A hasnyálmirigy β-sejtjei pótolják az inzulin szekréciós kapacitását és csillapítják a cukorbetegséget az elhízott 2-es típusú cukorbetegség extrém modelljében

Absztrakt

Bevezetés

A hasnyálmirigy β-sejtjeinek és a tömegnek az inzulinrezisztenciát kompenzáló kudarcából eredő krónikus hiperglikémia az elhízáshoz kötött 2-es típusú cukorbetegség (T2D) megjelenését jelzi. Az elhízott T2D patogenezisének korai szakaszában a β-sejtek funkciójának és/vagy tömegének kompenzációs növekedése a megnövekedett anyagcsere-terhelést és az inzulinrezisztenciát szolgálhatja. Idővel azonban a β-sejtek iránti krónikus igény kimerítővé válik, ami apoptózis vagy identitásvesztés révén nem megfelelő funkcionális β-sejt tömeghez vezet, és végül a T2D-hez (1–4) vezet. Ez a progresszív β-sejt kimerültség a T2D patogenezisében ahhoz a koncepcióhoz vezetett, hogy a tranziens β-sejt pihenés előnyös lehet a T2D kezelésében azáltal, hogy csökkenti a β-sejtek igényét, majd javítja a funkciót és/vagy elősegíti a fennmaradó endogén β túlélését. -sejtek (5). Ennek bizonyos prioritása van az inzulinérzékenység javításával speciális helyzetekben, például terhességi cukorbetegségben (6), markáns kalória-korlátozásban (7) vagy az elhízott T2D-ben az endogén inzulinszekréció rövid távú közvetlen gátlásában (8). A metabolikus igény csökkenését a β-sejtek működésének javítása érdekében azonban a jelenlegi T2D terápiás megközelítésekkel nem vizsgálták részletesen a β-sejt szintjén.

Gyakran vitatták, hogy a β-sejtek működésének meghibásodása vagy a csökkent β-sejttömeg kulcsfontosságú-e a T2D kialakulásához, de emberben a betegség patogenezise valószínűleg változó, és mindkettő hozzájárul (9). A T2D-ben a β-sejtek diszfunkciója esetén jellemző a glükózérzékelés elvesztése, az első fázisú glükóz által kiváltott inzulinszekréció eltompulása és a feltételezett nem megfelelő inzulintermelés (10). Ezzel szemben az elhízott T2D egérmodellek azt mutatták, hogy a β-sejt inzulintermelés jelentősen megnövekedett annak ellenére, hogy a kimerült sejten belüli inzulinraktárak voltak (11). Megjegyzendő, hogy amikor az elhízott T2D egerekből izolált hasnyálmirigy-szigeteket normál glikémiában (5,6 mmol/l) inkubáltuk egy éjszakán át, az inzulintermelés mértéke normalizálódott, az intracelluláris inzulin szekréciós granulátumraktárak feltöltődtek, és helyreállt a glükóz által kiváltott kétfázisú inzulin szekréció (11). ).

Megvizsgáltuk, hogy a glükózszint-csökkentő terápiás stratégia (a glukagon-szerű peptid 1 receptor [GLP-1R] agonista liraglutid és/vagy nátrium/glükóz kotransporter 2 gátlás [SGLT-2i] segítségével dapagliflozinnal) vagy inzulin-szenzibilizáló megközelítés (a tiazolidindion [TZD] roziglitazon önmagában vagy dapagliflozinnal kombinálva) enyhíti a β-sejt iránti igényt in vivo a BKS-ben. Cg-Dock7 m +/+ Lebr db/J (a továbbiakban KS db/db) egerekben (extrém elhízott T2D modell a sikertelen β-sejt kompenzáció miatt) az endogén β-sejt funkció helyreállítása érdekében. Ezt a modellt választottuk (nem pedig a poligénes vagy étrend által kiváltott diabétesz modellek helyett), mert katasztrofális és korai β-sejt funkcióvesztéssel jár. Tehát, ha egy ilyen extrém modellben megfigyelhető a terápiás hatékonyság, akkor arra számítunk, hogy ez ugyanannak a betegségnek kevésbé káros patofiziológiájára is kiterjed. Ezen kívül összehasonlító kontrollként sovány C57BLKS/J egereket használtunk. Eredményeink kiemelik, hogy a bevált T2D-terápiákkal végzett glikémiás szint-csökkentés, különösen kombinációval, a β-sejtek pihenését is kiválthatja in vivo a β-sejtek eredendő adaptív rugalmasságának felhasználásával, hogy javítsák szekréciós képességüket és működésüket, ezáltal lassítva a betegség előrehaladását.

