A bél mikrobiotájának változásai a magas zsírtartalmú étrendben táplált patkányokban korrelálnak az elhízással kapcsolatos anyagcsere-paraméterekkel

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Virginie Lecomte, Nadeem O. Kaakoush

Társadalmi Orvostudományi Iskola, UNSW Australia, Sydney, Új-Dél-Wales, Ausztrália

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Virginie Lecomte, Nadeem O. Kaakoush

Biotechnológiai és Biomolekuláris Tudományok Iskola, UNSW Australia, Sydney, Új-Dél-Wales, Ausztrália

Társadalmi Orvostudományi Iskola, UNSW Australia, Sydney, Új-Dél-Wales, Ausztrália

Biotechnológiai és Biomolekuláris Tudományok Iskola, UNSW Australia, Sydney, Új-Dél-Wales, Ausztrália

Társadalmi Orvostudományi Iskola, UNSW Australia, Sydney, Új-Dél-Wales, Ausztrália

Virginie Lecomte,
Nadeem O. Kaakoush,
Christopher A. Maloney,
Mukesh Raipuria,
Karina D. Huinao,
Hazel M. Mitchell,
Margaret J. Morris

Ábrák

Absztrakt

Az elhízott fenotípusra adott válaszként a bél mikrobiota összetételének változásának első bizonyítékát elhízott ob/ob egerekben mutatták ki; ezeknél az egereknél kevesebb Bacteroidete és több Firmicute volt [8]. Ezenkívül az obesogén bélmikrobiális populáció ötlete akkor merült fel, amikor ugyanazok a szerzők felfedezték, hogy az elhízás fenotípusa bél mikrobiota transzplantációval továbbadható egerekben [9].

Ley és munkatársai megerősítették ezeket a megfigyeléseket elhízott embereknél [10], de a bél mikrobiota phyla emberi elhízással összefüggő változásának pontos jellege továbbra is ellentmondásos [11–14]. Számos tanulmány azonban összefüggéseket mutatott ki a baktériumok gazdagsága és a testtömeg-index (BMI), az adipozitás, a diszlipidémia és az inzulinrezisztencia között [15].

A bél mikrobiota összetételét nagymértékben befolyásolja a gazdakörnyezet [16,17]. A diéta az egyik olyan tényező, amelyre a bél mikrobiota reagál [18]. Állatokban a magas zsírtartalmú étrend (HFD) megváltoztatja a Bacteriodetes és Firmicutes phyla mennyiségét [8,19–23]. A HFD hatására bekövetkezett változásokról osztály- és rendelési szinten is beszámoltak, de a közelmúltig a technikai korlátok megakadályozták a mélyebb szintű vizsgálatot, hogy lehetővé tegyék a jelentős változások azonosítását család- vagy fajszinten [24].

A bél mikrobiota a metabolikus betegségek potenciális terápiás célpontja. Bár az étrendi beavatkozások normalizálhatják a bél mikrobiota összetételét túlsúlyos és elhízott személyeknél, célzottabb megközelítésekre van szükség [32]. A bél mikrobiális összetételének manipulálására használt két fő stratégia bizonyos fajok növekedésének és aktivitásának szelektív stimulálása prebiotikumok vagy élő baktériumokat tartalmazó probiotikumok, probiotikumok adagolásával [33,34]. Ahhoz azonban, hogy ezek a stratégiák hatékonyak legyenek, a metabolikus szindróma kialakulásában részt vevő fajok ellen kell célozni őket. A legtöbb olyan tanulmány, amely elemezte az elhízással járó bél mikrobiotát, csak a menekültügyi szintről számolt be. A jelenlegi tanulmányban egy 16S rRNS nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiát alkalmaztunk, amely először patkányokban figyelt fel a bél mikrobiotájának változásaira a HFD-re reagálva faji szinten. Továbbá bebizonyítjuk, hogy a fajok számának számos változása szorosan korrelált az elhízással járó metabolikus paraméterek romlásával, kiemelve e fajok szerepét az elhízás kialakulásában és a lehetséges terápiás célpontokban.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Ezt a vizsgálatot szigorúan az ausztráliai állatok tudományos célú gondozására és felhasználására vonatkozó kódex (1969), az 1985-ös Animal Research Act és a New South Wales Animal Research Regulation 2010 ajánlásainak szigorú betartásával hajtották végre.

