GIP elleni oltás az elhízás kezelésére

Tagság Cytos Biotechnology AG, Schlieren, Svájc

Állategészségügyi Élettani Intézet és Integratív Humán Élettani Központ, Vetsuisse Kar, Zürichi Egyetem, Zürich, Svájc

Tagság Cytos Biotechnology AG, Schlieren, Svájc

Állategészségügyi Élettani Intézet és Integratív Humán Élettani Központ, Vetsuisse Kar, Zürichi Egyetem, Zürich, Svájc

Tagság Cytos Biotechnology AG, Schlieren, Svájc

Alma Fulurija,
Thomas A. Lutz,
Katja Sladko,
Melania Osto,
Peter Y. Wielinga,
Martin F. Bachmann,
Philippe Saudan

Ábrák

Absztrakt

Háttér

A WHO szerint világszerte több mint egymilliárd embernek van túlsúlya, és fennáll annak a veszélye, hogy krónikus betegségek, köztük szív- és érrendszeri betegségek, 2-es típusú cukorbetegség, magas vérnyomás és stroke alakulhatnak ki. A jelenlegi terápiák korlátozott hatékonyságot mutatnak, és gyakran kellemetlen mellékhatásprofilokkal társulnak, ezért orvosi szükség van új terápiás beavatkozásokra az elhízás területén. A gyomor-gátló peptidet (GIP, más néven glükózfüggő inzulinotróp polipeptid) nemrégiben feltételezték, hogy összekapcsolja a túlzott táplálkozást az elhízással. Valójában a GIP-receptor-hiányos egerek (GIPR -/-) teljesen védettek voltak az étrend által kiváltott elhízástól. Így a GIP szignalizáció megzavarása ígéretes új terápiás stratégiát jelent az elhízás kezelésében.

Módszertan/fő megállapítások

A GIP szignalizáció blokkolásához aktív vakcinázási megközelítést választottunk a vírusszerű részecskékhez kovalensen kapcsolt GIP peptidek (VLP-GIP) alkalmazásával. Az egerek VLP-GIP-vel történő oltása magas titer specifikus antitesteket és hatékonyan csökkentette a testtömeg-növekedést a magas zsírtartalmú étrenddel etetett állatokban. A testtömeg-növekedés csökkenése a zsír felhalmozódásának csökkenésének tudható be. Ezenkívül fokozott súlycsökkenést figyeltek meg elhízott, VLP-GIP-vel oltott egereknél. Fontos, hogy a GIP inkretin hatása ellenére a VLP-GIP-vel kezelt egerek nem mutatták a glükóz intolerancia jeleit.

Következtetések/jelentőség

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a GIP elleni oltás biztonságos és hatékony volt. Így az aktív oltás újszerű, tartós elhízási kezelést jelenthet. Azonban további preklinikai biztonságossági/toxikológiai vizsgálatokra lesz szükség, mielőtt a terápiás koncepció emberben kezelhető lenne.

Idézet: Fulurija A, Lutz TA, Sladko K, Osto M, Wielinga PY, Bachmann MF és mtsai. (2008) GIP elleni oltás az elhízás kezelésére. PLoS ONE 3 (9): e3163. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003163

Szerkesztő: Alessandro Bartolomucci, Parmai Egyetem, Olaszország

Fogadott: 2007. december 11 .; Elfogadott: 2008. augusztus 15 .; Közzétett: 2008. szeptember 9

Finanszírozás: A munka nagy részét a Cytos Biotechnology AG végezte és finanszírozta.

Versenyző érdeklődési körök: A. Fulurija, K. Sladko, P. Saudan és M.F. A Bachmann a Cytos Biotechnology AG munkatársa, és részvényeket vagy részvényopciókat tart a vállalatnál.

