A flavonoid út szabályozza a pamut virág sziromszíneit

Növénygenetikai Javítás Nemzeti Kulcskombinációja, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Wuhan, Hubei, Kína

Jiafu Tan,
Maojun Wang,
Lili Tu,
Yichun Nie,
Yongjun Lin,
Xianlong Zhang

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Tan J, Wang M, Tu L, Nie Y, Lin Y, Zhang X (2013) A flavonoid út szabályozza a pamut virág sziromszíneit. PLoS ONE 8 (8): e72364. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072364

Szerkesztő: Jinfa Zhang, Új-Mexikói Állami Egyetem, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2013. május 11 .; Elfogadott: 2013. július 16 .; Közzétett: 2013. augusztus 12

Finanszírozás: Ezt a munkát a kínai csúcstechnológiai kutatási és fejlesztési program támogatása (863 program, 2012AA101108 támogatás száma) támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A virágszín sokfélesége a természet egyik legszebb ajándéka, és sokoldalú eszközként szolgál a növényi biokémikusok, genetikusok és ökológusok számára. A különböző virágszínek különböző pigmentekkel és társ pigmentekkel vannak ellátva. A betalainok, a karotinoidok és az antocianinok a pigmentek három fő, jól jellemezhető csoportja [1]. A flavonolok, a pH és az ionok szintén fontos szerepet játszanak a virág színének meghatározásában [2], [3], [4]. Az endogén genetikai hatások mellett a környezeti tényezők, például a fény és a hőmérséklet is felelősek lehetnek a virágok színéért [5], [6], [7], [8]. A szín az általános fenotípus mellett a virágoknak különféle biológiai funkciókat is biztosít, például védelmet nyújt az UV-fény ellen és a beporzók vonzerejét [9], [10]. Egyetlen virágon belül a virágfejlődés során bekövetkező színváltozások elterjedtek az összes orrszármazékban [11], [12]. Több tanulmány is jelezte, hogy bár fontos a beporzók interakciója szempontjából, a virágszín megváltoztatásának mechanizmusa az pre- és posztantézist megelőzően nem jól ismert [13], [14], [15].

Itt mutatjuk be a biológiai elemzéssel nyert adatokat, amelyek azt mutatják, hogy a gyapotvirág színe elsősorban flavonoidokból áll. A színváltozás összefügg a flavonoid gének expressziójával, különösen azok, amelyek részt vesznek az antocianin bioszintézisében. A fény fontos szerepet játszik a pigment felhalmozódásában és a flavonoid bioszintézisében, de a virág fejlődése során a flavonoid útvonalban is rejlő tényező található.

Anyagok és metódusok

Növényi anyagok

Az anyagokat a Huazhong Mezőgazdasági Egyetem (Wuhan, Kína) kísérleti területéről gyűjtötték. Nincs szükség külön engedélyekre ezekhez a helyekhez vagy tevékenységekhez. Veszélyeztetett vagy védett fajokat nem érintett. Az ebben a vizsgálatban használt gyapotnövényeket, a Gossypium hirsutum YZ1 -t, az YZ1 (f3h) F3H stabil csendes vonalát, amelyet laboratóriumunk generált [46], barna pamut G. hirsutum T586 és G. barbadense 3-79 növényeket termesztettünk. gazdálkodási szokások és irányítás A virágokat egy tipikus augusztusi napon szüretelték, a virágzás előtti naptól a virágzás utáni napig különböző időpontokban. Az antézis napját 0 DPA-ként jegyezték fel. A pekingi idő (GMT +8) szerint különböző időpontokat jegyeztek fel. Virágokat hat időpontban, köztük 6, 11 és 12 órakor, 15 és 18 órakor 0 DPA-n és 6 órakor 1 DPA-n gyűjtöttünk elemzés céljából. A port és a bibéket gondosan eltávolították a szennyeződés elkerülése érdekében. Ezután a virágokat a csészelevél peremével egyformán levágjuk, lemérjük, vagy azonnal folyékony nitrogénben porrá őröljük, vagy folyékony nitrogénbe merítjük, és felhasználásig –70 ° C-on tároljuk.

