A biobank-léptékű ritka és gyakori variánselemzések felhasználásával az ASPHD1 azonosítható a reproduktív tulajdonságok fő mozgatórugójaként a 16p11.2 lokuszban

Absztrakt

Bevezetés

Míg a GWAS több ezer összefüggést azonosított a közös genetikai variánsok és a komplex tulajdonságok között, az ok-okozati gének meghatározásának sikerességi aránya aránytalanul alacsony volt [24, 25]. Ennek a kihívásnak egy nemrégiben javasolt megoldása magában foglalja az expressziós kvantitatív tulajdonság lokusz (eQTL) adatok metszését a GWAS kockázati lokuszokkal [26, 27], a stratégia neve Mendelian Randomization (MR). Ennek a megközelítésnek a célja a gén-tulajdonság asszociációk feloldása és az ok-okozati hatások erősségének becslésének képessége a GWAS lokuszokban [28–30].

Itt összefogjuk a ritka CNV asszociációkat elfogulatlan felnőtt populációkban és klinikai kohorszokban; 16p11.2 egérmodellek fenotipizálása; MR és egyetlen gén in vivo zebrafish vizsgálatok a reprodukciós tulajdonságok eddig nem értékelt genetikai asszociációinak jellemzésére. Agnosztikus megközelítéseink azonosították a szexuális fejlődésben szerepet játszó időzítés és fejlődési folyamatok károsodásának valószínű okozó génjeit.

Anyagok és metódusok

Az anyagokat és módszereket a Kiegészítő módszerek

Tanulmányi kohorszok

A 16p11.2 CNV hordozókat olyan személyekként definiáljuk, akik az ismétlődő 16p11.2 BP4-BP5 600 kb hemizigóta deléciót vagy heterozigóta duplikációt hordozzák az Egyesült Királyság biobankjában (UKBB), az Észt Genom Központban, a Tartu Egyetem biobankjában (EGCUT). Páneurópai és a Simons VIP 16p11.2 kohorszok. Lát Kiegészítő S1 táblázat az összefoglaló jellemzők és Kiegészítő módszerek a kohorsz leírásokhoz a genotipizálás és az asszociációs elemzések részletei.

16p11.2 egérmodellek

A korábban tervezett 16p11,2 Del/+ és 16p11,2 Dup/+ egér modellekben megvizsgáltuk a női és férfi reproduktív paramétereket, beleértve az ösztrikus ciklikusságot, a spermiumszámot, az anogenitális távolságot, az urogenitális traktus szerveinek morfológiáját és a hipotalamusz térfogatát [31, 32].

Agyi szerkezeti mágneses rezonancia képalkotás (MRI)

Az emberi strukturális MRI-adatokat a leírtak szerint gyűjtöttük, dolgoztuk fel és elemeztük [16, 17, 33]. A teljes agy térfogattérképeinek tömeg-egyváltozós statisztikai elemzését 146 posztpubertus egyénnél végeztük, a leírtak szerint [34]. Az egér MRI-t a [35] részben részletezett módon végeztük.

Betegséggazdagítási elemzés

A dúsulást g: Profiler [36] és MetaCore ™ segítségével értékeltük a 16p11.2 CNV hordozókban és modellekben differenciáltan expresszált gének listájában [37, 38].

Mendeli véletlenszerűség-elemzés

Egyváltozós [28] és többváltozós [39–41] MR-t használtunk a 16p11.2 gének AaM szabályozására gyakorolt ok-okozati hatásainak felmérésére.

GnRH neuron fenotipizálása zebrafish-ban

A zprafish embriókban a 16p11.2 gének túlexpresszióját és CRISPR/Cas9 genomszerkesztését hajtottuk végre a leírtak szerint [42, 43]. A neuronmintázás in vivo képalkotását gnrh3-ban: egfp transzgén riporter lárvák [44] leírása Kiegészítő módszerek.

Globális génexpressziós hasonlóság

Elemeztük az azonosított jelölt gének expressziós hasonlóságát a nyilvánosan elérhető emberi és egér gén expressziós adatkészletek között a Multi Experiment Matrix (MEM) [45] és a funcExplorer [46] eszközökkel. A dúsítási elemzéseket g: Profiler eszközkészlet segítségével végeztük [47].

