A kísérleti opisthorchiasis feltáró metabolomikai vizsgálata laboratóriumi állatmodellben (aranyhörcsög, Mesocricetus auratus)

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Leiden Egyetem Orvosi Központ Parazitológiai Tagozat, Leiden, Hollandia

Szerepek Formális elemzés, módszertan, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Affilációs Proteomikai és Metabolomikai Központ, Leideni Egyetem Orvosi Központ, Leiden, Hollandia

Szerepek Formális elemzés, vizualizáció

Proteomikai és Metabolomikai Tagsági Központ, Leideni Egyetem Orvosi Központja, Leiden, Hollandia, Translációs Farmakológia, Krónikus Betegségek Kutatóközpontja, NOVA Orvosi Iskola, Lisszabon, Portugália

Szerepek vizsgálata, módszertan

A Tomszki Állami Egyetem Kémiai Tanszéke, Tomszk, Oroszország

Szerepek vizsgálata, módszertan, források

Szövetségi Központi Kutatólaboratórium Szibériai Állami Orvostudományi Egyetem, Tomszk, Tomszk, Orosz Föderáció

Szerepek vizsgálata, módszertan, források

Szövetségi Központi Kutatólaboratórium Szibériai Állami Orvostudományi Egyetem, Tomszk, Tomszk, Orosz Föderáció

Szerepek konceptualizálása, finanszírozás megszerzése, felügyelet

Szibériai Állami Orvostudományi Egyetem Kar Gyermekgyógyászat tagsági tanszéke, Tomszk, Tomszk, Oroszország

Szerepek Projekt adminisztráció

Tomszki Állami Egyetem Kémiai Tanszéke, Tomszk, Oroszország

Szerepek vizsgálata, projekt adminisztráció, források, írás - eredeti tervezet

Partneri transzlációs farmakológia, Krónikus Betegségek Kutatóközpontja, NOVA Orvosi Iskola, Lisszabon, Portugália

Szerepek konceptualizálás, formális elemzés, módszertan, felügyelet, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Proteomikai és Metabolomikai Központ, Leideni Egyetem Orvosi Központja, Leiden, Hollandia, Tomszki Állami Egyetem, Kémiai Tanszék, Tomszk, Oroszország

Daria A. Kokova,
Sarantos Kostidis,
Judit Morello,
Nataly Dementeva,
Ekaterina A. Perina,
Vlagyimir V. Ivanov,
Ludmila M. Ogorodova,
Alekszej E. Szazonov,
Irina V. Saltykova,
Oleg A. Mayboroda

Ábrák

Absztrakt

Háttér

Az opisthorchiasis egy parazita fertőzés, amelyet az Opisthorchiidae család májmellékei okoznak. Mind a kísérleti, mind az epidemiológiai adatok határozottan alátámasztják ezen paraziták szerepét a hepatobiliaris patológiák etiológiájában és az intrahepatikus cholangiocarcinoma fokozott kockázatát. A fertőzés és a máj- és epebetegségek közötti funkcionális kapcsolat megértéséhez részletes leírást igényel a gazda-parazita kölcsönhatás a biológiai szabályozás különböző szintjein, beleértve a fertőzés metabolikus válaszát is. Az utolsó azonban gyakorlatilag nem dokumentált. Itt leírjuk az Opisthorchiidae fertőzésre adott gazdaszervezet válaszát metabolomikai megközelítés alkalmazásával, és bemutatjuk az O. felineus fertőzés kísérleti modelljének első feltáró metabolomikai vizsgálatát.

Módszertan és főbb megállapítások

Nukleáris mágneses rezonancia (NMR) alapú longitudinális metabolomikai vizsgálatot végeztünk 30 állatból álló, két fertőzésben szenvedő állatból álló csoport és egy kontrollcsoport részvételével. Feltáró elemzés azt mutatja, hogy az adatok legszembetűnőbb trendje (a teljes variancia 30% -a) a nemek közötti különbségekhez kapcsolódott. Ezért az egyes nemcsoportok további elemzését külön elvégeztük az ANOVA — ASCA többváltozós kiterjesztésével (ANOVA szimultán komponens elemzés). Megmutatjuk, hogy a hímeknél a fertőzés-specifikus idő trendek vannak jelen a fő komponensben (43,5% variancia), míg a nőknél csak a második komponensben jelenik meg, és a variancia 24% -át fedi le. 24 metabolitot választottunk ki és jegyzeteltünk a megfigyelt hatásokhoz, és fiziológiásan értelmeztük a megállapításokat.