Gyapotcsíra elemzés

A gyapotvirágra vonatkozó információk összegyűjtése érdekében különböző internetes csíraplasma-forrásokat kerestek fel. Közülük kettő, a kínai növénytermesztési erőforrások információs rendszere (CGRIS) (http://icgr.caas.net.cn/#) és a nemzeti növényi csírazárórendszer (GRIN) (http://www.ars-grin.gov A bőséges pamutsziromadatokat tartalmazó /npgs/searchgrin.html) elemzésre utaltak. Az internetről számos reprezentatív képet kaptak a pamutvirágról (beleértve a http://www.learnnc.org/lp/multimedia/9447, http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Darwins-cotton-flower.jpg, http: //www.photostuff. org/galapagos3.html, http://www.alohafriendsphotos.com/flowers2.html).

Az antocianinok mennyiségi meghatározása

A szirmokat lemértük és folyékony nitrogénben megőröltük, mindegyik virágot egyedi mintának tekintettük. Az antocianinokat savas (1% HCl (w/v)) metanolban extraháltuk 48 órán át. Az extrakciót 10 ml puffer és 1 g minta arányával hajtottuk végre. Az antocianint az abszorbancia 530 nm-en történő mérésével számszerűsítettük [47]. Minden mintához több mint öt virágot használtak az elemzéshez.

Fotózás és képkezelés

A virágokat a kísérleti terepről gyűjtötték össze, és azonnal fényképezték digitális fényképezőgéppel. Az egy időben betakarított virágokat egy fotóba készítették, és minden időpontban azonos háttér és kamera paramétereket használtak. A különböző időpontokban készített virágokról készült fotókat egy képpé egyesítették az Adobe Photoshop 7.0 alkalmazással.

Virágárnyékolás és emasculációs kezelés

A virágokat fény-kitettség elkerülése végett -1 DPA délután végzett antézis előtt nátronzacskóval borítottuk be; és a zsákok elég nagyok voltak ahhoz, hogy virágot nyithassanak. Az azonos növényből és ugyanabból a helyzetből származó virágokat vettük kontrollként és tanulmányoztuk 0 DPA-tól 11 óráig és 1 DPA-ig 6 óráig. A virág emasculációs kezeléséhez az egyes virágok port és bibéjét óvatosan, 0 ° C-on, 8 órakor ollóval távolítottuk el, amikor a szirmok nem voltak teljesen kinyitva. Ugyanazokból a növényekből és ugyanabban a helyzetben lévő virágokat vettünk kontrollként és elemeztük reggel 8 órakor 1 DPA-n. Minden kezelésnél több mint öt virágot elemeztek.

PH mérés

A gyapotvirág pH-ját egy korábbi jelentés szerint mértük [4]. Minden kezeléshez három friss virágot szedtek le a szántóföldről. A szirmait összegyűjtöttük, a növényből való eltávolítást követően 15 percen belül kétszer ionmentes vízzel mostuk, majd mozsárral és mozsárral 1 percig őröltük virágonként 5 ml ionmentes vízben. A homogenátum pH-ját azonnal mértük pH-elektróddal (Mettler-Toledo FE20, Shanghai).

Kvantitatív valós idejű PCR

A flavonoid gén expresszió elemzéséhez a pamut virágokat különböző időpontokban gyűjtöttük be. Az RNS extrakcióját a Sigma-Aldrich (USA) Spectrum Plant Total RNS Kit eljárása szerint hajtottuk végre, a cDNS szintézist és a qRT-PCR-t a korábban leírtak szerint végeztük [48], referencia génként az UBQ7 pamut ubiquitin gént [49]. A flavonoid génszekvenciákat a nyilvános NCBI UniGene adatbankból és a pamut D genom szekvenciából nyertük (http://www.phytozome.com/). Az összes gén expresszióját UBQ7-re normalizáltuk. Három biológiai ismétlést hajtottunk végre. A hibasávok a szórásokat (SD) jelentik. Az összes primert az S1 táblázat tartalmazza. A SuperScript® III reverz transzkripciós készletek az Invitrogen-től (Carlsbad, USA) voltak. A valós idejű PCR reagensek (iTaq SYBR Green szupermix ROX-szal) a Bio-Rad-tól (Foster City, USA) érkeztek.