Eredmények

A sárga, a kék és a zöld a 16p11.2 deléció, a duplikáció és a CNV (deléció és duplikáció együttesen) hordozóit ábrázolja, míg a kontrollok szürkével vannak jelölve. Tükrös összefüggés a menarche életkorával az európai származású egyéneknél (A) az első UKBB kohorsz (UKBB-1), (B) a második UKBB kohorsz (UKBB-2), és (C) az EGCUT kohorsz. Irányban következetes, nem szignifikáns tendencia a férfi pubertás tulajdonságok megváltozott időzítése felé, pl. az „első arcszőrzet” önjelentése „fiatalabb”, „átlagos” vagy „idősebb” korban, mint a kortársak (D) az első UKBB, ésE) a második UKBB kohorsz. (F) A kiválasztott reproduktív diagnózisok gyakorisága a női 16p11.2 CNV hordozókban az EGCUT kohorszban. A diagnosztizált betegségeket az ICD-10 kódok, N91 „hiányzó, szűkös és ritka menstruáció”, E28 „petefészek diszfunkció”, N83 „petefészek, petevezeték és széles szalag nem gyulladásos rendellenességei”, N70-77 „nőgyulladásos betegségek” szerint mutatjuk be. kismedencei szervek ”. AaM: Életkor a menarche-nál; DEL: 16p11.2 törlés; DUP: 16p11.2 duplikáció

Színkód, mint 1.ábra. Megváltozott életkor az elsőA) 16p11.2 Del/+ és (B) 16p11.2 Dup/+ nőstény egerek a vad típusú alomtársakhoz képest. (C) Jelentősen megnövekedett méhméret a 16p11.2 Dup/+ nősténynél és (D) rövidítette az ano-genitális távolságot a 16p11.2 Dup/+ hím egerekben. (E) A szemináris tubulusok architektúrája az 5 elemzett 16p11.2 Dup/+ hímből kóros szövettani régiókat mutat, különösen csírasejt-degenerációval rendelkező tubulusokat és vakuolizációval járó tubuláris atrófiákat.

(A) A GWAS csúcs a menarche életkorában a CNV génekhez viszonyítva a 16p11.2 intervallumban, a LocusZoom segítségével kiszámítva [22] adatai alapján. (B) Egyváltozós és (C) többváltozós Mendeli randomizációs elemzések, amelyek standardizált ok-okozati becsléseket mutatnak be az AaM esetében 95% -os konfidencia intervallummal. A vörös eredményei meghaladják a Bonferroni-korrigált szignifikáns küszöböt (P 0,009). Az INO80E és a KCTD13 gének AaM-re gyakorolt hatása mindkét elemzésben következetes. (D) 38 GTEx emberi szövet expressziós adatai, amelyeket a funcExplorer automatikus dúsítási elemzésével csoportosítottak, feltárta, hogy az ASPHD1 és a CELF4 ugyanahhoz a klaszterhez tartozik. Az # 1133 klaszter 258 együtt expresszált génből áll, amelyek aktiválódást mutatnak leginkább az agyi régiókban és az agyalapi mirigyben. Ezt mutatja a teljes klasztert jellemző eigengén-profil és e 258 gén hőtérképe 38 szöveten. A klaszter gazdagodik az idegrendszerre, az idegsejtek vetületére és a neurotranszmisszióra vonatkozó gén ontológiai és reaktóm kifejezésekkel (balra).

(A) Egy gnrh3 vázlatos dorzális ábrázolása: egfp transzgenikus lárva 5 dpf-nél, zöld színnel kiemelve a gnrh3-expresszáló neuront. (B) Balról jobbra a GFP jel reprezentatív hátsó nézetei Tg (gnrh3: egfp) lárvákban, injektálatlanul, injektálva ASPHD1, ASPHD1 és KCTD13, asphd1 vezető RNS (gRNS) és Cas9 5 dpf-nél; skálasáv 50 µm.

A GFP-jel kvantitatív értékelése gnrh3-ban: az egfp lárvákba humán mRNS-eket injektáltunk, amelyek a 16p11.2 BP4-BP5 intervallumra térképező géneket kódolják. (C) Az ASPHD1 mRNS a GFP jel jelentős csökkenését indukálta a kontrollokhoz képest. Adagolás: 12,5 pg a KIF22 és a PPP4C esetében; 50 pg az összes többi gén esetében. Lát Kiegészítő táblázat S10 lárvaszámra. (D) F0 mutáns lárvák, amelyekbe asphd1 gRNS-t injektáltak, csökkentik a GFP-jelet. Adagolás: 100 pg asphd1 gRNS és 200 pg Cas9 fehérje. Lárvák száma: Injektálatlan (n = 153), asphd1 gRNS (n = 111), asphd1 gRNS + Cas9 (n = 138). (E) Az ASPHD1 mRNS együttinjekciója a Mendeli véletlenszerűsítéssel prioritizált transzkriptumokkal (KCTD13, INO80E, MAPK3 és YPEL3) az ASPHD1 és a KCTD13 közötti episztázist azonosította. Adagolás: 25 pg ASPHD1 esetén; 50 pg az összes többi gén esetében. Lát Kiegészítő S11 táblázat lárvaszámra.