Minden állatkísérletet az Új-Dél-Wales-i Egyetem Állatgondozási és Etikai Bizottsága (ACEC) hagyott jóvá (ACEC # 11/25A). Minden erőfeszítést megtettünk az állatok szenvedésének és stresszének minimalizálása érdekében. Az eutanáziát mély altatásban hajtották végre, amelyet ketamin/xilazin keverék váltott ki.

Állatgondozás

Az Állatkutatási Központból (ARC, Perth, Ausztrália) érkező 6 hetes hím Sprague Dawley patkányokat tiszta létesítményben helyeztük el, ketrecenként kettőt 12:12 órás világos/sötét ciklus alatt. Az akklimatizáció után a patkányokat két, azonos átlagos testtömegű csoportra osztották (n = 10/10). A kontroll patkányokat kontroll chow-val etettük (11 kJ/g, 12% zsír, 21% fehérje, 65% szénhidrát, százalékos energia; Gordon's Stockfeeds, NSW, Ausztrália), míg a HFD csoportnak három különböző étrend közül választhattak: a kontroll chow, kereskedelmi zsírtartalmú pelletezett étrend SF03-020 (20 kJ/g, 43% zsír, 17% fehérje, 40% szénhidrát; Speciális takarmányok, Glen Forest, WA, Ausztrália) és egy módosított chow, amely porított chow-ból, édesített sűrített tejből áll és telített állati zsír (zsírzsír; 15,4 kJ/g; 51% zsír, 10% fehérje, 38% szénhidrát) 16 hétig. Az átlagos 24 órás táplálékfelvételt hetente számolták ki, gondosan összegyűjtve és lemérve a ketrecben maradt ételt, és levonva ezt az ismert mennyiségből.

Glükóz és inzulin tolerancia teszt

Glükóz tolerancia tesztet végeztek 21 hetes korban (13 hetes diéta) egy éjszakai böjt után. Két g glükózt/testtömeg-kg (30% w/v) adtunk intraperitoneálisan mindegyik patkánynak, és a vércukor-koncentrációt 0, 15, 30, 45, 60, 90 és 120 percnél mértük Accu-check Go glükóz alkalmazásával. méter (Roche diagnostic, Castle Hill, NSW, Ausztrália). Az inzulinméréshez szükséges vérmintákat heparinnal bevont csövekbe vettük 0, 15, 30, 60 és 120 percen belül. A vér centrifugálása után kapott plazmamintákat -20 ° C-on tároltuk.

Az inzulin tolerancia tesztet ismét elvégezték 22 hetes korban, 6 órával az étel eltávolítása után. Egy NE/kg testtömeg inzulint (100 NE/ml Actrapid, NovoNordisk) adtunk be, és a vércukor-koncentrációt 0, 15, 30, 45, 60, 90 és 120 percnél mértük.

Minta kollekció

24 hetes korban egy éjszakán át éheztetett patkányokon vércukorszintet teszteltek, majd altattak (xilazin/ketamin 15/100 mg/kg; Provet, Castle Hill, NSW, Ausztrália). A testtömeg és az orr-anális hosszának mérése után a vért szívszúrást követően heparinnal bevont csövekbe vettük. A vért 5 percig 13 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk (Eppendorf Minispin; Crown Scientific, NSW, Ausztrália), és a plazmát -20 ° C-on tároltuk hormon (leptin és inzulin) és triglicerid mérés céljából. A patkányokat lefejezéssel leölték. Retroperitonealis és epididimális fehér zsírszöveteket (RpWAT; epiWAT) boncoltunk és lemértünk. Állatonként egy székletmintát gyűjtöttünk a vakbél végső részéből, és a vizsgálat előtt -80 ° C-on tároltuk.