Következtetések

Az első feltáró metabolomikai tanulmány bemutatja az O. felineus fertőzés kísérleti modelljét. Adataink azt mutatják, hogy a fertőzés korai szakaszában egy organizmus válasza nemspecifikus módon bontakozik ki. Ugyancsak az érintett fő fiziológiai mechanizmusok meglehetősen nem specifikusak (a metabolikus stressz állapota), az adatok egy sor hipotézist adnak az Opisthorchiidae fertőzés specifikusabb metabolikus markereinek keresésére.

Szerző összefoglalása

Az opisthorchiasis egy parazita fertőzés, amelyet az Opisthorchiidae család (Trematoda; Platyhelminthes) májmellékei okoznak. A májbetétes fertőzések kiváltják a hepatobiliaris patológiákat, mint például a kolecisztitisz, kolangitisz, hasnyálmirigy-gyulladás és kolelithiasis krónikus formái. Az Opisthorchiidae fertőzés legveszélyesebb hatása azonban az intrahepatikus cholangiocarcinoma fokozott kockázata. Ezzel a munkával bepillantást nyerhetünk az Opisthorchiidae fertőzésre adott gazda válaszába metabolomikai megközelítés alkalmazásával. A metabolomika egy posztgenomikus tudományág, amely a metabolomot tanulmányozza. A metabolom dinamikus jellege, a külső ingerekre adott válaszváltozás képessége optimális „felolvasást” tesz lehetővé egy szervezet szisztémás reakcióinak leírására irányuló feltáró vizsgálatok számára. Ezzel a megközelítéssel megmutatjuk, hogy az O. felineus fertőzésre adott korai válasz nemtől függően alakul ki. Ezenkívül az O. felineus fertőzésre adott metabolikus válasz ezen első feltáró elemzésével egy állatmodellben bemutatjuk a fertőzés korai szakaszában változó metabolitok egy részét és felajánljuk a lehetséges fiziológiai értelmezést.

Idézet: Kokova DA, Kostidis S, Morello J, Dementeva N, Perina EA, Ivanov VV és mtsai. (2017) A kísérleti opisthorchiasis feltáró metabolomikai vizsgálata laboratóriumi állatmodellben (aranyhörcsög, Mesocricetus auratus). PLoS Negl Trop Dis 11 (10): e0006044. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006044

Szerkesztő: John Pius Dalton, a Queen's University Belfast, EGYESÜLT KIRÁLYSÁG

Fogadott: 2017. június 12 .; Elfogadott: 2017. október 17 .; Közzétett: 2017. október 31

Adatok elérhetősége: A PLOS adatpolitikájának megfelelően egy minimális adatkészlet (az adatokat már feldolgoztuk spektrális összevonással) támogató információként (4. támogatási információ) nyújtunk. A teljes nyers adatokért kérjük, lépjen kapcsolatba a LUMC Proteomikai és Metabolomikai Központtal a következő címen: Rob Marissen [email protected].

Finanszírozás: Az Orosz Tudományos Alapítvány által támogatott munka (http://www.rscf.ru/en) [támogatás száma 14-15-00247]. Ezenkívül J. M.-t a Portugál Tudományos és Technológiai Alapítvány támogatta (SFRH/BSAB/114291/2016 számú támogatás). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az opisthorchiasis egy parazita fertőzés, amelyet az Opisthorchiidae család (Trematoda; Platyhelminthes) májmellékei okoznak. A család az emberi egészség szempontjából három legfontosabb fajt tartalmazza: C. sinensis, O. viverrini, O. felineus; világszerte több mint 45 millió fertőzésért felelősek; Jelenleg 600–750 millió ember van veszélyben [1, 2]. Az O. viverrini és a C. sinensis a távol-keleti régiókban és Délkelet-Ázsiában endemikus, továbbra is fontos közegészségügyi probléma [3]. Az O. felineus-fertőzés igen elterjedt Kelet-Európában (Ukrajna és Oroszország európai része), Közép-Ázsiában (Kazahsztán északi része) és Észak-Ázsiában (Szibéria) [2]. Mind a kísérleti, mind az epidemiológiai adatok erőteljesen alátámasztják a májbogár-fertőzések szerepét a hepatobiliaris patológiák, például kolecisztitisz, kolangitisz, hasnyálmirigy-gyulladás és kolelithiasis krónikus formáiban [2–5]. Az Opisthorchiidae fertőzés legveszélyesebb hatása azonban az intrahepatikus cholangiocarcinoma fokozott kockázata [6].

