Változások a bél mikrobiota-szabályozásában Metabolikus endotoxémia okozta gyulladás a magas zsírtartalmú étrendben - elhízás és cukorbetegség egerekben

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS-A cukorbetegséget és az elhízást alacsony fokú gyulladás jellemzi, amelynek molekuláris eredete ismeretlen. Korábban megállapítottuk, hogy egyrészt az anyagcsere-endotoxémia szabályozza a gyulladásos tónust, a testtömeg-gyarapodást és a cukorbetegséget, másrészt, hogy a magas zsírtartalmú táplálás modulálja a bél mikrobiotáját és a lipopoliszacharid (LPS) plazmakoncentrációját, vagyis a metabolikus endotoxémiát. Ezért továbbra is bizonyítani kellett, hogy a bél mikrobiota változásai szabályozzák-e a metabolikus betegségek előfordulását.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREKMegváltoztattuk a bél mikrobiotáját antibiotikus kezeléssel, hogy bemutassuk egyrészt, hogy a bél mikrobiota változásai felelősek lehetnek a metabolikus endotoxémia, az alacsony fokú gyulladás, az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség szabályozásáért, másrészt pedig néhány felelős mechanizmust biztosítanak az ilyen hatás érdekében.

EREDMÉNYEK-Megállapítottuk, hogy az antibiotikum-kezelés által kiváltott bél mikrobiota-változások csökkentették a metabolikus endotoxémiát és az LPS cecalis tartalmát mind a magas zsírtartalmú, mind az ob/ob egerekben. Ez a hatás korrelált a csökkent glükóz intoleranciával, a testtömeg-növekedéssel, a zsírtömeg fejlődésével, az alacsonyabb gyulladással, az oxidatív stresszel és a makrofág infiltráció marker mRNS expressziójával a zsigeri zsírszövetben. Fontos, hogy a magas zsírtartalmú táplálás erősen megnövelte a bél áteresztőképességét és csökkentette a szűk kereszteződések fehérjéit kódoló gének expresszióját. Továbbá, az ob/ob CD14 -/- mutáns egerekben a CD14 hiánya utánozta az antibiotikumok metabolikus és gyulladásos hatásait.

KÖVETKEZTETÉSEKEz az új megállapítás azt mutatja, hogy a bél mikrobiotájának változásai olyan mechanizmus révén szabályozzák a metabolikus endotoxémiát, a gyulladást és a kapcsolódó rendellenességeket, amely növelheti a bél permeabilitását. Ezért hasznos lenne stratégiákat kidolgozni a bél mikrobiota megváltoztatására a bélpermeabilitás, a metabolikus endotoxémia és a kapcsolódó rendellenességek ellenőrzésére.

DGGE, denaturáló gradiens gélelektroforézis
FITC, fluoreszcein-izotiocianát
IL, interleukin
LPS, lipopoliszacharid
MDA, malondialdehid
MCP, monocita kemotaktikus fehérje
PAI-1, plazminogén aktivátor inhibitor 1
RPL19, riboszomális fehérje L19
TBARS, tiobarbitursav-reaktív anyagok
TNF-α, tumor nekrózis faktor-α
ZO-1, zonula occludens-1

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Tizenkét hetes hím C57bl6/J egereket (Charles River, Lyon, Franciaország) és 6 hetes ob/ob (n = 13) egereket (C57bl6 háttér; The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) egy ellenőrzött környezet (fordított 12 órás nappali ciklus, világítás 10:00 órakor), szabad hozzáférés az élelmiszerekhez és a vízhez. Az egereket kontroll (n = 13) (A04, Villemoisson sur Orge, Franciaország) vagy magas zsírtartalmú, szénhidrátmentes étrend (magas zsírtartalmú, n = 17) táplálásával 4 héten keresztül tápláltuk. A mikroflóra szerepét kontroll (kontroll antibiotikum, n = 13), magas zsírtartalmú (magas zsírtartalmú antibiotikum, n = 17) vagy ob/ob (ob/ob antibiotikum, n = 8) egerek kezelésével vizsgálták. antibiotikumokkal (1,0 g/l ampicillin [Sigma, St. Louis, MO] és 0,5 g/l neomicin [Sigma] ivóvízben) a kísérleti időszak alatt. Az ampicillin és a neomicin széles spektrumú antibiotikumok, amelyek gyengén felszívódnak (vagy felszívódnak, mint a neomicin esetében), és így szisztémás hatások nélkül (13). A magas zsírtartalmú étrend 72% zsírt (kukoricaolaj és sertészsír), 28% fehérjét tartalmazott, és -/- egereket, CD14 -/- egereket (C57bl6 háttér) kereszteztünk ob +/−, majd F1 kettős heterozigótákat alkalmaztunk az ob/ob CD14 -/- és ob/ob genotípusok előállításához. A következő állatkísérleti eljárásokat a helyi etikai bizottság, a Rangueil Kórház állatetikai bizottsága és az Université catholique de Louvain.