Plazma trigliceridek, leptin és inzulin vizsgálatok

A plazma triglicerideket kolorimetriásan (490 nm; iMark Microplate Absorbance Reader, Bio-Rad, Gladesville, NSW, Ausztrália) elemeztük kereskedelemben kapható triglicerid reagens (GPO-PAP, Roche diagnostic, Castle Hill, NSW, Ausztrália) és glicerin standard (Sigma) felhasználásával., Castle Hill, NSW, Ausztrália). A plazma leptin és inzulin koncentrációit a kereskedelemben kapható radioimmunoassay készletek segítségével elemeztük a gyártó utasításai szerint (Merck Millipore, Billerica, MA, USA), és megszámoltuk egy WIZARD 2 automata gamma számlálóval (PerkinElmer, Melbourne, VIC, Ausztrália). Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki. Az antropometriai és metabolikus paramétereket Student kétfarkú t-próbájával elemeztük, miután szükség esetén a normalitást és az adatok transzformálását ellenőriztük, az SPSS 20. verziójával (SPSS Inc., Chicago, USA).

DNS kivonás és mikrobiális közösség szekvenálás

A DNS-kivonást az ISOLATE Fecal DNS Kit (Bioline; Alexandria, NSW, Ausztrália) felhasználásával végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. A DNS koncentrációját és minőségét Nanodrop ND-1000 spektrofotométerrel (Nanodrop Technologies; Wilmington, USA) mértük.

A mikrobaközösséget a 16S rRNS gén nagy áteresztőképességű szekvenálásával értékeltük. A tag-kódolású FLX amplikon piroszekvenálást (bTEFAP) a korábban leírtak szerint hajtottuk végre, a Gray28F (5’TTTGATCNTGGCTCAG) és a Gray519r (5 ’GTNTTACNGCGGCCGGTT) [35–38] primereket használva, az alapozók az E. coli 16S rRNS vonatkozásában számozva voltak. A szekvenáló könyvtár generálásához egylépéses, összesen 30 ciklusú PCR-t, a Hot Start és a HotStar nagy pontosságú taq-polimerázok keverékét, valamint a 28F-ből származó és szekvenciázó, 400 bp átlagos olvasási hosszúságú amplikonokat tartalmazó keveréket használtuk. A PCR-t a következő körülmények között hajtottuk végre: 94 ° C-on 3 percig, majd 30 cikluson át 94 ° C-on 30 másodpercig; 60 ° C 40 másodpercig és 72 ° C 1 percig; és egy utolsó megnyúlási lépést 72 ° C-on 5 percig. A címkével kódolt FLX amplikon piroszekvenálási analízisek egy Roche 454 FLX műszert használtak titán reagensekkel. Ezt a bTEFAP eljárást a Molekuláris Kutatólaboratóriumban (MR DNS; Shallowater, TX) hajtották végre megállapított és validált protokollok alapján [35–38].

A nagy áteresztőképességű szekvenálási folyamatból származó Q25 szekvenciaadatokat a Molecular Research LP-nél kifejlesztett csővezeték segítségével elemeztük. A szekvenciákat először kimerítették vonalkódokból és primerekből, majd rövid, 97% -os szekvenciákat, fajokat; 97% és 95% között, osztályozatlan fajok; 95% és 90% között, osztályozatlan nemzetség; 90% és 85% között, osztályozatlan család; 85% és 80% között, osztályozatlan sorrend; 80% és 77% között, osztályozatlan menedékjog; 1. ábra Testsúly a 16 hetes étrend-kísérlet során.

A fekete vonal a patkányokat éli étrenden (n = 10); a szürke vonal a magas zsírtartalmú étrendben lévő patkányokat jelöli (n = 10). Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. *** P 1. táblázat. Metabolikus paraméterek 16 hetes diéta után.