Itt mutatjuk be az O. felineus fertőzés kísérleti modelljének első feltáró metabolomikai vizsgálatát. Megalapozott hörcsögfertőzési modell felhasználásával nukleáris mágneses rezonancia (NMR) alapú metabolomikai vizsgálatot végeztünk 30 állatból álló, két fertőzésfokozatú (súlyos és enyhe) csoport és egy kontrollcsoport bevonásával. A vizeletmintákat kéthetente gyűjtöttük, több hónapon keresztül. Felügyelet nélküli és felügyelt többváltozós statisztikai elemzés kombinációjával megkülönböztetni tudtuk a fertőzés időben megoldott vizelet-anyagcsere mintázatát.

Anyag és módszerek

Etikai nyilatkozat

A vizsgálatban felhasznált összes hörcsögöt az állatgondozásra vonatkozó nemzeti irányelvek ajánlásainak megfelelően kezelték: 1977.08.12. N 755 "A kísérleti állatok felhasználásával végzett munka szervezeti formáinak tovább javítását célzó intézkedésekről". A tanulmányt a Szibériai Állami Orvostudományi Egyetem helyi etikai bizottsága jóváhagyta, 2013.04.29-én kiadott 3296 engedélyszámmal.

Kísérleti opistorchiasis modell

A tojás számít

A peték átlagos számát egy gramm székletben a módosított Kato módszerrel számítottuk (Katz et al. 1972). A vizsgált időpontban minden állat székletmintáját Mini-Beadbeater-16 (Bio-Spec) elegyével 5 percig kevertük. A széklet 25 mg-os mintáját elektronikus mérleggel (Sartorius típusú 1702, érzékenység 0,1 mg) lemértük közvetlenül a homogenizálás után. Két tárgylemezt készítettünk 25 mg székletre. A tojásszám 25 mg-os mintánként a tojás/gramm értékre történő extrapolálását egyszerű szorzással végeztük (x 40).

Vizeletminta előkészítése

A pufferoldathoz használt összes vegyszert a Sigma-Aldrich-től vásároltuk, kivéve a 2 H2O-t, amelyet a Cortecnet vásárolt, és a 3- (trimetil-szilil) -propionsav-2,2,3,3-d4-sav-nátriumsót (TSP) a Cambridge Isotope-tól. Laboratories Inc. 96 lyukú lemezeket és NMR-csöveket a Bruker Biospin Ltd.-től (Németország) vásároltunk.

Mintánként 0,5 ml vizelet alikvot részeit egy éjszakán át 4 ° C-on felolvasztjuk. A sejtkomponenseket és más oldhatatlan anyagokat centrifugálással 10 percig 3184 g és 4 ° C hőmérsékleten centrifugáljuk, majd a felülúszókat 96 lyukú lemezekre visszük. Az egyes mintákból 270 μl vizeletet összekevertünk 30 μl pufferoldattal 2 H2O-ban (pH = 7,4), amely belső standardként 1,5 M K2HPO4-et, 2 mM NaN3-ot és 4 mM TSP-2,2,3,3-d4-et tartalmazott, és kémiai eltolódási referencia (0,4 mM végkoncentráció minden mintában). Végül minden egyes vizelet-puffer keverékből 165 μl-t vittünk át 3 mm-es SampleJet NMR-csövekbe, és az NMR-mérésekig egy SampleJet-rendszer hűtőszekrénybe (6 ° C) tettük. A vizelet pufferrel történő keverését és a keverék NMR-csövekbe történő átvitelét két 215 Gilson folyadékkezelő robot végezte, és a SampleTrack szoftver (Bruker Biospin Ltd.) vezérelte.