RNS kivonás a vakbél tartalmából.

A bakteriális RNS-eket a vakbéltartalomból BioRobot-EZ1 (Qiagen, Hilden, Németország) alkalmazásával extraháltuk, a gyártó utasításainak megfelelően. Dióhéjban a vakbél tartalmát gyöngyverőben 2 percig 0,3 g üveggyöngyöket és 750 μl QIAzol lízis reagenset tartalmazó steril mikrocentrifuga csőben homogenizálták. 150 μl kloroform: izoamil-alkohol (24: 1) hozzáadása után a mintákat 15 másodpercig vortexeljük, majd szobahőmérsékleten 2-3 percig állni hagyjuk. Végül a mintákat 12 000 g-vel 15 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, és 300 μl felülúszót töltöttünk a BioRobot berendezésbe.

A vakbaktériumok gradiens gélelektroforézis profiljának denaturálása.

A bakteriális RNS-t a 16S rRNS gén V3 régióját megcélzó RT-PCR-rel amplifikáltuk, a HDA1-GC és HDA2 univerzális baktérium primerek és egy korábban leírt program (14) (HDA1-GC, 5′-CGCCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGT ′ -GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3 ′). Az RT-PCR-t Qiagen One-Step RT-PCR kit alkalmazásával hajtottuk végre. Az elektroforézist DCode készülékkel (Bio-Rad) és 6% poliakrilamid gélekkel végeztük, 30–55% gradiens 7 mol/l karbamid és 40% (vol/vol) formamid mellett, amely az elektroforézis irányába növekedett. Az elektroforetikus vizsgálatokat Tris-acetát-EDTA pufferben (40 mmol/l Tris, 20 mmol/l ecetsav és 1 mmol/l EDTA) végeztük 130 V és 60 ° C hőmérsékleten 270 percig. A géleket 30 percig SYBR Safe 1 × (Invitrogen) -val festettük, ioncserélt vízzel öblítettük és UV-átvilágítással néztük meg. A denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) profilokat összehasonlítottuk a Dice hasonlósági együttható meghatározásával és a Bionumerics szoftvercsomaggal (4.01 verzió, Applied Maths) 1–2% érzékenységgel.

Székletelemzések.

A vakbél tartalmát vákuumban szárítottuk. A nem emésztett szénhidrátok, fehérjék és lipidek fennmaradó részét a korábban leírt módon számszerűsítettük (15,16). A teljes LPS-tartalmat kivontuk és megmértük a korábban leírtak szerint (17,18).

A mikrobiális szekréttartalom kvantitatív RT-PCR meghatározása.

Glükóz tolerancia tesztek.

Az orális glükóz tolerancia teszteket a következőképpen hajtottuk végre: a 6 órás éhező egereknek szondával injekcióztak glükózt (1 g/kg glükóz, 20% glükóz oldat). A vércukorszintet glükózmérővel (Roche Diagnostics, Meylan, Franciaország) határoztuk meg 3,5 μl véren, amelyet a farok vénájának hegyéből gyűjtöttünk össze. Ezenkívül a plazma inzulin koncentrációjának értékeléséhez 20 μl vérből vettünk mintát 30 perccel a glükóz kiváltása előtt és 15 perccel azután. A plazmát elválasztottuk és –80 ° C-on lefagyasztottuk.

Valós idejű kvantitatív PCR.

A zsírszövet morfometriája és festése.