Bevezetés

A gyomor-gátló peptid, más néven glükózfüggő inzulininotróp polipeptid (GIP) ezen peptid hormonok egyike. A GIP egy 42 aminosav, gyomor-bélrendszeri polipeptid, amely tápanyagok bevitele után szabadul fel a nyombél és a jejunális K-sejtekből, és bebizonyosodott, hogy megkönnyíti mind a glükóz, mind a zsír eltávolítását [12]. A GIP gyorsan hat a hasnyálmirigy β-sejtjeire, serkenti az inzulin felszabadulását, biztosítva ezzel a glükóz gyors felvételét a szövetbe. Ezenkívül a GIP elősegíti a zsírlerakódást és a triglicerid felhalmozódását az adipocitákban. Konkrétan kimutatták, hogy a GIP elősegíti a triglicerid kiürülését a keringésből [13], [14], ezt a folyamatot részben a lipoprotein lipáz aktivitást stimuláló képessége közvetíti [15]. Ezenkívül a GIP receptorok expresszálódnak az adipocitákon [16], összhangban a GIP ezen sejteken betöltött közvetlen szerepével. Nemrégiben kimutatták, hogy a GIP-receptor-hiányos egerek (GIPR -/-) teljesen védettek az étrend okozta elhízástól [17]. Hasonlóképpen, a legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a GIP-receptor antagonistával végzett kezelés csökkentett súlygyarapodáshoz vezetett a magas zsírtartalmú étrenddel táplált egereknél és a fogyás elhízott egereknél [18] - [20]. Ezért a GIP szignalizáció megzavarása ígéretes, újszerű terápiás stratégiát jelent az elhízás kezelésében.

A GIP-specifikus, semlegesítő antitestek oltással történő indukálása különösen vonzó lehetőség, mivel a GIP blokkolása hosszan tartó lenne. Korábban kimutattuk, hogy a nagyon ismétlődő vírusfelületeken megjelenő antigének megtörhetik a B-sejtek toleranciáját [21], és a vírusszerű részecskék (VLP-k) felületén megjelenő epitópok képesek hatékonyan indukálni az önspecifikus antitest-válaszokat egerekben és emberekben [22]. ] - [26]. Ebben a tanulmányban azt mutatjuk be, hogy a GIP elleni oltás megakadályozza a magas zsírtartalmú étrendet fogyasztó rágcsálók túlzott testtömeg-növekedését, és elhízott egereknél fokozott súlyvesztést vált ki. Ezért az aktív oltás vonzó és kényelmes új terápiát jelenthet az elhízás kezelésében.

Eredmények

A GIP elleni oltás magas szintű GIP-specifikus antitesteket eredményez

A GIP elleni oltás megvédi a diéta okozta elhízástól

(A) Testtömeg-növekedés immunizált egerekben. A nőstény egereket (0., 14., 28., 42. és 133. napon) 100 ug Qβ-GIP vagy Qβ VLP-vel immunizáltuk, és magas zsírtartalmú étrendbe helyeztük (35% zsír/tömeg%). Az átlagos testtömeg +/− SEM (n = 6) látható. A testtömeg-növekedés szignifikánsan csökkent a Qβ-GIP-ben - összehasonlítva a Qβ VLP-vel immunizált állatokkal a 70. naptól kezdve (kétirányú ANOVA F (1,80) = 18,55, p 3. ábra. A GIP elleni oltás növeli az energiafelhasználást és az anyagcsere sebességét).

Indirekt kalorimetria immunizált egerekben. A nőstény egereket (0., 14., 28., 42. és 125. napon) Qβ-GIP (n = 8) vagy Qβ VLP-kkel (n = 10) immunizáltuk és magas zsírtartalmú étrendre helyeztük. Közvetett kalorimetriát végeztünk a csoport felén a 128. napon, a másik felén pedig a 139. napon. Ezen mérések kombinált adatait mutatjuk be. (A) Oxigénfogyasztás (VO2). A bal oldali panel mutatja az átlagos oxigénfogyasztást +/− SEM. A Qβ-GIP-vel oltott állatok statisztikailag szignifikánsan megnövekedett VO2-értéket mutatnak (p 0,05). Az összes statisztikai elemzést kétoldalas t-próbákkal végeztük.

A GIP elleni vakcinázást követően a glükóz homeosztázis nem változik

A GIP elleni oltás nem zavarja a lipid anyagcserét

A GIP elleni oltás lipid anyagcserére gyakorolt hatásainak tisztázása érdekében 4 hónapon belül az első injekció után magas zsírtartalmú étrenddel etetett vakcinázott állatoknál meghatároztuk a szérum lipidprofilokat. A Qβ-GIP-vel immunizált egerekben nem figyeltünk meg szignifikáns különbségeket az összkoleszterin, a HDL, az LDL vagy a vLDL tekintetében a kontroll egerekhez képest (5A. Ábra). Hasonlóképpen, a triglicerid- és a szabad zsírsavprofilokat rendszeres időközönként monitorozták az oltott és a magas zsírtartalmú étrendben tartott kontrollállatokban. Amint az 5B. Ábra mutatja, nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a két kísérleti csoport között. Mivel a GIP köztudottan elősegíti a triglicerid kiürülését a keringésből [13], [14], megvizsgáltuk, hogy az oltott állatokban volt-e hatással az étkezés utáni lipid-clearance. Az orális lipidtolerancia teszteket (OLTT) magas zsírtartalmú étrenddel ellátott vakcinázott egereknél végeztük a 36., a 93. és a 163. napon. Az olívaolajat orális szondával adtuk be, és a vérben a TGL koncentrációt a megadott időpontokban határoztuk meg. A lipideket mindkét kísérleti csoportban hasonló kinetikával eliminálták, ami azt jelzi, hogy a GIP elleni oltás nem befolyásolta a TGL eliminációt (5C. Ábra).

