A klenbuterol molekuláris és fenotípusos változásokkal indukálja a patkányban a Latissimus Dorsi izom és szív hipertrófiáját.

A Royal Brompton National Heart and Lung Institute-tól, London, Egyesült Királyság.

Absztrakt

Háttér A vérkeringés csontvázizom-segítése a végstádiumú szívelégtelenségben szenvedő betegek számára megköveteli a latissimus dorsi szárny elektromos edzését a fáradtságállóság érdekében. Ez az elektromos átalakulás és a posztmobilizációs atrófia kialakulása a keletkező csúcsteljesítmény mélységes veszteségét eredményezi. A β2-adrenoreceptor agonista clenbuterolt arra használták fel, hogy megvizsgálják a vázizom hipertrófia, különösen a latissimus dorsi izom (LDM) szelektív kiváltásának lehetőségét, függetlenül a szívizom káros hatásaitól.

Mód

Állatok és kezelési rend

Szövettan

Az intersticiális fibrózis jelenlétét 6 μm-es LDM-szakaszokon és a bal kamrán (kontroll és klenbuterollal kezelt patkányoktól) határoztuk meg, amelyeket van Gieson-oldatban (1 rész 1% -os vizes sav-fukszin, 9 rész telített vizes pikrinsav, és 10 rész desztillált víz) 5 percig. A felesleges foltot a gyors dehidratálás előtt leöblítettük egy alkoholos sorozatba merítéssel, tisztítással és tartós felszereléssel. A tárgylemezeket a mikroszkóp alatt (Zeiss) vizsgáltuk a fibrózis esetleges területeiről, és reprezentatív területeket fényképeztünk.

Sejtkultúra

Az újszülött patkány szívsejtjeinek primer tenyészeteit a korábban leírt módosításokkal hoztuk létre. Röviden, tripszinezés és 45-60 percen keresztüli előfeldolgozás után a szennyező nonkardiociták számának korlátozása érdekében a sejteket 3,75 × 106 sejt/75 cm2 tenyésztőedény sűrűségében (5 × 104 sejt/cm2) szélesztettük, és hagyták 24-36 órán át kapcsolódni penicillinnel/sztreptomicinnel és 5% FCS-sel kiegészített DMEM-ben. A nem izomsejtek növekedését 0,1 mmol/l bróm-dezoxiuridin hozzáadásával gátoltuk, és a sejteket 5% CO2-atmoszférában tartottuk. A 3. nap reggelén a sejteket penicillinnel/sztreptomicinnel/inzulinnal/transzferrinnel (Sigma) kiegészítve szérummentes DMEM/Medium 199 (4: 1) táptalajra cseréltük. Adrenerg agonistákat vagy ezek hígítóját (100 μmol/l aszkorbinsav) adtuk az edényekhez 6 órával a szérummentes táptalajba történő átvitel után. A táptalajt ezután 24 óránként cseréljük friss agonista vagy vivőanyag hozzáadásával. Ezekhez a vizsgálatokhoz 4 μmol/l koncentrációjú norepinefrin-, izoproterenol- vagy clenbuterol-koncentrációt alkalmaztak.

RNS elemzések

RNS izolálás és Northern Blotting

Az aktin és az MHC izo-mRNS-ek „forró” RT-PCR elemzése

A kontroll, a clenbuterollal kezelt, a hypothyreos és a hyperthyroid patkányok bal kamráiból kivont 1 μg teljes RNS-ből komplementer DNS-t szintetizáltunk egy első szálú cDNS-szintézis készlet és primerként az oligo (dT) 18 felhasználásával a gyártó szerint. utasításokat (Pharmacia). Az inkubációkat 37 ° C-on 1 órán át folytattuk, majd az amplifikáció előtt 10 percig 95 ° C-on denaturáltuk. A PCR-amplifikációkat a következő oligonukleotidokkal érték el: előreindító, ACC AGG GTG TCA TGG és fordított primer, GTG AGC AGG GTC GGG. Az egyes RT reakciókból egy alikvot részt vettünk PCR-re, és amplifikáltuk Taq polimeráz 5 'véggel jelzett előreindító primer, dNTP-k és standard pufferkeverék (Promega) jelenlétében. Az α-aktin izoformákat megkülönböztettük a PCR reakcióelegy egy alikvot részének emésztésével 15 U Zacskó I (10 U/μL, Boehringer) 202 bp töredékeket kapunk a csontváz α-aktin és 161 + 39 bp töredékeket a szív α-aktin esetében. A megfelelő töltőpuffer hozzáadása után a töredékeket 6% karbamid/poliakrilamid gélen választottuk el. A mennyiségi meghatározást a kapott autoradiogramok densitometriai elemzésével érték el.