Az adatok átlag ± szórásként vannak feltüntetve; ns, nem szignifikáns; * p −09; „Átvitel kémiai szinapszisokon át” REAC: 112315, p = 1,04 × 10 −10; „Neurotranszmitter receptor megkötése és továbbvitele a posztszinaptikus sejtben” REAC: 112314, p = 3,7 × 10 −09) (3D ábra és S6. Ábra; g: profiler eredmények a következő címen érhetők el: https://biit.cs.ut.ee/gplink/l/AOYgmspNQu).

Vita

A felhalmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy a gyakori és ritka variációk additív módon befolyásolják a komplex tulajdonságokat [59, 60]. Itt egy modellről számolunk be, amely mind a ritka, mind a gyakori változatokból származó információkat felhasználja a szaporodás biológiai alapjainak megértése érdekében, egy multifaktoriális fenotípus.

A 16p11.2 CNV-k klinikai kohorszokban végzett számos tanulmánya ellenére a reproduktív tengelyben való részvételt többnyire figyelmen kívül hagyták, kivéve a 16p11.2 BP4-BP5 deléciók dúsulását jelentett Müller-aplasia betegeknél [61, 62]. Itt megmutatjuk, hogy az emberekben és egerekben a 16p11,2 dózis jelentősen összefügg a pubertás kezdetével, a reproduktív tulajdonságokkal és a hipotalamusz térfogatával. Így hozzáadjuk a korábban jelentett kapcsolatokat a CNV-k és a mentális rendellenességek, a BMI, a fej kerülete és az agy mérete között [8, 9, 12, 13, 15, 16, 31, 32]. A szexuális fejlődés fenotípusainak eddig alulbecsülése egy megállapítási torzításból származhat, ahol a korai kezdettel jelentkező és a legnagyobb orvosi irányítási kihívásokkal járó fenotípusokat prioritásként kezelték. Megállapításaink összhangban vannak az endokrin, metabolikus és viselkedési fenotípusok konvergens témájával ritka CNV hordozókban és a 16p11.2 lokuszban előforduló gyakori variáns asszociációkban [18, 22, 63].

A GWAS lokuszokhoz hasonlóan a CNV-k meghatározott intervallumot mutatnak a fenotípussal összefüggésben, de gyakran nem kínálnak különféle oksági géneket [64]. Míg az MR az ok-okozati szempontból releváns gének GWAS utáni rangsorolásának népszerű eszközévé vált, e kezdeti tanulmányok szerzői tartózkodtak a megállapítások funkcionális validálásától, de facto elismerték, hogy a célszövetekből származó elégtelen eQTL-adatok leküzdhetetlen korlátot jelenthetnek [28, 30 ]. Itt kiaknáztuk a nagyméretű MR előnyeit, és túlléptük annak szövetspecifikus korlátozását azáltal, hogy agnosztikusan értékeltük az egyetlen génadagolás-változás hatását a GnRH-expresszáló idegsejtek mintázatára a zebrafish fejlődéssel összefüggésben. Bemutatjuk az in silico és az in vivo módszerek kombinálásának erejét az ASPHD1 és a KCTD13 azonosításával, mint a 16p11.2 reproduktív tengely meghajtójának és módosítójának.

Két másik, a 16p11.2-nél elhelyezkedő gén, a TBX6 és a MAZ korábban a vese és a húgyutak veleszületett rendellenességeivel volt összefüggésben [73, 74], míg a GWAS a TBX6-ot [23], a MAPK3 [21] és az INO80E [22] potenciálist javasolta az AaM jelöltjei. Ezenkívül a 14 géncsoport (distaltól a proximálisig: SPN, QPRT, ZG16, KIF22, PRRT2, MAZ, MVP, SEZ6L2, ASPHD1, KCTD13, TMEM219, TAOK2, INO80E, DOC2A) koordinált ösztrogén-mediált szabályozás alatt áll. [75]. Ezek az adatok együttesen független támogatást nyújtanak a 16p11.2 lokusz fenotípusainak alapjául szolgáló genetikai komplexitáshoz, és megerősítik a valószínű oligogén etiológiát az elsődleges mozgatórugókkal és több módosítóval, amelyek szabályozzák a társult tulajdonságok szórását [42, 57, 76, 77].

