetételére. A C57BL/6 egereket 3 hétig növekvő mennyiségű koleszterinnel etettük. Az epehólyag epét leszívták és elemezték. A HMGR (■) és a koleszterin-7a-hidroxiláz (○) aktivitását izolált májmikroszómákban határoztuk meg. Az epe-koleszterint (•) és az epesavakat (▴) a módszerekben leírtak szerint mértük (átlag ± SD, n = 5).

Az abszorpció százalékos aránya az epe-koleszterinhez. A C57BL/6 egereket 3 hétig etettük 0,02–1% koleszterinnel. Megmértük a koleszterin felszívódását, felszívtuk az epehólyag epeit és megmértük a koleszterin tartalmát.

Ezt a hipotézist tovább teszteltük a koleszterin felszívódásának tanulmányozásával SR-BI Tg állatokban. Feltételeztük, hogy a HDL-koleszterin epébe történő kiválasztódásának stimulálása elnyomja az étrendi koleszterin felszívódását ezekben az állatokban. Amint az 1. táblázat mutatja, az SR-BI túlexpressziója szignifikánsan megnövelte a koleszterin biliaris koncentrációját (141 ± 7 és 195 ± 28 mg/dl a kontrollban és az SR-BI Tg, ill. P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Epeösszetétel és koleszterin felszívódás 0,02% koleszterinnel táplált kontroll és SR-B1 Tg állatokban

VITA

Jelen tanulmány eredményei határozottan arra utalnak, hogy az étrendben lévő koleszterin felszívódása telíthető folyamat, és rávilágít a mechanizmusra. A C57BL/6 egerekben az étkezési koleszterin növekvő mennyisége csökkenti az étrendben felszívódó koleszterin százalékát. Ez a csökkenés korrelál a legjobban az epe koleszterin koncentrációjának növekedésével, amelyet viszont úgy tűnik, hogy befolyásol a teljes napi étrendi koleszterin bevitel, az étrendi koleszterin napi tömeges felszívódása és a máj koleszterin észter tartalma. Az SR-BI Tg egérben az epe-koleszterin megnövekedett koncentrációja hasonló jelenségeket eredményezett, például az étrendi koleszterin felszívódásának százalékos csökkenését. Ezek az eredmények együttesen a C57BL/6 és az SR-BI Tg egerekben ok-okozati összefüggésre utalnak a megnövekedett epe-koleszterin-tartalom és az étrendi koleszterin felszívódásának telítettségének jelensége között.

A növekvő mennyiségű étkezési koleszterin etetése után mások beszámoltak az étrend koleszterin felszívódásának hatékonyságának csökkenéséről egereknél (8, 9), majmoknál (10) és embereknél (11), de a mechanizmust még nem határozták meg. Quintao és mtsai. (11), humán vizsgálatokban eredetileg azt javasolta, hogy ez a jelenség a jelöletlen koleszterinnel jelölt csere miatt következik be a bél lumenében, ami a jelzett koleszterin felszívódásának csökkenését eredményezte a magas koleszterinszintű diétán. Utóvizsgálatok során azonban Samuel és McNamara (13) kimutatták, hogy a bélnyálkahártya hozzájárulása a luminalis koleszterinhez, akár izotópcsere, akár koleszterin szekréció révén, minimális, ezért nem tudja megmagyarázni az étrendben felszívódó koleszterin százalékos változását. Kísérleteink, amelyek során a magas étkezési koleszterinszintű, előzetesen kondicionált állatokat alacsony étrendi koleszterinszintre cserélték, és nem sikerült növelniük az abszorpció százalékát (3. ábra), határozottan ellenzik ezt a lehetőséget.

A jelen tanulmányban bemutatott adatok határozottan jelzik, hogy az étrendi koleszterin felszívódásának százalékos mértékű elnyomását az étrendi koleszterin növekvő mennyiségének táplálásával az epe összetételének változása okozza. Konkrétan, vad típusú egerekben megmutathattuk, hogy az étrendi bevitel széles tartományában az étrendi koleszterin bélből történő felszívódásának hatékonysága erősen fordítottan korrelál az epében lévő koleszterin koncentrációjával (5. ábra). Hipotézisünket az SR-BI Tg egérrel végzett vizsgálatok is alátámasztják. Chow-étrenden ezeknél az állatoknál a plazma HDL-koleszterinszintje jelentősen csökkent és a máj HDL-koleszteril-észter frakcionális katabolikus arányának 6-7-szeres növekedése volt (NW, Takeshi Arai, Yong Ji, Franz Rinninger és ART, publikálatlan adatok), arra utal, hogy ezekben az állatokban a HDL-koleszterin jelenti az epe-koleszterin fő forrását. Ezek a megfigyelések erős bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a koleszterin epébe történő kiválasztása, legyen az étrendi vagy endogén (pl. HDL-koleszterin), fontos szerepet játszik az étrendi koleszterin felszívódásának hatékonyságának szabályozásában.

Összefoglalva, a jelen tanulmányban egérmodellt alkalmaztunk annak bemutatására, hogy az étrendi koleszterin felszívódásának hatékonysága összefügg az epébe történő koleszterin kiválasztás szabályozásával. Ha hasonló mechanizmusok működnek az emberekben, akkor a koleszterin kiválasztásának alapjául szolgáló molekuláris események tisztázása az epeutakba új betekintést nyerhet az étrendi koleszterinre való reagálás megértésében, és esetleg új megközelítéseket vezethet be az érelmeszesedés megelőzésében.