A kasztrálás befolyásolja a bél mikroflóráját és hasi elhízást vált ki magas zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben

Naoki Harada

1 Alkalmazott Élettudományi Osztály, Élet- és Környezettudományi Doktori Iskola, Oszakai prefektúra Egyetem, Sakai, Oszaka 5998531, Japán

Ryo Hanaoka

1 Alkalmazott Élettudományi Osztály, Élet- és Környezettudományi Doktori Iskola, Oszakai prefektúra Egyetem, Sakai, Oszaka 5998531, Japán

Hiroko Horiuchi

1 Alkalmazott Élettudományi Osztály, Élet- és Környezettudományi Doktori Iskola, Oszakai prefektúra Egyetem, Sakai, Oszaka 5998531, Japán

Tomoya Kitakaze

1 Alkalmazott Élettudományi Osztály, Élet- és Környezettudományi Doktori Iskola, Oszakai prefektúra Egyetem, Sakai, Oszaka 5998531, Japán

Takakazu Mitani

1 Alkalmazott Élettudományi Osztály, Élet- és Környezettudományi Doktori Iskola, Oszakai prefektúra Egyetem, Sakai, Oszaka 5998531, Japán

2 Interdiszciplináris Természettudományi és Technológiai Egyetem, Shinshu Egyetem, Kamiina, Nagano 3994598, Japán

Hiroshi Inui

3 Klinikai táplálkozási osztály, Átfogó Rehabilitáció Végzős Iskola, Oszakai prefektúra Egyetem, Habikino, Oszaka 5830872, Japán

Ryoichi Yamaji

1 Alkalmazott Élettudományi Osztály, Élet- és Környezettudományi Doktori Iskola, Oszakai prefektúra Egyetem, Sakai, Oszaka 5998531, Japán

Társított adatok

Absztrakt

Az elhízás globális járványprobléma, mivel szorosan összefügg a szív- és érrendszeri betegségek fokozott kockázatával 1, 2. A hasi zsigeri zsír túlzott felhalmozódása, amely a metabolikus szindróma 2 diagnosztikai kritériuma, növeli a lipid anyagcsere rendellenességét, beleértve a máj triglicerid szintjének emelkedését 3. Ezzel szemben a szubkután zsír csökkenti a szív- és érrendszeri betegségek előfordulását, jelezve a testzsír eloszlásának fontosságát 1, 2. A legfrissebb eredmények azt mutatják, hogy a bél mikrobiota változásai összefüggenek az elhízás kialakulásával és a zsigeri zsírtömeg növekedésével 4, 5, 6, 7 .

A tesztoszteron egy férfi szexuális hormon (nevezetesen androgén), amely a férfi fiziológiai funkcióinak széles skáláját gyakorolja, például a reproduktív szervek fejlődését és a szexuális viselkedés megjelenését 8, 9. A hipogonadizmus (vagyis az alacsony tesztoszteronszint) növeli a férfiaknál az elhízás, a szív- és érrendszeri betegségek, sőt a 10, 11, 12, 13 halálozás kockázatát a testzsír, különösen a zsigeri zsír 14, 15 növekedésével; a tesztoszteron kezelés pedig csökkenti a zsigeri zsír mennyiségét 16. Az androgén-deprivációs terápiák, például kasztrálás vagy leteinizáló hormont felszabadító hormon analóg a prosztatarákos betegek számára, szintén elősegítik az elhízás kialakulását 17, 18, 19. Mivel a vérben a bioaktív tesztoszteron szint 20 év körüli 20-30 éves kor után évente körülbelül 2% -kal csökken, a tesztoszteron életkorfüggő csökkenése kockázati tényező a hasi elhízás és az ahhoz kapcsolódó betegségek életkorral összefüggő prevalenciájának férfiak 14, 20 .

Annak ellenére, hogy mind a klinikai, mind az epidemiológiai vizsgálatok során egyre több bizonyítékot vetettek be az embereken 10, 11, 12, 13, a tesztoszteron csökkenése hasi elhízást indukál. A tesztoszteron fiziológiai funkcióit széles körben elemezték a rágcsálók kasztrációs modelljeiben. Az emberektől eltérően azonban a rágcsálók a kasztrálás után fogynak a táplálékbevitel csökkenése miatt 21, 22, és így a kasztrálás nem okozza az elhízást 23 .