Kutatási tervezés és módszerek

Kísérleti terv

ipGTT

Hat órás éhomi egereknek intraperitoneálisan 1,5 g/kg glükóz sóoldatot adunk be. A vércukorszintet az 1. kohorsznál 0, 5, 10, 15, 60 és 180 percnél, a 2. kohortnál pedig 0, 15, 30, 60, 120 és 240 percnél határoztuk meg. Az egerek keringő plazma glükózszintjét kolorimetriásan határoztuk meg., míg a plazma inzulinszintet ELISA-val határoztuk meg 15 percnél.

A hasnyálmirigy inzulin tartalmának, a keringő tényezők és a nukleáris mágneses rezonancia elemzése

A hasnyálmirigy inzulin tartalmát az egész hasnyálmirigyből savas-etanolos extrakcióval és inzulin ELISA-val határoztuk meg. A plazma glükózt kolorimetrikus glükóz-oxidáz készlet segítségével határoztuk meg (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). A plazma inzulint ELISA módszerrel határoztuk meg (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). A% HbA1c-t teljes vérből kolorimetriásan határoztuk meg (Crystal Chem, Elk Grove Village, IL). A plazma koleszterinszintet, triglicerideket, AST-t és ALT-t a cobas c111 autoanalizátorral (Roche, Basel, Svájc) határoztuk meg. A májzsírt a Bruker minispec mq (Bruker, Billerica, MA) alkalmazásával határoztuk meg. A testösszetételt a Bruker LF90II analizátorral határoztuk meg.

Immunhisztokémia és β-sejt tömeganalízis

Az immunhisztokémia céljából a pancreatákat rögzítettük, beágyazottuk és 5 μm-es metszetekre vágtuk. A metszeteket a BOND RX rendszeren (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) festettük nyúl anti-MafA-val (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) vagy nyúl anti-Ki67-gyel (Abcam, Cambridge, MA), majd antigén-visszakereséssel, 3,3 ′ -Diaminobenzidin festés és glükagon/inzulin detektálás a korábban leírtak szerint (12). A β-sejtek és az α-sejtek mennyiségét inzulin/glükagon (barna/rózsaszín) festett szakaszokból (n ≥ 3) határoztuk meg HALO szoftverrel (Indica Laboratories, Corrales, NM). Itt inzulin/glukagon/hematoxilin kromogén módon festett tárgylemezeket szkenneltünk és töltöttünk fel a HALO szoftvercsomagba. A HALO megkülönbözteti a festett/nem festett területet, és így számszerűsítheti az inzulin vagy a glükagon által elfoglalt hasnyálmirigy területét. Ezekből az értékekből meghatározhatjuk a hasnyálmirigy és a β-sejt vagy az α-sejt területi arányát (azaz β-sejt tömegét, illetve α-sejt tömegét).

Kvantitatív elektronmikroszkópia

A frissen izolált szigeteket 4 mol paraformaldehidet és 2% glutáraldehidet tartalmazó 0,1 mol/l kakodilát pufferban rögzítettük. A mintákat gyantába ágyazottuk, metszettük és megfestettük a korábban leírtak szerint (11). A mikroszkóppal képeket készítettünk és számszerűsítettük a korábban leírtak szerint (12). Az érett inzulingranulátumokat és az éretlen inzulingranulátumokat a teljes citoplazmatikus területre vonatkoztatva, csoportonként ≥20 elektronmikroszkóppal számoltuk (n ≥ 3 biológiai replikátum, ≥1,0 mm 2 teljes citoplazmatikus terület).