Eredmények

A pamut (Gossyoium spp.) Virág változatos színeket tartalmaz

Elemezték a kínai növényi csírazavar-források információs rendszeréből (A) és a nemzeti növényi csírazárórendszerből (B) származó csíraszámokat, rögzített sziromszínekkel. A színeket a nyilvántartás szerint osztályozták. A Gossypium hirsutum (Gh), a G. barbadense (Gb) és a G. arboreum (Ga) volt a három fő pamutfaj ezekben a rendszerekben. A maradékokat „egyéb” kategóriába sorolták, és többnyire vad pamutot tartalmaztak.

A pamut virág színe a virágzás után drámaian megváltozik

A, a G. hirsutum YZ1, T586 és a G. barbadense 3-79 virágait gyűjtöttük a mezőről 11 órakor, 12 órakor, 15 órakor és 18 órakor 0 DPA-n (0-11, 0-12, 0 -15, illetve 0-18, illetve 6 óra 1 DPA-n (1-6 néven). B, e virágok antocianintartalmát A530-nál mértük. Három ismétlést elemeztünk, mindegyik ismétlésnél ötnél több virággal. A hibasávok az SD-t jelentik.

Az árnyék csökkenti az antocianinok felhalmozódását a pamutvirágokban

A, Az árnyékkal kezelt YZ1virágok fenotípusait elemeztük 0 DPA (0-11) 11 órától 1 DPA (1-6) reggel 6 óráig. B, az idõpontos virágok antocianin tartalmát A530-nál mértük. A hibasávok három ismétléssel végrehajtva mutatják az SD-t. Minden ismétlésnél több mint öt virágot elemeztek.

Az antocianin útvonal génjeinek expressziós szintje összhangban van a színváltozással

A gyapotvirág fejlődésének fenotípusos megfigyelése arra utalt, hogy az antocianin bioszintézisét mind környezeti, mind genetikai tényezők ellenőrzik (3. ábra). Ezért tovább tanulmányoztuk az ebben az útban részt vevő gének transzkripcióját (4. ábra). A flavonoid és antocianin bioszintézissel kapcsolatos PAL, CHS, F3H, DFR, FLS, ANR, ANS és UFGT gének transzkripciói bőségesen voltak virágokban, és a fény drámai hatással volt rájuk. A CHS, F3H, ANS és UFGT expressziója fokozatos növekedési mintázatot mutatott a virágfejlődés során, és alacsonyabb árnyékoló virágszintet mutatott a normál megvilágításhoz képest (4B, C, E és F ábra). Ezek a megállapítások korreláltak az antocianin felhalmozódásával (2. és 3. B ábra). Ezenkívül a CHS és az UFGT gének is megfelelő expressziós mintát mutattak az antocianin 3-79 és T586 virágokban történő felhalmozódásával (S3A és B ábra). Ezek a gének fontos szerepet játszhatnak az antocianin felhalmozódásában és a virág színének változásában.

A PAL (A), CHS (B), F3H (C), DFR (D), ANS (E), UFGT (F), ANR (G) és FLS1 (H) átiratait qPCR-rel elemeztük. Az YZ1 normál fényű (L) vagy árnyékolt kezelésben (S) levő virágait öt időpontban gyűjtöttük a mezőről (0 DPA-tól 11-ig (0-11) 6-ig, 1 DPA-ig 6-ig (1-6)). Az átiratokat az UBQ7 expressziójával normalizáltuk. Három ismétlést hajtottak végre. A hibasávok az SD-t jelentik.

