A Lactobacillus plantarum LMT1-48 gátlás kíséretében Enterobacter cloacae a diéta okozta elhízott egerek belében

Medytox Gwangkyo K + F Központ, Medytox, Inc., Suwon, Korea.

Cím levelezés: Yeung-Hyen Kim, PhD, Medytox Gwangkyo K + F Központ, Medytox, Inc., 114 Central town-ro, Yeongtong-gu, Suwon-si 16506, Gyeonggi-do, Koreai Köztársaság,

Medytox Gwangkyo K + F Központ, Medytox, Inc., Suwon, Korea.

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízás szorosan kapcsolódik a szív- és érrendszeri betegségekhez, például az arteriosclerosishoz, a magas vérnyomáshoz, a szívbetegségekhez és a 2-es típusú cukorbetegséghez, és genetikai, metabolikus, viselkedési és kulturális tényezők kombinációja okozza. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) fogyasztása kulcsfontosságú, az elhízást okozó tényező, és a HFD hosszú távú elfogyasztása emeli a testzsír növekedését. 1 Az elhízás kezelésére különféle diétás programokat, gyógyszereket és sebészeti eljárásokat fejlesztettek ki. Ezek a megközelítések azonban gyakran biztonsági kérdéseket vetnek fel. Tehát biztonságos és hatékony elhízás elleni terápiák kifejlesztésére van szükség a testtömeg-kezelésben.

Kimutatták, hogy a bél mikrobiota és az elhízás szorosan összefügg egymással. 2 A bél mikrobiota különbözik az elhízott és a sovány emberek között. Tanulmányok kimutatták, hogy elhízott embereknél csökken a Bacteroidetes család, és nő a Firmicutes család, ami arra utal, hogy a bél mikrobiota fontos szerepet játszik a zsíranyagcsere szabályozásában. 3,4 Érdekes, hogy a gram-negatív baktériumok, Enterobacter cloacae törzsek, nemrégiben elhízott egerekben azonosították, és a bélben patogén baktériumnak tekintették, ami elhízást eredményezett. 5.

A probiotikumok a bél mikrobiotájának fontos tagjai, és jótékony hatást fejtenek ki, ideértve a potenciális kórokozó baktériumok szaporodásának gátlását, a bélműködés fokozását, a metabolikus szindrómák csökkentését és az immunrendszer szabályozását. 6–10 Különösen a bél mikrobiota probiotikus kezeléssel történő módosítása elhízásellenes hatásokat mutatott, például csökkentette a testsúlyt, aktiválta a zsíranyagcserét, csökkentette a vércukorszintet és a krónikus szisztémás gyulladást. 11–13 Azonban a probiotikumok elhízásellenes hatásai és antimikrobiális tevékenységei E. kloakák-kiváltott elhízásról nem számoltak be. Ezért ebben a tanulmányban a hosszú távú lenyelés funkcionális hatásait vizsgáltuk Lactobacillus plantarum LMT1-48 in E. kloakák-indukált HFD-vel táplált egerek.

Anyagok és metódusok

Tejsavbaktériumok izolálása hagyományos, koreai erjesztett ételekből és újszülöttek székletmintáiból

A tejsavbaktériumok (LAB) izolálásához hagyományos, koreai erjesztett ételeket választottunk ki, köztük kimchit, dongchimit, jeotgalot és savanyúságot, és székletmintákat gyűjtöttünk újszülöttekről. A mintákat 5 percig turmixgépben őröltük, majd az őrölt leveket steril desztillált vízzel hígítottuk. A mintákat ezután egy bróm-fenol kékkel kiegészített de Man, Rogosa és Sharpe (MRS; Difco Co., MI, USA, USA) agarlemezre terítettük, és 48 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. A telepeket savas (sárga) régiók közül választottuk ki, és 16S rRNS szekvenálással (Macrogen, Inc., Szöul, Korea) azonosítottuk. A szekvenálási adatokat a GENBANK adatkönyvtárának Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) segítségével elemeztük (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

A LAB - k antimikrobiális aktivitásának értékelése E. kloakák

Korong-diffúziós agar módszert alkalmaztunk a LAB antimikrobiális aktivitásának vizsgálatára E. kloakák (a Koreai Típusú Kultúrák Gyűjteményéből, KCTC1685 vagy ATCC 11439). Ebben a vizsgálatban steril papírkorongok (10 mm átmérőjű), amelyek sejtmentes LAB felülúszókat (100 μg) tartalmaznak μL) agarlemezekre helyeztük, amelyeken E. kloakák (106 telepképző egység [CFU]/ml) sejtet helyeztünk el, és a lemezt 12-24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. Ha a LAB-k gátló és baktériumölő hatást fejtenek ki, akkor a papírkorong körül tiszta terület képződik, ahol E. kloakák gátolták a növekedést. Ezt a területet, az úgynevezett gátlási zónát mértük, hogy tetszőleges egységeket számoljunk milliliterenként [AU/ml = (1000/d) × D, ahol D a hígítási tényező és d a minta töltési mennyisége].