NMR adatgyűjtés

Kétdimenziós J-felbontású spektrumokat (2D Jres) is gyűjtöttünk minden egyes mintához, ugyanazzal a vízelnyomási sémával, mint fent leírtuk 2 másodperces relaxációs késleltetés alatt. A spektrumszélességet 16,66 ppm-re (12288 Hz) állítottuk be a közvetlen dimenzióra és 78 Hz-t a közvetett egy dimenzióra, és 2 pásztázást kaptunk 40 lépésenként. A FID-eket automatikusan Fourier-transzformációval dolgozták fel, és a spektrumokat a TSP jelre utalták, az F2 dimenzióban 0,0 ppm, az F1 dimenzióban pedig 0,0 Hz.

A hozzárendelés céljából 2D-NMR-spektrumokat is nyertünk, amikor az összes vizeletmintát keverjük össze. A 2D kísérletek 1 H-1 H korrelációs spektroszkópiát (COZY), 1 H-1 H teljes korrelációs spektroszkópiát (TOCSY), 1 H-13 C heteronukleáris egyszeri kvantum korrelációt (HSQC) és 1 H-13 C heteronukleáris többszörös kötést tartalmaztak korrelációs spektroszkópia (HMBC) a Topspin 3.0 könyvtárban (Bruker Biospin Ltd.) alkalmazott standard paraméterek felhasználásával.

Spektrális adatfeldolgozás és adatelemzés

Az NMR adatok (S2 File) statisztikai elemzésre alkalmas előfeldolgozását házi rutinokkal végeztük, amelyeket Matlab 2014a (The Mathworks, Inc., USA) és Python 2.7 (Python Software Foundation, www.python.org) írtak. Az összes 1D NMR1H spektrumot újra megvizsgáltuk a hibás alapvonalakra, és korrigáltuk az 5. fokú polinomiális illesztéssel. A 0,5–9,5 ppm spektrumtartományt az adaptív intelligens binning házon belüli algoritmusával hígítottuk [18]. A kezdeti tartályszélességet 0,02 ppm-re állítottuk, és a végső változó tartályméretet a spektrum csúcsai szélei alapján számítottuk ki, a legalacsonyabb szórás kritériumának alkalmazásával. A spektrum régiót, beleértve a maradék vizet és a karbamidcsúcsokat (δ 4,5–6,2 ppm), kizártuk az adatokból.

A végső adatok 392, változó méretű × 490 megfigyelésből álló tárolóból álltak (minták), amelyeket a valószínűségi Quotients Normalization módszerrel (PQN) [19] normalizáltunk, hogy korrigáljuk az egyes minták közötti hígítási különbségeket. Végül a normalizált adatokat egységnyi varianciára skálázták a statisztikai elemzéshez.

Az adatelemzést R statisztikai környezettel végeztük ((http://www.r-project.org/, R 3.3.2 verzió). Feltáró elemzéshez „Rcpm”, „pcaMethods” és „caret” csomagokat használtunk. ASCA a modellezést az „lmdme” csomag [20] segítségével végeztük. A vizualizációkat „ggplot2”, „cowplot” és „gridExtra” csomagokkal.

A metabolitok azonosítása

A metabolitok azonosítását a teljes 1D és 2D Jres adatok kimerítő keresésével végeztük a Bbiorefcode (Bruker Biospin Ltd.) és a ChenomX NMR suite 8.1 (Chenonx Inc.) adatbázisok felhasználásával. Az annotált rezonanciák azonosítóit az összegyűjtött 2D NMR adatok tovább igazolták.