Az FLS1 expressziója, amely a flavonol bioszintézissel függ össze, 0 DPA-nál 11 órakor érte el a csúcspontját (amikor kevés vörös szín halmozódott fel, 2A. Ábra), majd 0 DPA-kor 15 órakor nagyon alacsony szintre csökkent (amikor a vörös szín megjelent)., 2A. Ábra), és a virágfejlődés pihenőidőpontjainak alapvonala maradt (4. H ábra); ez a gén hasonlóan expresszálódott a 3-79 és a T586 virágaiban (S3C. ábra). Az FLS1 expressziója erősen fényfüggő volt, de az árnyékkal kezelt virágokban nagyon kevés transzkriptumot detektáltak (4. H ábra). A PAL, DFR és ANR expressziója 18 órakor 0 DPA-n elérte a maximumot, majd meredeken csökkent (4A, D és G ábra). A PAL és a DFR fény indukálta expressziós mintázatot mutatott, de az ANR-t a fény nem befolyásolta erősen (4. ábra A, D és G ábra). Hasonló ANR expressziós mintákat figyeltünk meg a 3-79 és a T586 virágokban is, bár a T586 virágokban nem volt domináns (S3D. Ábra). A legtöbb gén expressziója a flavonoid útvonalban fény okozta volt, de a FLS1 kivételével ezeknek a géneknek hasonló expressziós mintázata volt megfigyelhető a virágfejlődés során, függetlenül a fénytől. Ezek a gének expressziós profiljai korreláltak a virág színváltozásával, ami azt sugallja, hogy a genetikai kontroll domináns az antocianin anyagcserében, míg a flavonol bioszintézis fényfüggő kontroll alatt állhat.

A flavonoid a gyapotvirág színéért felelős fő pigment

A, YZ1 és f3h szirmait összegyűjtöttük a mezőről 0 és 1 DPA-nál. A metanol-kivonat a jobb oldalon látható. Jelentős színváltozást figyeltünk meg. B, antocianintartalmat A530-nál mértünk. A hibasávok az SD-t jelentik, és három ismétlést hajtottak végre. Minden ismétlésnél több mint öt virágot elemeztek.

A genetikai és környezeti kölcsönhatások szabályozzák a flavonoid anyagcserét a pamutvirágban

A, az f3h vonalak virágait 0 DPA (0-11) 11 órától 1 DPA (1-6) 6 óráig elemeztük. A normál fénnyel vagy árnyékkal kezelt virágokat ’-L’, illetve ’-S’ jelöli. B, a megfelelő virágok antocianintartalmát A530-nál mértük. A hibasávok az SD-t jelentik, és három ismétlést hajtottak végre. Minden ismétlésnél több mint öt virágot elemeztek.

A PAL (A), CHS (B), F3H (C), DFR (D), ANS (E), UFGT (F), ANR (G) és FLS1 (H) átiratait qPCR-rel elemeztük. Az f3h normál fényű (L) vagy árnyékolt kezelésben (S) levő virágait öt időpontban gyűjtöttük össze a mezőről (0 DPA-tól 11-ig (0-11) 6-ig, 1 DPA-ig 6-ig (1-6)). Az átiratokat az UBQ7 expressziójával normalizáltuk, és három ismétlést hajtottunk végre. A hibasávok az SD-t jelentik.

Vita

A pamut virágokat több mint egy évszázada tanulmányozták. Bár sokféle virágszínt figyeltek meg, kimutatták, hogy a pamutvirág pigmentjei többnyire flavonolokat tartalmaznak [35]. A Gossypium herbaceum és a G. barbadense sárga virágai gossipitrint, izokvercitrin-quercimeritrint és herbacitrint tartalmaznak, a G. arboreum vörös virágai pedig szintén izokvercitrint [35], [50]. A sokéves bevezetés és tenyésztés során a fő termesztett és gyűjtött pamut csíraplázák G. hirsutumból álltak, a pamutvirág fő színe pedig a krém volt (1. ábra). A krém színéért felelős pigment azonban szintén flavonoidokból áll, és valószínűleg a flavonolokból is, mert az F3H elnémítása a pamutban fehér virágokat eredményez (5A. Ábra). A vörös pamutvirág kivonat 530 nm-en magas OD-értéket mutatott, ami magas antocianin-tartalmat jelez (2. és 5. ábra). Mindezek az eredmények megerősítették, hogy a pamutvirágok színe elsősorban a flavonoidok tartalmához kapcsolódik.

segítő információ

S1. Ábra.

A megtermékenyítés hatása az antocianin gyapotvirágokban történő felhalmozódására. A normálisan megtermékenyített (Y-F) és az emasculált YZ1 virágokat (Y-U) a szántóföldről 8 órakor gyűjtöttük 1 DPA-n. B, az Y-F és Y-U virágok antocianinjait A530-nál mértük. Három ismétlést hajtottak végre. A hibasávok az SD-t jelentik.