Statisztika

A vázizom és a szív nedves súlya. Hipertrófia volt látható a GPS-ben (P LDM (20% - 29%)> szív (18% - 20%), és mindegyik esetben nagyobb volt 5 hét elteltével, mint a clenbuterol-kezelés 2 hetes kezelésében. Jó korreláció volt a szív-tibia arány és az LDM-tibia arány között (r= .81).

Szövettan. Annak megállapítására, hogy a clenbuterol által kiváltott hipertrófia társult-e az LDM vagy a bal kamra intersticiális fibrózisához, a kontroll és a clenbuterollal kezelt patkányok metszeteit elemeztük van Gieson festés után. A bal kamra van Gieson-festett szakaszai és az LDM a kontroll és a clenbuterollal kezelt patkányoktól hasonló megjelenésűek voltak (lásd 2A. És 2B. Ábra). A sárgára festő izomrostok morfológiája normális volt, nekrózis bizonyítéka nélkül. A rózsaszínűre festő kollagént elsősorban az erek adventiciájában és az LDM perimysiumában tapasztalták. Sem a csontváz, sem a szívizomban nem észleltek nehéz intersticiális fibrózis területeit.

Az RNS elemzi a szívét. A patkány felnőtt bal kamrájában az ANF expresszió szintje általában csak a pitvari 29% 2-3% -a; az ANF mRNS fokozott kamrai expressziója azonban az egyik legjobb molekuláris marker a szív hipertrófiájának minden formájához. 30 Annak eldöntésére, hogy a clenbuterollal kezelt patkányok a kamrai tömeg növekedése mellett molekuláris változásokat mutatnak-e a szívizomban, mértük az ANF mRNS szintjét és normalizáltuk 18S RNS-re (3. ábra). Az elemzések azt mutatják, hogy az ANF mRNS szintje háromszor nagyobb a clenbuterollal kezelt állatok kamráiban (0,97 ± 0,24 AU), mint a kontrollokban (0,38 ± 0,17 AU) (P A vizsgálat egyszerűsítése érdekében kifejlesztettünk egy érzékeny és gyors technikát, amely képes megkülönböztetni őket. E protokoll létrehozása során több kritériumnak kellett megfelelni. Ezek közé tartozott (1) két oligonukleotid azonosítása, amelyek egyformán hibridizálódtak mindkét MHC-vel, amelyek azonos hosszúságú és közel azonos szekvenciájú fragmenseket eredményeztek, és (2) egy belső restrikciós hely azonosítása az egyik MHC-szekvenciában, amely felhasználható az két izoform. Egy ilyen szekvenciát és egy restrikciós helyet azonosítottunk.

In vitro kísérletek

A következő kérdés az volt, hogy a szív hipertrófia oka lehet-e a clenbuterol közvetlen hatásainak. Ennek a lehetőségnek a tesztelésére az újszülött kardiociták rendszerét alkalmaztuk a tenyészetben, és mértük az ANF expressziót.

A kultúrában lévő kardiociták fényképét a 6. ábra mutatja. Egy nem szelektív adrenerg agonista, norepinefrin vagy β-szelektív adrenerg agonista, izoproterenol hozzáadása gyorsan megváltoztatta a kardiociták morfológiáját (6B. És 6C. Ábra), hasonlóan a korábban leírtakhoz. 4 33 34 Ezeket a változásokat a szomszédos myocyták közötti hosszú citoplazmatikus vetületek és a gyors verés jellemzi. Csak a noradrenalinnal kezelt sejtek hipertrofálódtak. Ezek a változások azonban nem nyilvánvalóak a kizárólag aszkorbáttal kezelt sejtekben. Valójában ezek a sejtek nyugalmi állapotban voltak. A β2-szelektív agonista clenbuterol 3 napos hozzáadása a tenyésztett sejtekhez nem eredményezett figyelemre méltó hatást a morfológiára, és úgy tűnt, hogy a sejtek nem vertek másképp, mint a kizárólag aszkorbáttal kezeltek. Az újszülött kardiocitákból izolált teljes RNS elemzése azt mutatta, hogy a 18S RNS-re normalizált ANF expresszió csak a norepinefrin (0,52 ± 0,21 AU) beadása után nőtt az aszkorbáttal kezelt sejtekhez (0,24 ± 0,07 AU) képest. Izoproterenol (0,29 ± 0,19 AU) vagy clenbuterol (0,29 ± 0,27 AU) esetén nem tapasztaltak jelentős változást az ANF expressziójában.