A magas zsírtartalmú étrend (HFD) fogyasztása megváltoztatja a 24, 25 lipidanyagcserét, és hatással van a bél mikrobiotájára is, amelyek részt vesznek a hasi elhízás kialakulásában 4. Jelen tanulmányban a HFD és a hipoandrogenizmus kölcsönhatását vizsgáltuk az elhízás kialakulásában kasztrált egér modellben. Továbbá megvizsgáltuk a bél mikrobiota szerepét a hipogonadizmus által kiváltott elhízásban ebben a modellben.

Eredmények

A kasztráció hatása az egerek testtömegére, kalóriabevitelére, takarmány-hatékonyságára, székletére és testhőmérsékletére

A HFD és a hipogonadizmus interaktív hatásainak vizsgálatához az egereket 8 hetes korukban kasztrálták vagy álműtöttek, majd 16 hétig HFD-vel etették őket (1. kísérlet). A kasztrált súlycsökkenés után a kasztrált egerek testtömege meghaladta az álműtött egerekét (1a. Ábra). Másrészt a kasztrált egerek teljes kalóriabevitelét (azaz táplálékfogyasztását) a kontroll egerek körülbelül 90% -ára csökkentették (1b. Ábra, p = 0,020). Nevezetesen a kasztrálás 14 hetes életkor után folyamatosan növelte a kumulatív takarmány-hatékonyságot, a testtömeg-gyarapodás és a kalóriabevitel hányadosaival számítva (1c. Ábra). Ezzel szemben a kasztrálás mind a testtömeg, mind a kalóriabevitel csökkenését eredményezte a kísérleti időszak alatt a standard táplálékkal (SD) táplált egerekben (2. kísérlet, 1f. Ábra, g, p. 1h ábra). A székletmennyiséget szárított széklet tömegként mértük a 17. héten, és azt találtuk, hogy mind HFD-, mind SD-vel táplált egerekben kasztrálással csökkent (1d. Ábra, p = 0,018 és 1i, p = 0,0040). Nevezetesen, az emésztés mértékét, amelyet a szárított széklet tömegének és az ételnek a bevitelének aránya határoz meg, a HFD-ben táplált kasztrálás csökkent, de az SD-vel táplált csoportban nem befolyásolta (1e. Ábra, p = 0,0040 és 1j). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kasztráció által kiváltott hipogonadizmus HFD-függő módon okozta az elhízást azáltal, hogy növelte a takarmány hatékonyságát, de nem a hyperphagia növelésével. Ezen túlmenően a széklet súlyának csökkenésével járó anyagcsere-változások felelősek a takarmány-hatékonyság növekedéséért a kasztrálással HFD-vel táplált egerekben.

(a,f) A testtömeg növekedési görbéi; (b,g) A műtét után kezdődő teljes kalóriabevitel 8 hetes korban; (c,h) A műtét után kezdődő takarmány-hatékonyság számított értéke 8 hetes korban a megadott időig; (d,én) Szárított széklet súlya naponta; (e,j) Az emésztés hatékonysága a szárított széklet tömegének a kalóriabevitellel való elosztásával kifejezve. (n = 6, SD színlelt; n = 6, SD kasztrálás; n = 7, HFD színlelt; n = 7, HFD kasztráció).

Az antibiotikumok hatása a kasztrálás okozta elhízásra HFD-vel táplált egerekben

Ezután felmértük a bél mikrobiota szerepét a kasztrálás okozta elhízásban HFD-vel táplált egerekben, mivel származékaik a szárított széklet tömegének felét teszik ki 26. A kasztrált és áloperált egereket HFD-vel etették, és az ivóvízen keresztül antibiotikum koktélokat kaptak a bél mikrobiotájának megzavarására (3. kísérlet). Az antibiotikumok rendelkezésre bocsátásakor a kasztrálás nem okozott túlsúlyt (2a. Ábra), és a kasztrált egereknél alacsonyabb a kalóriabevitel (2b. Ábra, p = 0,022). Antibiotikumokkal kezelt egereknél a kasztrálás okozta takarmány-hatékonyság növekedése gyengült (2c. Ábra), és nem mutatták a széklet tömegének (2d. Ábra) és a kasztrálással történő emésztési hatékonyság csökkenését (2e. Ábra), mivel az antibiotikumoktól mentes egerekhez képest.