A megnövekedett zsírtömegnek megfelelően a plazma leptinszintje négyszer magasabb volt a HFD-vel táplált patkányokban a kontroll patkányokhoz képest (P 2. ábra. Glükóz tolerancia és inzulinérzékenység.

a) Glükóz tolerancia teszt 13 hetes diéta után. A fekete vonal a patkányokat éli étrenden (n = 10); a szürke vonal a magas zsírtartalmú étrendben lévő patkányokat jelöli (n = 10). b) A GTT görbe alatti területe 90 percnél számítva. A fekete doboz a chow-étrendben lévő patkányokat ábrázolja; a szürke doboz a magas zsírtartalmú étrendben lévő patkányokat jelöli. c) Inzulin tolerancia teszt 14 hét diéta után. d) Az ITT görbe feletti terület 120 percen számítva. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * P 3. ábra: Az étrendtípusok közötti átlagos diverzitás a Shannon-Weaver változatosság index (H) alkalmazásával az összes taxonómiai szintre.

A sokféleség statisztikája: T-teszt: df = 13 a phyla esetében (egyenlőtlen variancia) és df = 18 az összes többi taxonómiai szinten; Manny-Whitney U teszt: df = 1. p (t) a t-teszt P-értéke, p (W) a Mann-Whitney U-teszt P-értéke. A hibasávok az átlag standard hibáját jelzik.

A mikrobaközösségek változásainak elemzése

Előzetes alapkomponens-analízist (PCA) végeztek a baktériumok phyla összetételében mutatkozó különbségek vizualizálására az étrendtípusok között, valamint annak meghatározására, hogy melyik phyla kapcsolódik a legerősebben a megfigyelt különbségekhez. A PCA megerősítette, hogy a chow-val és a HFD-vel táplált patkányok mintái különálló klasztereket képeznek az ordinációs ábrán (S1 ábra). Ez a szétválasztás a PC1 tengely mentén volt a legszembetűnőbb, amely a teljes variáció 71,0% -át magyarázta, és amelyek esetében a Bacteroidetes és a Firmicutes volt a legmagasabb korreláció (0,406 és -0,836) (S1 ábra). A PC2 tengely a teljes variáció 22,5% -át magyarázta (S1 ábra), azonban ezen komponensen keresztül nem tettek különbséget az étrendcsoportok között.

Az elsődleges tengely azt a kumulatív hozzájárulást mutatja, hogy az egyes taxonómiai azonosságok hozzájárulnak az étrendtípusok közötti átlagos eltérésekhez. A megjelenített hozzájárulások felső határai a phyla átlagos különbségének 100% -át, az osztályban, a rendben és a családban az átlagos eltérés akár 90% -át, a nemzetségben és a fajban az átlagos eltérés legfeljebb 50% -át jelentik. A másodlagos tengely az egyes megjelenített taxonómiai azonosságok átlagos eltérését/szórását (δ/SD) mutatja. Az egyes étrendtípusok közötti mikrobiális összetétel% -os eltérését az egyes grafikonok mutatják.

A mikrobaközösségek 37,53% -os eltérést mutattak a rendelés szintjén. Az osztályszinthez hasonlóan a% kumulatív járulék is kezdett elegyenlülni a Desulfovibrionales-nél, a deltaproteobaktériumok rendjén belül. A Lactobacillales és a Clostridiales uralta a szarvasmarha táplált patkánymintákat, míg a HFD a Lactobacillalesek kimagaslóan alacsonyabb mennyiségével és a Clostridiales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Erysipelotrichales és Desulfovibrionales nagyobb mennyiségével volt összefüggésben (4. ábra és 2. táblázat). Ez a mintázat összhangban volt az osztály szintű baktériumok összetételével, amelyben ezek a rendek képviseltették magukat

A megfelelő osztályszintű bőségük 100% -a (2. táblázat). Ezen taxonok közül a Lactobacillales, Bacteroidales, Enterobacteriales és Desulfovibrionales volt a legmagasabb δi/SD, és így jobban megkülönböztették az étrend típusait (4. ábra).