Az adipociták átlagos relatív arányát és átlagos felületét egy pontszámlálási technikával becsültük meg a paraffinba ágyazott szöveteken, az előzőekben leírtak szerint (4).

Bélpermeabilitás in vivo.

Ez az intézkedés a 4000 Da-os fluoreszcens-dextrán (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) béláteresztő képességén alapul, amint azt korábban leírtuk (19). Röviden, a 6 órás éhgyomri egereket szondával (600 mg/testtömeg-kg, 125 mg/ml) injektáltuk fluoreszcein-izotiocianát (FITC) -dextránnal. 1 óra elteltével 120 μl vért gyűjtöttünk a farokér vénájából. A vért 4 ° C-on, 12 000 g-on 3 percig centrifugáltuk. A plazmát azonos térfogatú PBS-sel (pH 7,4) hígítottuk, és fluoreszcencia spektrofotométerrel (HTS-7000 Plus-lemez-olvasó; Perkin Elmer, Wellesley, MA) elemeztük a FITC-dextrán koncentrációt 485 nm gerjesztési hullámhosszon és az emissziós hullámhossz 535 nm. A minták FITC-dextrán-koncentrációjának kiszámításához standard görbéket kaptunk úgy, hogy a FITC-dextránt PBS-sel hígított kezeletlen plazmában hígítottuk (1: 2 [vol/vol]).

Biokémiai elemzések.

A plazma LPS-koncentrációt egy Limulus amebocita-kivonaton alapuló készlet segítségével határoztuk meg (LAL kit endpoint-QCL1000; Cambrex BioScience, Walkersville, MD), ahol a mintákat 1/40-től 1/100-ig hígítottuk és 10 percig 70 ° C-on hevítettük. Az értékelésbe beletartozott a visszanyerés kiszámításának belső ellenőrzése. A plazma inzulin koncentrációját 5 μl plazmában határoztuk meg ELISA kit segítségével (Mercodia, Uppsala, Svédország) és a gyártó utasításait követve. A zsigeri zsírszövet oxidatív stressz szintjét a lipidperoxidáció és a reaktív vegyületek, például a malondialdehid (MDA) és a 4-hidroxinonénális, természetes lipidperoxidáció melléktermékek mérésével értékeltük. A lipidperoxidáció másodlagos aldehidtermékei az oxidatív stressz elfogadott markerei. A tiobarbitursav-reaktív anyagok (TBARS) a lipidperoxidáció szűrésének és monitorozásának jól megalapozott vizsgálatát képezik. Az MDA és a tiobarbitursav közötti reakció következtében a mintákban képződött adduktokat spektrofotometriásán mértük. A TBARS szinteket egy MDA ekvivalencia standard alapján határoztuk meg.

Statisztikai analízis.

Az eredményeket átlag ± SE értékként adjuk meg. A különbségek statisztikai szignifikanciáját egyirányú ANOVA-val elemeztük, amelyet post hoc (Bonferroni többszörös összehasonlító tesztje), vagy Pearson-féle korreláció követett, a Windows GraphPad Prism 4.00 verziójával (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia; www.graphpad.com). A különböző felső indexű adatok jelentősen eltérnek egymástól (P ± 0,04 log μg/g; kontroll antibiotikum, 1,30 b ± 0,26 log μg/g; magas zsírtartalmú, 0,93 c ± 0,07 log μg/g; magas zsírtartalmú antibiotikum, 0,02 d ± 0,2 log μg/g). Sőt, azt tapasztaltuk, hogy a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott metabolikus endotoxémia a bélpermeabilitás szabályozásában szerepet játszó mechanizmustól függ. Kimutattuk, hogy a magas zsírtartalmú táplálás drámai módon megnövelte a bélpermeabilitást (1C. Ábra) egy olyan mechanizmussal, amely az epitheliális szoros kapcsolódási fehérjék, például a ZO-1 és az Occludin (1D – G ábra) csökkent expressziójával társult, bár csak tendenciát figyeltek meg okklúdinra. Ezt a hatást az antibiotikum-kezelés teljesen helyreállította. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a bélbaktériumok részt vesznek a kontroll bélpermeabilitásban és ezen felül a metabolikus endotoxémiában.