Összegzésként tanulmányunk szemlélteti, hogy a ritka változatokkal összefüggő tulajdonságok jellemzése a kiválasztatlan felnőtt populációkban hogyan képes elfogulatlan betekintést nyújtani a betegség etiológiájába. Tovább demonstráljuk az interdiszciplináris megközelítés erejét a jelölt gének és az alapul szolgáló biológiai folyamatok pontos meghatározása a GWAS lokuszokban összetett tulajdonságok esetén.

Szerzői hozzájárulások

KM, EED, RM és AR tervezték a vizsgálatot, felügyelték az egyes szakaszokat és hozzájárultak az adatok értelmezéséhez. KM, ML, KL, TL, CML és RM készítették és elemezték az emberi kohorsz adatait. AP, HA, CA, AM, SR, ED, JC, YH, JCS, SN, KM és AR biztosította a rágcsáló modelleket, hozzájárult a tartáshoz és a fenotipizáláshoz. Az SMB és BD végezte az emberi MRI-t, a JE, JPL, LRQ és RMH pedig az egér MRI-elemzést. ML, KL és ZK elvégezte a mendeli randomizációt. TA, ZAK, NC és EED biztosította a zebrafish vonalakat és kísérleteket hajtott végre. A HP és a KM elemezte a génexpressziós adatokat. A 16p11.2 európai és a Simons VIP konzorcium tagjai fenotípus-információkat szolgáltattak európai, illetve észak-amerikai betegekről. Az eQTLGen konzorcium tagjai teljes vérű eQTL metaanalízis adatokat szolgáltattak. KM és AR a kéziratot TA, ML, KL, AP, HA, HP, SN, BD, EED és RM közreműködésével írta. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetünket fejezzük ki az EGCUT résztvevőinek. Köszönjük az EGCUT személyzetének a toborzásban, a fenotipizálásban, a minták továbbításában, a genotipizálásban és az adminisztratív feladatokban nyújtott segítséget, különös tekintettel Lili Milani, Viljo Soo, Kairit Mikkel és Mari-Liis Tammesoo számára. Köszönjük a 16p11.2 páneurópai jelentkezőknek és családtagjaiknak a tanulmányhoz való hozzájárulásukat. Hálásak vagyunk a részt vevő Simons Variation in Individual Project (Simons VIP) oldalak összes családjának, valamint a Simons VIP Consortiumnak. Nagyra értékeljük az SNP genotípusához, fenotípusához és képalkotó adataihoz való hozzáférést az SFARI Base-n. A jóváhagyott kutatók a https://base.sfari.org webhelyen jelentkezve megszerezhetik a Simons VIP populáció adatkészletét, amelyet ebben a tanulmányban ismertettek. Az ebben a cikkben szereplő kutatást az Egyesült Királyság Biobank-erőforrásának felhasználásával hajtották végre (17085-es alkalmazás). Ennek a munkának az adatelemzését részben a Tartu Egyetem Nagy teljesítményű Számítástechnikai Központjában végezték el. Az emberi agy képalkotását a Département des Neurosciences Cliniques, a Hospital Hospitalier Universitaire Vaudois MRI platformján végezték el, amelyet a Roger De Spoelberch és a Partridge Foundation nagylelkűen támogat. Köszönetet mondunk Yonathan Zohar-nak (Marylandi Egyetem) a gnrh3: egfp transzgénikus zebrafish-vonal biztosításáért.

Ezt a munkát támogatta a Svájci Nemzeti Tudományos Alapítvány (31003A-143914 - ZK; 31003A_160203 és 31003A_182632 - AR; 32003B_159780 - BD; PP00P3_144902 - SJ), a Horizon2020 ikerintézményi projekt ePerMed (692145 - AR); a Jacobs Alapítvány (a KM-nek); a Jérôme Lejeune Alapítvány (CA-hoz és AR-hoz); Észt Kutatási Tanács az IUT20-60, IUT24-6 és PUTJD726 támogatásokat nyújtja (TL-hez); Az Európai Unió az Európai Regionális Fejlesztési Alap 2014-2020.4.01.15-0012 GENTRANSMED és 2014-2020.4.01.16-0125 sz. Projektjén keresztül; a Leenaards Alapítvány (BD-hez); és az amerikai NIH megadja a P50HD028138 (az NK és az EED számára), az R01MH106826 (az EED számára) és az R01HD096326 (az NK számára). A CA Pro-Women ösztöndíjat kapott a Lausanne-i Egyetem Biológiai és Orvostudományi Karáról. SJ egy kanadai neurodevelopmentális rendellenességekkel foglalkozó kutatási elnök és a Jeanne et Jean Louis Levesque Alapítvány elnöke.

A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Lábjegyzetek

↵ 23 társszerző

Az európai 16p11.2 és az eQTLGen konzorcium tagjainak nevét és tagságát a Kiegészítő anyagok.