(A – C) A nőstény egereket (0., 14., 28., 42. nap) Qβ-GIP vagy Qβ VLP-vel immunizáltuk és magas zsírtartalmú étrendre helyeztük. (A) A szérum lipidprofilja egerekben a 122. napon. Az összes, vLDL, LDL és HDL koleszterint mértük. Átlagos értékek ± SEM (n = 10) vannak feltüntetve. Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a csoportok között (p> 0,05). (B) Szérum TGL és FFA profilok egerekben. A megjelölt időpontban Qβ VLPs ± SEM-sel (n = 5) immunizált kontroll állatok százalékos arányát mutatjuk be a trigliceridekre és a szabad zsírsavakra. A csoportok között nem figyeltek meg szignifikáns különbséget a TGL vagy az FFA szintekben (p> 0,05). (C) Étkezés utáni lipid-clearance egerekben. A nőstény egereket (0., 14., 28., 41. és 126. napon) Qβ-GIP vagy Qβ VLP-vel immunizáltuk és magas zsírtartalmú étrendbe helyeztük. Az OLTT-t a megadott időpontokban hajtottuk végre. A bal oldali panel a 36. napon elvégzett OLTT-t mutatja. Az összes vizsgált időpont AUC-je a jobb oldalon látható. Az átlagos trigliceridszinteket vagy az AUC ± SEM értékeket (n = 5) minden csoportra vonatkozóan feltüntetjük. Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a csoportok között (p> 0,05). Az összes statisztikai elemzést kétoldalas t-próbával végeztük.

Vita

Bár előnyös a testtömeg-növekedés csökkentésében, az önantigén, a GIP elleni oltás aggályokat vethet fel az autoimmun reakciók kiváltásával kapcsolatban. A nemkívánatos auto-gyulladásos válaszok kockázatát az oltásunkkal minimálisra csökkentjük [33]. Először egy oldható molekulát célozunk meg, csökkentve az antitestfüggő citotoxicitást. Másodszor, a T-helper sejtepitópokat a hordozó biztosítja, és egy rövid GIP-célpeptid erősen csökkenti annak valószínűségét, hogy az oltóanyag auto-reaktív T-sejteket indukál. Ennek ellenére részletes hisztopatológiát végeztek az oltott állatokban, és más zsigeri szervekben nem figyeltek meg bélspecifikus gyulladást vagy oltással kapcsolatos károsodást.

A lipid metabolizmus vizsgálata nem mutatott változást a vLDL-, az LDL- és a HDL-koleszterin koncentrációban a Qβ-GIP-vel oltott egerek szérumában. Hasonlóképpen, a triglicerid és a szabad zsírsav szintje, valamint az étkezés utáni lipid clearance nem változott az oltott állatokban. Összességében ez a tanulmány azt mutatja, hogy a GIP elleni aktív immunizálás erősen csökkenti a testtömeg-növekedést egerekben, magas zsírtartalmú étrend mellett, a vércukorszint vagy a lipid homeosztázis romlása nélkül.

Sőt, egy elhízott hím egereken végzett előzetes kísérletben azt sugallja, hogy a GIP elleni aktív oltás nemcsak megakadályozza a túlzott súlygyarapodást a magas zsírtartalmú étrenddel etetett állatokban, hanem fokozhatja az elhízott egerek fogyását is (S3. Ábra).

Anyagok és metódusok

Állatok

A 8 hetes C57BL/6 egereket (~ 20 g) a Harlan Netherlands-től (Horst, Hollandia) vásároltuk. Az állatokat kórokozóktól mentes létesítményekben helyezték el, és az immunizálás előtt 2 hétig hagyták őket akklimatizálódni. Valamennyi kísérletben az egereket csoportokba helyezték, kivéve azt az időszakot, amely alatt meghatározták az energiafelhasználást és a táplálékfelvételt. Az S3. Ábrán bemutatott terápiás kísérletet hím egerekkel, minden más kísérletet nőstény egerekkel végeztük. Hacsak másként nem jelezzük, az állatokat a kísérleti időtartamig ad zsírosan magas zsírtartalmú étrenddel (35 tömegszázalék w/v (Diet 2127), Provimi Kliba, Svájc) ad libitum etették, és szabadon hozzáférhettek a vízhez. A kísérletek összhangban voltak a Svájci Szövetségi Állat-egészségügyi Hivatal (BVET) irányelveivel.