(a) A testtömeg növekedési görbéi; (b) A műtét után kezdődő teljes kalóriabevitel 8 hetes korban; (c) A műtét után kezdődő takarmány-hatékonyság számított értéke 8 hetes korban a megadott időig; (d) Szárított széklet súlya naponta; (e) Az emésztés hatékonysága a szárított széklet tömegének a napi kalóriabevitellel való elosztásával kifejezve. (n = 8, színlelt és n = 6, kasztrálás).

A kasztrálás hatása a szövetek tömegére

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A statisztikai különbségek (* p 1c. Ábra) és a testtömeg-gyarapodás akkoriban szembetűnő volt a HFD-vel táplált egerekben (1a. Ábra). A kasztrálás hatásait HFD-vel táplált egerekben összehasonlítottuk a HFD-vel táplált egerek és antibiotikumok hatásával, mivel a HFD ismerten erősen befolyásolja a lipid anyagcserét. A 13 hetes egerek relatív szervtömegét az S1 kiegészítő táblázat foglalja össze. Ebben a korai szakaszban már előfordult a mezenterialis és a perinefricus/retroperitoneális zsírszövetek kasztrálódással történő növekedése (p = 0,024, illetve p = 0,015), ugyanakkor antibiotikumok jelenlétében a zsírszövet hasonló növekedését nem indukálták. A HFD-vel táplált egerek mesenterialis zsírjában a lipid lebomlásáért felelős gének zsírszegény triglicerid lipáz (Atgl) és hormonérzékeny lipáz (Hsl) expresszióját kasztrálással elnyomtuk (3a. Ábra, 2. táblázat), kitértünk rá a gén expressziója megváltozik a májban 13 hetes korban. HFD-vel táplált, antibiotikumoktól mentes egerekben a kasztráció jelentősen megnövelte a Cd36 értéket (p = 0,0026) (3b. Ábra), ami az FFA bevitelének fokozására utal. A mesenterialis zsírtól eltérően az antibiotikumokkal történő kiegészítés szinte semmilyen hatást nem gyakorol a máj gén expressziójának kasztráció által közvetített változásaira.

A kasztrálás hatása a bél mikrobiotájára

A kasztrálási hatásokat, például az elhízást, a zsigeri zsírfelesleget, a máj trigliceridszintjének emelkedését, az éhomi vércukorszint emelkedését és a széklet tömeg-étel bevitelének csökkenését HFD-vel táplált egerekben nem figyelték meg, amikor az egereket antibiotikummal kezelték. Az antibiotikumok drámaian csökkenték a székletbaktériumok számát (de a rezisztens baktériumok valószínűleg megmaradtak), és nyilvánvalóan megnőtt a vakbél súlya (az adatokat nem közöljük). A bélmikrobiom befolyásolja a máj lipidanyagcseréjét és a zsigeri zsírtömeget, nem pedig a szubkután zsírtömeget 6, és a HFD fogyasztása kritikusan megváltoztatja a bél mikrobiota összetételét30. Egy nemrégiben végzett tanulmány azt mutatta, hogy a bél mikrobiota különbözik a férfiak és a nők között, és részt vesz a nemi vonatkozású betegségek előfordulásában 31. Megállapítottuk, hogy a Firmicutes/Bacteroidetes arány és a Lactobacillus spp. a HFD-vel táplált egerek kasztrálásával a szintek növekedtek. Eredményeink alátámasztják, hogy a magasabb Firmicutes/Bacteroidetes arány és a megnövekedett Lactobacillus spp. az 5., 7., 27., 28. elhízás gyakoriságával társulnak .