A különbségek családi szinten ismét 44,65% -ra nőttek, az Erysipelotrichaceae taxonnál a% kumulatív járulék kezdett elsimulni (4. ábra). A várakozásoknak megfelelően a Lactobacillaceae uralta a mikrobiotát a chow-étrend alatt álló patkányokban, ez a megállapítás valószínűleg összefüggésben áll a mikrobiota alacsonyabb változatosságával ezekben a patkányokban, összehasonlítva a HFD-vel táplált patkányokkal (3. ábra). Ezt támasztja alá a Lactobacillaceae jelentősen alacsonyabb mennyisége a HFD-vel táplált patkányokban (2. táblázat), valamint más fontos csoportok nagyobb száma, köztük a Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Veillonellaceae, Porphyromonadaceae és Erysipelotrichaceae. Ezen taxonok közül a Veillonellaceae volt a legmagasabb δi/SD értékkel, és valószínűleg ezen a taxonómiai szinten volt a legjobb megkülönböztető az étrendtípusok között, valószínűleg annak köszönhető, hogy hiányzik a szarvasmarhával etetett patkányokban.

A mikrobaközösségek eltérései a nemzetségi és a faji szinten 46,5%, illetve 53,71% voltak. A% kumulatív hozzájárulás a Parabacteroides és a Bacteroidetes vulgatus esetében kezdett el kiegyenlíteni a nemzetség és a faj esetében (4. ábra és S2 ábra). Ismét a Lactobacillus és pontosabban a Lactobacillus zarnuis dominálta a mikrobiotát a szarvasmarhával etetett patkányokban (4. ábra és 2. táblázat). Ezzel szemben a magas zsírtartalmú táplálékkal etetett patkányokban a Lactobacillus zarnu jelentősen alacsonyabb volt, más fontos nemzetségek nagyobb számban, köztük a Blautia, Morganella, Bacteroides, Phascolarctobacterium és Parabacteroides (2. táblázat). Ezekben a nemzetségekben az érdeklődő fajok a Blautia producta, a Morganella morgani, a Phascolarctobacterium besorolatlanok, a Bacteroides fragilis, a Parabacteroides distasonis és a Bacteroides vulgatus voltak (2. táblázat). Ezen taxonok közül a Phascolarctobacterium volt a legmagasabb δi/SD értékkel, ami nagy valószínűséggel annak köszönhető, hogy hiányzik a szarvasmarhával etetett patkányokban (2. táblázat). Összességében az egyes étrendtípusok között különféle közösségi profilokat figyeltünk meg minden taxonómiai szinten, és szignifikánsan nagyobb változatosságot figyeltünk meg a HFD-vel táplált patkányokban menedék, család, nemzetség és faj szintjén (5. ábra).

Ezek a taxonok hozzájárulnak a phyla átlagos eltérésének 100% -ához, az osztály, a rend és a család átlagos eltérésének akár 90% -áig, a nemzetségeknél és a fajoknál pedig az átlagos eltérések akár 50% -áig, amint azt a SIMPER grafikonok mutatják (4. ábra).

A mikrobiális bőség összefüggése az anyagcsere paraméterekkel

A baktériumok bőségének összefüggését az elhízással kapcsolatos hét metabolikus paraméter mérésével minden patkányon olyan taxonoknál végeztük, amelyek leginkább hozzájárulnak az étrendcsoportok közötti különbségekhez (6. ábra). A tesztelt paraméterek a következők voltak: Változás a testtömegben, a zsír tömegében az öléskor, a leptin, az inzulin és a triglicerid plazmakoncentrációi, az AUC GTT által kifejezett glükóz tolerancia és az AAC ITT által kifejezett inzulin érzékenység.

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "Diéta" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Bélbaktériumok" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Elhízottság" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Zsírszövet" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Testsúly" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Inzulin" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Lactobacillus" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Emésztőrendszer" alkalmazható erre a cikkre? igen nem