Vakcinagyártás

Immunizálás és in vitro vizsgálatok

Az állatokat szubkután immunizáltuk 100 µg (egerek) vagy 300 µg (patkányok) Qβ-GIP vagy Qβ VLP-kkel, 200 µl PBS-sel hígítva, a megjelölt időpontokban. A GIP-specifikus antitest-titereket ELISA-val határoztuk meg standard protokollok szerint, sertés GIP-t (Bachem # H-6220) 2,5 µg/ml koncentrációban bevonva. Az ELISA-titer a szérumhígítás reciprokjaként határozható meg, amely a telítettségnél a maximális optikai sűrűség felének eléréséhez szükséges. Verseny ELISA-khoz Qβ-GIP-vel immunizált egerek szérumkészletét hígítottuk 1-2500-ra, és növekvő koncentrációjú sertés GIP-vel (Bachem # H-6220), egér GLP-1-vel (Bachem # H6795) vagy egér-oxyntomodulinnal (Bachem #) inkubáltuk. H6058). Egy éjszakai inkubálás után a szabad antitest mennyiségét GIP-specifikus ELISA-val meghatároztuk. Az in vivo kötési kísérletekhez a Qβ-GIP-vel immunizált és naiv egereket intravénásán 1 ng I 125 -GIP-vel (Bachem H-5016) fertőztük, majd 30 perc múlva az állatokat leöltük és a szérumot szívpunkcióval gyűjtöttük. A teljes IgG-t fehérje G gyöngyökkel húzták le a szérummintákból (Amersham, # 17-0618-02). Meghatároztuk a protein-G gyöngyök asszociációját és a szabad radioaktivitást, és kiszámítottuk az antitesthez kötött GIP százalékos arányát.

A GIP-receptort túlzottan expresszáló CHOK1 sejtek generálása és kötődési vizsgálatok.

Testtömeg és testösszetétel elemzés

Az állatokat nagy pontosságú mérleg segítségével lemértük. A testösszetételt kettős energiájú röntgenabszorpciós pásztázással (Piximus Series Densitometer, GE Medical Systems, Madison, USA) határoztuk meg az ICS-ben (Illkirch, Franciaország).

Glükóz és lipid homeosztázis

A teljes vércukor, koleszterin, TGL, HDL, LDL, vLDL és FFA szintet 16 órás böjt után mértük. A BGL-t glükométerrel (Accu-Chek Aviva, Roche) határoztuk meg. A koleszterin, a TGL és az FFA szintjét enzimatikus vizsgálatokkal határoztuk meg az Olympus AU400 automatizált laboratóriumi munkaállomáson az ICS-ben (Illkirch, Franciaország). A lipidprofilokat az F.P.L.C. (Dionex). A HbA1c szintet teljes vérből határoztuk meg az A1cNow monitorozó készlet segítségével (Metrika # 0520105). Az OGTT esetében az egereket 16 órán keresztül éheztettük, majd 2 g/testtömeg-kg vizet tartalmazó glükózt adtunk orális szondával. A BGL-t a megadott időpontokban határoztuk meg. Az OLTT esetében az egereket 16 órán át éheztettük, majd orális szondával 8,35 µl/g olívaolajat adtunk be. A TGL szintet teljes vérből mértük a CardioChek P.A. analizátor (PTS Inc.).

Energiafogyasztási kísérletek

Az energiafogyasztást, az aktivitást és a légzési hányadost (RQ) 24 órán át (sötét és világos fázis) mértük két nyitott áramkörű kalorimetriás rendszer (Integra rendszer, AccuScan Instruments Inc., Columbus OH) alkalmazásával. Az egereknek 5 napig hagytuk alkalmazkodni a metabolikus ketrecekhez. Az oxigénfogyasztás (VO2) és a széndioxid termelés (VCO2) mérésére az egereket légmentesen zárt légzőketrecekbe helyeztük, amelyeket folyamatosan körülbelül 1 l/perc áramlási sebességgel szellőztetünk. Mindegyik ketrechez 20 percig, 2 perces időközönként mintát vettünk a levegőből. Az RQ jelentése VCO2 (L)/VO2 (L). Az RMR-t úgy számítottuk ki, hogy a könnyű fázis során minden kísérleti csoportban a 3 legalacsonyabb VO2-értéket vettük fel. A fizikai aktivitást 24 órás időtartamú nyalábtörések mérésével határoztuk meg. A fizikai aktivitást 16 infravörös fénysugár-érzékelő 3 tömbjével figyeltük meg, majd cm-ben megtett távolsággá alakítottuk át. Az adatokat AccuScan Integra ME szoftverrel elemeztük.