A HFD-vel táplált kasztrált egerek elhízását a takarmány hatékonyságának emelkedése okozta, de nem a hyperphagia. Általában a kasztráció és az ovariectomia hypophagia és hyperphagia kialakulását eredményezi, és alacsonyabb és nagyobb súlygyarapodást eredményez a hím, illetve a nőstény rágcsálóknál, illetve 21, 41. Ezért a HFD-vel táplált egerek kasztrálásával történő elhízás indukciójának mechanizmusa különbözött az ovariectomia által kiváltott elhízott nőstény egerekétől. Az elhízott AR-KO hím egerek csökkent fizikai aktivitást mutatnak, az O2 fogyasztás csökkenésével együtt 35. A HFD-vel táplált egerekben a kasztrálás növelte a Firmicutes/Bacteroidetes arányt, amelyről kiderült, hogy növeli az 5. étrendből származó energia betakarításának képességét, és ez csökkentette a széklet tömeg-étel bevitelét. Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy az energiafelhasználás csökkenése és az étrendből származó energia növekedése egyaránt szerepet játszik a takarmány-hatékonyság hipogonadizmus által kiváltott emelkedésében.

A viscerális zsír felhalmozódásáért felelős molekuláris mechanizmus a lipolízis csökkenésén és nem a lipogenezis növekedésén alapul. A mesenterialis zsírban az Atgl és a Hsl HFD-vel táplált egerekben történő kasztrációval elnyomódott, de az antibiotikum-kezelés változatlan maradt. Az intraperitoneális WAT-okban a Hsl jelentős csökkenését figyelték meg a globális AR-KO elhízott egerekben 42. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a zsigeri WAT-okban a csökkent lipolízis hasonló az AR-KO egereknél és az elhízott fenotípus kasztrációs HFD-vel táplált egérmodelljénél. Ezzel szemben a HFD-vel táplált kasztrált egerek májában a triglicerid feltehetően a lipogenezis (azaz a Fasn és az Acc növekedése) és az FFA bevitel (azaz a Cd36 növekedése) növekedésével halmozódott fel. Ezeket a májváltozásokat az antibiotikum-kezelés nem befolyásolta, és hasonlóak a máj-specifikus AR-KO egereknél (azaz a Srebp-1c, Acc, Scd1 és Pparg), amelyek elhízottak 40 .

A kis comb kerülete növeli mind a szívbetegségek, mind a halálozás kockázatát 43. Az alacsony tesztoszteronszint szintén kockázati tényező a szív- és érrendszeri betegségekre, valamint a rövidített élettartamra 10, 11, 12. Eredményeink azt mutatják, hogy a kasztrálás a quadriceps és a combhajlító izomtömegek elvesztését okozta, ami a comb kerületének csökkenését eredményezte, mindez HFD-függő módon történt. Ezért csökkent comb kerülete szerepet játszhat az alacsony tesztoszteronszint és a szív- és érrendszeri megbetegedések közötti összefüggésben, vagy a rövidített élettartamban. A globális AR-KO, izomspecifikus AR-KO és kasztrációs egér modellek eredményei a láb és a comb izomtömegén inkonzisztensek 22, 42, 44, 45, 46, és ebben a vizsgálatban a comb izomtömegét nem csökkentették kasztrációval amikor az egereknek antibiotikumot adtak. Ezenkívül eredményeink azt sugallják, hogy az androgénmegvonás HFD-függő módon szarkopéniás elhízást okoz.

A kasztrálás növelte az éhomi vércukorszintet a HFD-vel táplált egerekben, míg a kasztrálás még a HFD-vel táplált egereknél sem befolyásolta az inzulinérzékenységet. Az elhízott fenotípussal rendelkező AR-KO egerek két vonalának egyike az inzulinérzékenység csökkenését mutatja 34; míg a másik vonal nem mutat hatást az inzulinérzékenységre 33, 42. Ebben a vizsgálatban az inzulinérzékenység (6 órás böjt után) nem változott, de az éhomi glükóz (15 órás böjt után) a HFD-vel táplált egerek kasztrálásával növekedett. Másrészt a bazális plazma inzulinszint (4 órás gyors után) kissé csökkent a HFD-vel táplált egerek kasztrálásával (p = 0,27, 2. táblázat). Eredményeink arra utalhatnak, hogy a HFD-vel táplált egerekben az inzulin szekréciója károsodott. Ezt a lehetőséget támasztják alá publikált kéziratok, amelyek arra utalnak, hogy a tesztoszteron részt vesz a β-sejtek működésében 47, 48 .