Eredmények

Felnőtt féreg és petesejt számít

A vizsgálati terv 30 állatot foglal magában három csoportra osztva: egy kontroll nem fertőzött csoport és a két kísérleti csoport, amelyek tizenöt és ötven metacercaria fertőzött. 1. ábra. Minden kísérleti csoport azonos számú hím és nőstény állatból állt. Az aktuális kéziratban leírt adatkészlet az alapvonaltól a kéthetente gyűjtött harminckét hétig tartalmazza a mintákat. A felnőtt férgek számának mediánja a vizsgálat végén 35 volt a súlyos és 6 az enyhe fertőzésintenzitású csoport esetében (p-érték = 0,003) (S1A ábra). A fertőzés után 4 héttel kezdődően az összes székletmintában kimutatták az O. felineus tojásait. Az S1B ábra a tojástermelés időbeli lefutását mutatja a kísérlet teljes időtartama alatt. Mindkét kísérleti csoport esetében a tojástermelés koherens növekedését mutatja 4-10 héten keresztül. Figyelembe vesszük a tojástermelés változásait, amelyek a fertőzés különböző stádiumához kapcsolódnak, nevezetesen egy akut (10 hétig) és krónikushoz (10 héttől kezdve). A kísérlet 12. és 30. hetétől a tojástermelés stabil, és a magas fertőzéssel rendelkező csoportnak folyamatosan magasabb a tojástermelése. A kimenet szignifikánsan magasabb a 12. (p-érték = 0.002), a 14. (p-érték = 0.004), 16. (p-érték = 0.030), 20. (p-érték = 0.001), 26. (p-érték = 0,001) és 28 (p-érték = 0,009).

A vizelet anyagcsere profiljának feltáró elemzése

A nemi specifikus anyagcsere-változások elemzése a fertőzés akut fázisában

A 2. ábrán bemutatott adatok egyértelműen jelzik, hogy a fertőzésfüggő változások egyszerű elemzését akadályozza a nem és az idő trendje. Így az elemzés bonyolultságának csökkentése érdekében úgy döntöttünk, hogy a kísérlet 0-10 hetes periódusára koncentrálunk: egy olyan időkeretre, amikor a petesejt mennyisége folyamatosan növekszik (S1B ábra). Az elemzést külön végeztük a férfi és a női részhalmazokon. A 3. ábra a PCA modelleket mutatja, amelyek a kísérlet 0. és 10. hete közötti adatokra épülnek. A „férfi modellnek” (3A., 3B. És 3C. Ábra) négy komponensre volt szükség a variancia 50% -ának, az első kettővel magyarázott 42% -ának magyarázatához. A csak nőstényeket tartalmazó adatok modellalkotásához (3D, 3E és 3F ábra) 6 komponensre volt szükség a variancia 50% -ának magyarázatához az első kettő 34% -ával. Mindkét modell meglehetősen hasonlónak tűnik, azonban a geometriai pályaelemzést [21] alkalmazva (3C. És 3F. Ábra) néhány mögöttes különbség feltárható. A fertőzött állatok geometriai időpályái (E1 és E2 csoport) egyértelműen meg vannak határozva a hím modellben (3C. Ábra). Ugyanakkor a nőstény alcsoportban (3F. Ábra) csak a magasan fertőzött állatok (E1) pályájának van különálló formája, az alsó fertőzési csoport pályája ugyanolyan véletlenszerű, mint a kontroll.

Geometriai időpályák: C – hímek, F — nőstények.

ANOVA szimultán komponenselemzés (ASCA) modellezése

Vita

A nemekkel kapcsolatos tendencia az adatok szórásának körülbelül 30% -át magyarázza; ezért további elemzéseket végeztek az egyes alcsoportokról külön-külön. Mind a felügyelet nélküli többváltozós modellezés, mind az ASCA-alapú elemzés azt mutatta, hogy a fertőzésre adott időfüggő válasz másképp alakul ki a férfiaknál és a nőknél. Ezenkívül a 4. ábra, amely áttekintést nyújt az idő-fertőzés interakcióval összefüggő fő mintázatokról, egyértelműen azt mutatja, hogy a férfi modellben az elsődleges komponensben a különféle tendencia kétszer akkora szórást fed le, mint a női modell, ahol a hasonló tendencia csak a második komponensben látható. A megfigyelt hatások biológiai relevanciájának megvitatása természetesen csak akkor lehetséges, ha tudjuk a modelleket befolyásoló metabolitok azonosságát. A legbefolyásosabb entitások egy részét az 1. táblázat mutatja be. Összességében a metabolitok többé-kevésbé standard halmazaként jelenik meg, amelyekről rendszeresen beszámolnak a vizelet NMR-alapú metabolomikai vizsgálatai. Erős átfedés van a fent említett Schistosomiasisról szóló publikációkban közölt metabolitokkal is.

Segítő információ

S1 ábra A fertőzés intenzitásának áttekintése.

A. Féregszám a kísérlet végén; B. A tojástermelés idődinamikája.