Sziget izolálása, glükózstimulált inzulin szekréció, perifúzió és kvantitatív RT-PCR

Statisztikai analízis

Az adatok normalitását a D’Agostino és a Pearson teszt határozta meg. A paraméteres adatokat egy- vagy kétirányú ANOVA-val elemeztük, amelyet Tukey-teszt követett. A nem paraméteres adatokat Kruskal-Wallis teszttel, majd Dunn többszörös összehasonlító teszttel elemeztük. Szigetkísérleteknél (3. és 4. ábra) az egyes kohorszok adatait külön elemeztük annak megerősítésére, hogy nincsenek statisztikai különbségek a kombinált kohorsz adatok és az egyes kohorsz adatok között (az adatokat nem mutatjuk be). Az adatokat átlag ± SD-ként vagy dobozként, és a bajusz-ábrákat ± minimum/maximum-ként adjuk meg, adott esetben. Az összes adatot a GraphPad Prism 7.02 (GraphPad Software, San Diego, CA) alkalmazásával elemeztük. A statisztikai szignifikanciát P ≤ 0,05 értékre állítottuk be.

Eredmények

Az SGLT-2i antidiabetikus hatékonysága GLP-1 vagy TZD terápiákkal kombinálva

A hasnyálmirigy MafA expressziójának és a β-sejt inzulin tartalmának helyreállítása

Hasnyálmirigy inzulin tartalma, fix hasnyálmirigy immunhisztokémiája és frissen izolált hasnyálmirigy-szigetek elektronmikroszkópiája. V: Hasnyálmirigy inzulin tartalma (n ≥ 6). B: β-sejttömeg az inzulin/glükagon kettős festésű immunhisztokémiai szakaszokból (n ≥ 4). C és D: Érett és éretlen inzulingranulátum mennyiségi meghatározása elektronmikroszkóppal (n ≥ 3 ≥10 elektronmikroszkóppal). E – K: Hordozóval, roziglitazonnal, dapagliflozinnal, liraglutiddal, roziglitazon/dapagliflozinnal, dapagliflozin/liraglutiddal és kezeletlen sovány C57BLKS/J egerekkel (n ≥ 3) kezelt KS db/db egerek frissen izolált szigeteinek reprezentatív elektronmikroszkópos felvételei. Méretarány = 1 μm. L – R: Hegesztőanyaggal, roziglitazonnal, dapagliflozinnal, liraglutiddal, roziglitazon/dapagliflozin, dapagliflozin/liraglut inzulin (sárga), MafA (barna) és glukagon (32) rögzített pancreata immunhisztokémiai festése KS db/db egerekből. kezeletlen sovány C57BLKS/J egerek (n ≥ 4). * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001 a hordozóval szemben. A vonal feletti csillagok szignifikanciát mutatnak a jelzett csoporthoz képest. D, dapagliflozin; L, liraglutid; R, roziglitazon; V, jármű.

Szinergikus javulás a β-sejtek működésében

4 hetes kezelést követően izolált szigetekről vizsgáltuk a specifikus β-sejt funkcióval kapcsolatos kulcsgének expresszióját. Az Ins1 transzkriptum szintje mindkét kombinációval kezelt állatnál jelentősen, körülbelül nyolcszorosára nőtt (4A. Ábra), míg az Ins2 transzkriptumszint szignifikánsan nőtt a liraglutid monoterápia szigetein (ötszörös) és a liraglutid/dapagliflozin kombinációval kezelt állatoknál (hatszoros) (4. ábra). 4B. Ábra). Az Slc2a2 és a Gck mRNS-szintje nőtt a kombinációval kezelt állatokban, összehasonlítva a vivőanyag-kontrollokkal (4C és F ábra), csakúgy, mint a Mafa-transzkriptum szintje, különösen a roziglitazon/dapagliflozin (12-szeres) (4D ábra), amely kiegészíti a MafA immunfestést ( 3. ábra). A pdx1 expresszió szignifikánsan megnőtt a liraglutid monoterápiával és kombinált terápiákkal kezelt állatok szigetein is (4E ábra).