Az AR-KO egérmodellek előnyösek az androgének hatásainak elemzésében. Azonban a globális AR-KO hím egerek nőstény külső külső nemi szervekkel és kicsi, le nem ereszkedő herékkel születnek 36, ami kétségbe vonja azt, hogy az AR-KO egerek fenotípusai teljes mértékben a tesztoszteron életkorral összefüggő csökkenését mutatják. Jelen tanulmányunkban C57BL/6J egereket használtunk, amelyek széles körben használt beltenyésztett törzsek genetikailag módosított egerek létrehozásához. Arra a következtetésre jutunk, hogy az étrend és a kasztráció által kiváltott elhízási modell hatékony eszköz lesz a hipogonadizmussal kapcsolatos betegségek tanulmányozásához.

Mód

Állatok

Fogyókúrák

Az SD és a HFD összetételeit az S2 kiegészítő táblázat tartalmazza. A CLEA Japan cégtől kazeint, kukoricakeményítőt, α-kukoricakeményítőt, kukoricaolajat, sertészsírt, marhafaggyút, cellulózt, ásványi keveréket és vitaminkeveréket kaptunk. Az összetevőket összekevertük, és a porított étrendeket felhasználásig -20 ° C-on tároltuk. Friss táplálékot adtak az állatoknak hetente háromszor. Antibiotikumokat (1 g/l nátrium-ampicillin, 0,5 g/l vankomicin-hidroklorid, 1 g/l neomicin-szulfát és 1 g/l metronidazol) adtunk be ivóvízzel kasztrálás után.

Az inzulin, a triglicerid, az FFA és a koleszterinszint mérése

A plazma inzulinszinteket inzulin ELISA kit segítségével határoztuk meg (Shibayagi, Gunma, Japán). A lipideket mind a májból, mind a székletből Folch 50-es módszerével extrahálták. A triglicerid szintet a májban, a plazmában és a székletben triglicerid E-teszttel határoztuk meg (Wako, Osaka, Japán). A plazma, széklet és máj koleszterinszintjét a koleszterin E-teszttel (Wako) határoztuk meg.

Valós idejű PCR

A szövetekből teljes RNS-t izoláltunk, és a cDNS-t szintetizáltuk ReverTra Ace (TOYOBO, Osaka Japan) és dT20 primerek alkalmazásával. A genomi DNS-t székletmintákból extrahálták cirkónium gyöngyökkel (ϕ 5 mm és ϕ 0,2 mm) multi-gyöngyös sokkolóval (MB755U (S), Yasui Kikai, Osaka, Japán) és a QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit-lel (Qiagen, Hilden)., Németország). A kvantitatív RT-PCR-t SYBR Premix Ex Taq II (TAKARA Bio, Shiga, Japán) alkalmazásával végeztük el a különféle primerekkel (S3 kiegészítő táblázat). A PCR program 95 ° C, 60 mp volt, majd 40 ciklus következett (2 lépés: 95 ° C, 30 mp; izzítás és megnyúlás, 30 mp vagy 3 lépés; 95 ° C, 30 mp; izzítás, 30 mp; megnyúlás, 72 ° C, 30 mp). A célgének relatív expresszióját a standard görbéhez illesztett Ct-érték felhasználásával számítottuk, amelyet hígított cDNS-sorozatból nyertünk, és amelyet a kontroll gén normalizált (pl. Β-aktin vagy 16 S rRNS az összes baktérium esetében).

Statisztikai analízis

Az adatokat a Student t-tesztjével vagy egyirányú varianciaanalízissel elemeztük, majd Tukey-Kramer post-hoc tesztje követte a JMP statisztikai szoftver 8.0.1 verzióját (SAS Institute, Cary, NC, USA). Az adatok átlagként ± SEM-ként jelennek meg, és a csoportok közötti statisztikai különbségeket vesszük figyelembe, amikor p (722K, pdf)

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Grants-in-Aid (25450176) támogatta tudományos kutatás céljából (N.H.-nek) a Japan Society for the Promotion Science-től. Köszönetet mondunk Masahiro Ogawának (Oszakai prefektúra Egyetem) a technikai segítségért.

Lábjegyzetek

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő pénzügyi érdekeik.