Vita

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a clenbuterol a hipertrófia specifikus mintázatát indukálja patkánycsíkos izmokban, az LDM jelentős hipertrófiájával, 20-30% nagyságrendben. Ez az anabolikus hatás a testzsírtartalom csökkenésével jár, összhangban a korábbi vizsgálatokban leírt szétosztási tulajdonságokkal. 11 12 13

Az anabolikus szteroidokat kísérletileg alkalmazták az izomtömeg-veszteség kompenzálására, bár általában úgy tűnik, hogy az ezen szerek által kiváltott bármilyen hipertrófia nem jelenti az erő növekedését. 35 36 Ennek oka lehet az mineralokortikoid hatás, amely pusztán a megnövekedett víz- és sóvisszatartás miatt okoz hipertrófiát, anélkül, hogy a kontraktilis elemek jelentősen felemelnének. Az anabolikus szteroidok további korlátozása nemi sajátosságuk és fontos mellékhatásaik. Egy másik potenciális szer a klenbuterol, amely az adrenalin szintetikus analógja, nem pedig szteroid, így hiányzik a nemi specifitás, és ismert, hogy a vázizom hipertrófiáját szelektíven kiváltja különféle állatfajokban, minimális reklámhatásokkal. 11 12 A válasz hiperplázia nélküli valódi hipertrófia, és átmenetet eredményez a gyors rángatózó (és így nagyobb csúcsfeszültségű) rostok felé. 37 Ezenfelül kimutatták, hogy a clenbuterol gátolja és visszafordítja a denervation-, 38 39 disuse-, 40 endotoxemia-, 41 és cachexiával kapcsolatos 42 vázizom atrófiát.

Vizsgálatunk az intakt, nem transzformált LDM jelentős hipertrófiáját mutatta ki patkányokban, és fontos megállapítás, tekintettel a klenbuterol reakciókészségének ismert széles variabilitására, amelyet ugyanazon szervezet különböző vázizmai mutatnak. Ennek a változékonyságnak az oka ismeretlen, de összefüggésbe hozható a különböző vázizomrostok β2-receptor-sűrűségének különbségeivel. Bár a klenbuterol növekedést elősegítő hatását általában úgy gondolják, hogy β2-adrenoreceptor közvetítette, a propranolollal végzett 44 45 46 antagonista vizsgálatok ellentmondásos eredményeket hoztak, és más, még nem azonosított mechanizmusok (pl. Feltételezett β3-receptor bevonásával) is érintettek lehetnek.

Úgy gondoljuk, hogy a tanulmány eredményei fontos klinikai következményekkel járhatnak. Különösen nagy lehet a klenbuterol potenciálisan az elektromosan átalakított LDM-re gyakorolt hatása, amely nagyobb és erősebb fáradtság-ellenálló izomzatot eredményez. Vitatható azonban, hogy a clenbuterol esetleges felhasználása az LDM hipertrófiájának kiváltására kardiomioplasztikán áteső végstádiumú szívelégtelenségben szenvedő betegeknél korlátozott lenne, ha egyidejű kardiális hipertrófia is előfordul. Noha a normális patkány szívében a clenbuterol által kiváltott hipertrófia megfigyelése nehezen extrapolálható a kudarcot szenvedő emberi szívre, a fiziológiai hipertrófia molekuláris változásai arra utalnak, hogy egy ilyen válasz nem feltétlenül káros és esetleg előnyös is lehet. További vizsgálatokra van szükség a klenbuterollal megnagyobbodott szív funkcionális jellemzőinek, valamint a gyógyszer akut és krónikus hatásainak megvizsgálására a szívelégtelenség nagyállati modelljeiben.

Bizonyos bizonyítékok vannak arra, hogy az atrófián átesett vázizmok érzékenyebbek a clenbuterol 39-re, és ezért olyan alacsony dózisokra reagálnak, hogy ne eredményezzék a normálisan beidegzett izmok generalizált hipertrófiáját, vagy akármilyen szívhipertrófiát. Ezenkívül Palmer és mtsai 50 patkányokban kimutatták, hogy a fenbufennel (nem szteroid gyulladáscsökkentő szer, amely specifikusan gátolja a prosztaglandin F2a szintézisét) történő kezelés teljesen gátolja a klenbuterol által kiváltott szív hipertrófiáját anélkül, hogy tompítaná a vázizom reakcióját. Koncentráció-válasz vizsgálatra van szükség a vázizom-hipertrófia kiváltásához szükséges dózis azonosítására, egyidejű szív-hipertrófia nélkül.

Összegzésképpen megállapítható, hogy a clenbuterol 20–30% -os LDM hipertrófiát váltott ki patkányban. Ez a szív 18% -tól 20% -ig terjedő hipertrófiájával járt, amely molekuláris szinten fiziológiai hipertrófiának bizonyult, vagyis az ANF mRNS expressziójának több mint háromszoros növekedése a kamrában, anélkül, hogy a kontraktilis fehérje izo átmenne. -mRNS-ek. A clenbuterol hatása az elektromosan transzformált vázizomzatra továbbra sem ismert, és meg kell vizsgálni annak lehetséges szerepének meghatározása érdekében, ha van ilyen, a vázizom asszisztálásában.