β-sejt funkcionális génelemzés és frissen izolált szigetek perifúziója. A – F: Frissen izolált qRT-PCR sziget az Ins1, Ins2, Slca2a, Mafa, Pdx1 és Gck esetében (n ≥ 4). A génexpressziót az Rna18s háztartási génre normalizáltuk, és viszonylagos expresszióként mutattuk ki a vivőanyaghoz viszonyítva. G: Frissen izolált szigetek perifúziója. 0 és 42 perc között a szigeteket 2,8 mmol/l glükózzal perifuzáltuk; 44 és 88 perc között a szigeteket 16,7 mmol/l glükózzal perifuzáltuk. A perifúzió végén a szigeteket lizáltuk, és elemeztük a fehérjetartalmat. H és I: Az első fázis (44–56 perc) és a második fázis (58–88 perc) inzulinszekréció (n ≥ 4) AUC-értéke. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001 a hordozóval szemben. A vonal feletti csillagok szignifikanciát mutatnak a jelzett csoporthoz képest. D, dapagliflozin; L, liraglutid; R, roziglitazon; RQ, relatív kvantifikáció; V, jármű.

Mivel az első fázisú inzulinszekréció elvesztése a β-sejtek szekréciós diszfunkciójának jellemzője (16), megvizsgáltuk az inzulin szekréciós választ a vivőanyag-kontrollok, kezelt egerek és sovány kontrollok szigetein. Közvetlenül az izolálás után a szigeteket előbevonatoltuk 2,8 mmol/l glükóz KRBH-val 60 percig, majd 2,8 mmol/l glükóz KRBH-val perifuzáltuk, majd stimuláló 16,7 mmol/l glükóz KRBH-val értékeltük a kétfázisú inzulin szekréciót. A monoterápiával kezelt állatok szigetei az első fázisú inzulin szekréciójának bizonyos mértékű helyreállítását és a második fázisú inzulin szekréció javulását mutatták a vivőanyag kontroll szigetekhez képest (4G ábra). A kombinációval kezelt állatok szigetei azonban erőteljes első fázisú inzulinszekréciót és tartós második fázisú inzulinszekréciót mutattak, még a monoterápiával kezelt állatok szigeteihez képest is. A kombináltan kezelt állatok szigetei szignifikánsan nagyobb első fázisú (4H. Ábra) és második fázisú (4I. Ábra) inzulinszekréciót váltottak ki a vivőanyag-kontrollhoz képest, ami a funkcionális inzulinszekréciós kapacitás helyreállításának szinergikus javulását jelzi a monoterápiás kezelésekhez képest.

Vita

Cikk információk

Köszönetnyilvánítás. A szerzők köszönetet mondanak Dr. Jotham Austin II-nek és Yimei Chennek, a Chicagói Egyetem Advanced Microscopy Core munkatársainak. A szerzők ezúton is köszönetet mondanak a Gubra ApS in vivo farmakológiai csoportjának.

Érdeklődési kettősség. Ezt a munkát a MedImmune finanszírozta. B.B.B. és M.L.B. a MedImmune korábbi alkalmazottai. C.B., J.C., M.S., W.K., C.R., J.T., C.J.R. és J.S.G. a MedImmune jelenlegi alkalmazottai. B.B.B., M.L.B., G.H. és R.V.G. a Gubra ApS jelenlegi alkalmazottai. A cikk szempontjából releváns egyéb lehetséges összeférhetetlenségről nem számoltak be.

Szerző közreműködései. B.B.B. megtervezte a tanulmányt, megírta a kéziratot, állatkísérleteket és minden szigetecske munkát végzett. C.B., J.C., M.S. és W.K. elvégzett immunhisztokémiát. M.L.B. qRT-PCR-t végzett. G.H. és R.V.G. állatkísérleteket végzett. C.R., J.T., C.J.R. és J.S.G. segíti a kísérleti tervezést. B.B.B. a garancia ennek a munkának, és mint ilyen, teljes hozzáféréssel rendelkezett a vizsgálat összes adatához, és felelősséget vállal az adatok integritásáért és az adatelemzés pontosságáért.

Előzetes előadás. A tanulmány egyes részeit az Amerikai Diabétesz Társaság 77. tudományos ülésén mutatták be, San Diego, Kalifornia, 2017. június 9–13.