Hisztopatológia

A szövetmintákat 4% paraformaldehidben rögzítettük, metszettük és H&E-vel festettük standard módszerekkel. A szövettani értékelést szakképzett állatorvosi patológus végezte.

Statisztikai analízis

A testtömeg, a vércukorszint és a fruktozamin adatok elemzéséhez kétirányú ANOVA-t használtunk. Az összes többi statisztikai elemzést kétoldalas hallgatói t-teszttel végeztük. Az OGTT görbe alatti területeit a Prism Graphpad szoftver segítségével határoztuk meg.

segítő információ

S1. Ábra.

A Qβ-GIP által indukált antitestek in vivo keresztreakcióval nem jártak a GLP1-gyel és az OXM-mel. Qβ-GIP immunizált egerek. az egereket iv. 1 ng I125-GIP, I125OXM vagy I125 GLP1. Kontroll naiv egereknek 1 ng I125-GIP-t adtunk. 30 perccel később meghatároztuk az antitesthez kötött GIP, OXM vagy GLP1 mennyiségét. Az antitesthez kötött GIP, OXM vagy GLP-1 ± SEM százalékos arányát mutatjuk be (n = 4). Míg az injektált GIP legtöbbje antitestekkel társult, Qβ-GIP immunizált egerekben csak az OXM vagy a GLP1 háttérszintjét találták az antitest frakcióval kapcsolatban.

S2. Ábra.

A GIP elleni oltás nem vált ki gyulladást a GIT-ben. A nőstény, C57BL/6 egereket szubkután immunizáltuk 100 µg Qβ-GIP-vel vagy Qβ VLP-vel a 0., 14., 28. és 42. napon. Az állatokat a kísérlet kezdetétől fogva magas zsírtartalmú (35% zsír/térfogat%) táplálékkal etették. . Az egereket a 99. napon feláldoztuk. A szövetmintákat fixáltuk, metszettük és H&E-vel festettük standard módszerekkel. Minden csoportból egy reprezentatív egér látható. A minta patológus általi szövettani elemzése a Qβ-GIP-vel immunizált állatokban nem mutatott gyulladás jeleit a Qβ-val kezelt kontroll állatokhoz képest. Hasonló eredményeket értünk el, amikor az állatokat a 36. vagy a 142. napon selejteztük és egy patológus elemezte.

S3. Ábra.

A GIP elleni oltás súlyvesztést eredményez elhízott hím egerekben. A hím egereket 4 hónapig táplálták magas zsírtartalmú étrenddel. Ekkorra már minden állat súlyosan elhízott és 45-50 g közötti súlyt ért el. Ezután az állatokat (0., 14., 36., 50. és 119. napon) Qβ-GIP vagy Qβ VLP-vel immunizáltuk, és magas zsírtartalmú étrenden tartottuk (35% zsír/tömeg/térfogat). Az étrend zsírtartalma a 42. naptól kezdve 20% zsírtartalomra csökkent. A testtömeg átlagos változásai ± SEM (n = 10). A Qβ-GIP-vel kezelt állatok lényegesen nagyobb súlyt vesztettek, mint a Qβ VLP-vel immunizált állatok a 70. naptól kezdve (kétirányú ANOVA F (1162) = 9,82, p = 0,0057).

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk Dr. Paula Grestnek (Zürichi Egyetem Állatorvosi Kórtani Intézete) a szövetminták és képalkotások hisztopatológiai értékeléséért, valamint Dr. Jens Holstnek az emberi GIP receptort expresszáló 3T3 sejtvonal biztosításáért és Dr. Lidia Ivanovának a klónozáshoz nyújtott segítségért a GIP receptor.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: AF TAL MO PYW MFB PS. Végezte a kísérleteket: AF KS MO. Elemezte az adatokat: AF TAL KS MO PYW MFB PS. Írtam a papírt: AF TAL PYW MFB PS.