Az antibiotikum-kezelés csökkentette a zsírszövetes táplálékkal táplált egerekben a zsírszövet-gyulladás, az oxidatív stressz és a makrofág-infiltráció markerek előfordulását.

A metabolikus endotoxémia pozitív korrelációban áll a gyulladással, az oxidatív stresszel és a makrofág infiltrációs markerekkel.

Annak megállapítására, hogy a bél mikrobiota és a metabolikus endotoxémia változásai kontrollálták-e a zsigeri zsírszövet gyulladását, oxidatív stresszét és makrofág infiltrációját, többféle korrelációs elemzést végeztünk e paraméterek között. A metabolikus endotoxémia pozitívan és szignifikánsan korrelál a PAI-1, IL-1, TNF-α, STAMP2, NADPHox, MCP-1 és F4/80 mRNS-sel (4A – C. Ábra; 1. kiegészítő ábra, amelyet az online melléklet [elérhető a http://dx.doi.org/10.2337/db07-1403 címen]]. Ugyanezt a célt szem előtt tartva más korrelációkat végeztünk, és azt találtuk, hogy az összes gyulladásos marker, az oxidatív stressz és a makrofág infiltráció markerek pozitívan és szignifikánsan korrelálnak egymással (4D – I. Ábra). Összességében ezek a többszörös összefüggések szoros kapcsolatot támasztanak alá bél mikrobiota, endotoxémia, gyulladás és oxidatív stressz a magas zsírtartalmú étrend táplálása során.

Az antibiotikum-kezelés megakadályozta a magas zsírtartalmú étrend okozta adipocita hipertrófiát.

Korábban beszámoltunk arról, hogy a magas zsírtartalmú étrend növelte az adipocita sejtek méretét (4), és itt megerősítettük ezeket az adatokat (5A., B. És D. Ábra). Továbbá azt is feltételeztük, hogy ennek oka lehet egy LPS-függő mechanizmus (4). Ezért arra voltunk kíváncsiak, hogy az antibiotikus kezelés által kiváltott csökkent metabolikus endotoxémia összefüggésben áll-e az adipocita sejtméret változásával. A zsírszegény antibiotikummal kezelt egerekben csökkent az átlagos adipocita méret a magas zsírtartalmú kezeletlen egerekhez képest (5A, B és D ábra). Ezeket a változásokat alacsonyabb sejtsűrűség kísérte, összehasonlítva az összes csoporttal (5.C ábra).

Az antibiotikum-kezelés javította a cukorbetegség és az elhízás metabolikus paramétereit magas zsírtartalmú étrenddel etetett egereknél.

Az ob/ob egerek antibiotikum-kezelése csökkentette az endotoxémiát.

Ahhoz, hogy felmérjük a bél mikrobiota hozzájárulását a metabolikus endotoxémia és gyulladás kialakulásához, függetlenül a magas zsírtartalmú táplálkozástól, ob/ob egerekhez fordultunk. Ezeket az állatokat a magasabb gyulladásos tónus és a plazma LPS-koncentráció jellemzi, míg normális chow-t fogyasztanak (23). Az antibiotikumokkal kezelt ob/ob egerek egyik vakbéltartalmában szinte semmilyen bakteriális RNS-t nem mutattak ki, ami arra utal, hogy hasonlóan a magas zsírtartalmú egerekhez, az antibiotikum-kezelés drámai hatást gyakorolt az ob/ob bél mikrobiális populációjára. Ennek oka lehet a megnövekedett táplálékbevitel, ezért az antibiotikum-bevitel is. A baktériumok mennyiségi meghatározása megerősíti a DGGE profilt, és jelentős csökkenést mutat a Lactobacillus spp., A Bifidobacterium spp. És a Bacteroides-Prevotella spp. (Asztal 1). Ezenkívül adataink azt mutatták, hogy az ob/ob egerek kezelése csökkentette a metabolikus endotoxémiát (7A. És B. Ábra). Az endotoxémia azonban továbbra is magasabb maradt, mint a kontrollértékek.

Az ob/ob egerek antibiotikum-kezelése csökkentette a zsírszövet gyulladásos markereinek mRNS-koncentrációját, valamint a cukorbetegség és az elhízás metabolikus paramétereit.

A PAI-1 és F4/80 mRNS-koncentrációja szignifikánsan csökkent az ob/ob antibiotikummal kezelt egerek zsigeri zsírraktáraiban és kisebb mértékben a szubkután zsírraktárakban (7H, I, L és M ábra). Hasonlóképpen, a zsigeri zsírraktár-lipid-peroxidok, az oxidatív stressz markerei, kétszer alacsonyabbak voltak az antibiotikummal kezelt egereknél (7N. Ábra). Ezenkívül a glükóz intolerancia (7C. Ábra), az inzulinrezisztencia index (7F. Ábra), a glükóz által kiváltott inzulin szekréció (7E. Ábra), valamint a zsigeri és a szubkután zsírszövet súlya (7J és K ábra) csökkent az antibiotikum-kezeléssel . A testtömeg jelentős változását azonban nem észlelték (7G ábra).

Az LPS receptor CD14 hiánya részben megfordította az ob/ob egerek gyulladásos markereit és metabolikus paramétereit.

Mi és mások korábban bebizonyítottuk, hogy az LPS-receptor hiánya véd a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott zsírszövet-gyulladás és anyagcsere-rendellenességek ellen (4,24–28). Annak bemutatására, hogy az LPS receptor részt vehet az ob/ob egerek gyulladásos fenotípusában, ob/ob CD14 -/- egereket állítottunk elő. Itt megmutattuk, hogy ob/ob CD14 -/- egerekben a PAI-1 és az F4/80 mRNS koncentrációja csökkent a zsigeri zsírraktárakban (7H és L ábra). Ez az oxidatív stressz markerek csökkenésével járt (7N. Ábra). Mindezek a paraméterek változatlanok maradtak a szubkután zsírraktárban, összehasonlítva az ob/ob egerekkel, ami azt mutatta, hogy a CD14 által közvetített gyulladás a zsigeri zsírt célozta meg. Ezenkívül a vércukorprofilok, az inzulinrezisztencia-index, a glükóz által kiváltott inzulinszekréció, a zsigeri és a szubkután zsírszövet súlya, valamint a lipidperoxidáció csökkent az ob/ob CD14 -/- ben, összehasonlítva az ob/ob egerekkel (7C-N ábra).

VITA

Itt számoltunk be arról, hogy a bélbaktériumok részt vesznek a magas zsírtartalmú étrendben és az ob/ob által kiváltott metabolikus endotoxémiában, a zsírszövet gyulladásában és az anyagcserezavarokban. Ezt a hatást olyan mechanizmus közvetítheti, amely növelheti a bél áteresztőképességét és fokozhatja az LPS felszívódását. Az antibiotikum-kezelés jelentősen csökkenti a plazma LPS-szintjét, a béláteresztő képességét, valamint a zsigeri zsírszövet-gyulladás, az oxidatív stressz, a makrofágok beszűrődése és az anyagcserezavarok előfordulását. Ezért arra a következtetésre jutunk, hogy a bél mikrobiota képes szabályozni a bélpermeabilitást, amely meghatározza azt a küszöböt, amelynél a metabolikus endotoxémia által kiváltott anyagcserezavarok jelentkeznek.

A nem bélfüggő endotoxémiás források keresése során a parodontitis az anyagcserezavarok kialakulásához is kapcsolódhat (44). Számos tanulmány arról számolt be, hogy a periodontitis antibiotikumokkal történő kezelése javult anyagcsere-paraméterekkel jár (45). Ennek ellenére az ilyen antibiotikus kezelésnek a bél mikrobiotájára gyakorolt hatását nem vizsgálták, de szerepet játszhat a metabolikus fenotípus javulásában.

Összefoglalva, először azt mutattuk be, hogy a magas zsírtartalmú, táplálékkal táplált egerekben a bél mikrobiota modulációja fokozott bélpermeabilitással társul, amely megelőzi a metabolikus endotoxémia, gyulladás és a kapcsolódó rendellenességek kialakulását (8. ábra). Másodszor azt tapasztaltuk, hogy ob/ob egerekben a bél mikrobiota meghatározza a plazma LPS koncentrációját, és az anyagcserezavarokban szerepet játszik. Összességében bemutatjuk, hogy a bél mikrobiota határozza meg a metabolikus endotoxémia küszöbét.