Ezután együtt tenyésztési kísérletet végeztek a LAB antimikrobiális aktivitásának értékelésére E. kloakák. Ennek elérése érdekében a LAB-kat MRS táptalajban tenyésztettük 24 órán át 37 ° C-on, majd a tenyészeteket 9425 ° C-on centrifugáltuk. g 10 percig 4 ° C-on. A LAB felülúszók pH-ja 24 óra elteltével 3,95 volt. Így kontrollfeltételként 3,95 pH-értéket használtunk. A különböző koncentrációjú (0%, 5%, 10%, 15% és 20%) LAB-k vagy HCl sejtmentes felülúszóit együtt tenyésztettük. E. kloakák (106 CFU/ml) 3,9 pH-értéken 24 órán át 37 ° C-on. E. kloakák sejtszámot rögzítettünk a LAB-k antimikrobiális aktivitásának értékelésére.

Jellemzői L. plantarum LMT1-48

A L. plantarum LMT1-48 (KCTC bejegyzett azonosítószám: KCTC13024BP; szabadalmi bejegyzési szám: KR101670048B1; GenBank belépési szám: LC131441.1), amelyet a hagyományos, koreai erjesztett élelmiszer kimchiből izoláltunk, a sejtek morfológiáját analitikus, nagy felbontású pásztázással értékeltük. elektronmikroszkópia (Carl Zeiss, Munchen-Hallbergmoos, Németország). A morfológiai elemzés azt mutatta L. plantarum Az LMT1-48 egy rúd alakú, nem mozgó és fakultatív anaerob baktérium (S1. Kiegészítő ábra). A képek a Koreai Alaptudományi Intézetben (KBSI; Kangwon Nemzeti Egyetem, Chuncheon, Korea) készültek.

Ezután a szénhidrát-felhasználási minták és a biokémiai jellemzők L. plantarum Az LMT1-48-at analitikai profilindex (API) 50 CHL kit (bioMérieux, Inc., Marcy L'Etoile, Franciaország) alkalmazásával értékeltük, amely jól bevált módszer a mikroorganizmusok faji szintű kézi azonosítására. A minta előkészítését a gyártó utasításai szerint végeztük. Röviden, L. plantarum Az LMT1-48-at összekevertük a pufferrel, és szuszpenziójában a zavarosságát a McFarland-standard segítségével állítottuk be. A kiigazított L. plantarum LMT1-48 szuszpenziót oltottunk az API 50 CHL készlet minden csíkjára, mielőtt ásványi olajat adtunk volna hozzá. Az oltott L. plantarum Az LMT1-48-at 37 ° C-on inkubáltuk, és a reakciókat 6-12 órás inkubálás után figyeltük meg. L. plantarum Az LMT1-48 gyorsan növekedett d-glükóz, d-fruktóz, d-mannóz, d -ribóz és N-acetil-glükózamin, jelezve, hogy ezek a tápanyagok a fő energiaforrások L. plantarum LMT1-48 (S1 kiegészítő táblázat).

Ezt követően ellenőriztük L. plantarum LMT1-48 - 16S rRNS gén szekvenálás. A minta előkészítésének részleteit az Anyagok és módszerek részben a széklet mikrobiota szakaszának piroszekvenálása tartalmazza. Az izolált L. plantarum Az LMT1-48-at (99,93% azonosság) a legjobban illesztettük L. plantarum ATCC 14917 (GenBank csatlakozási szám: AJ965482).

Állatmodellek

A hím C57BL/6N egereket az OrientBio, Inc.-től (Seongnam-si, Korea) szereztük be. Valamennyi egeret a CHA Egyetem (Seongnam-si, Korea) specifikus kórokozótól mentes létesítményében tartottuk, és 5 hetes korban használtuk fel. Minden állatkísérletet a CHA Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (IACUC160121) által jóváhagyott protokoll szerint hajtottak végre.

Négy különböző kísérleti állat-elhízási modellt terveztünk, és csoportonként legalább öt egeret használtunk. A negatív kontrollcsoport (NCD csoport) egereit normál chow-étrenddel (NCD) etettük (Teklad-tanúsítvánnyal ellátott besugárzott globális 18% -os fehérjetartalmú rágcsáló-étrend, 2918C; Envigo, Egyesült Királyság) 10 hétig. A pozitív kontrollcsoport (HFD csoport) egereit 2 hétig normál chow-étrenddel etették, majd további 8 hétig HFD-vel (étrend okozta elhízás rágcsálóval tisztított étrend 45% energiával a Fat Red-től) ellátták őket. A patogén baktérium által kiváltott elhízás csoportba tartozó egerek esetében (EC [Enterobacter cloacae] csoport), gram-negatív baktériumok E. kloakák törzseket (108 CFU/nap) ugyanolyan körülmények között szolgáltattuk, mint a pozitív kontroll csoportot. Végül az elhízás elleni hatások értékelése, L. plantarum LMT1-48 törzseket (109 CFU/nap) juttattunk az egerekhez E. kloakák-indukált elhízási csoport 10 hétig (LMT1-48 csoport). E. kloakák és L. plantarum Az LMT1-48 törzseket naponta frissen készítették és orálisan adták be. 10 hét elteltével az egereket feláldoztuk, és szérum-, illetve székletmintákat gyűjtöttünk a hormonszintek és a mikrobiómák összetételének elemzése céljából.

Leptin, összkoleszterin és nagy sűrűségű lipoproteinek mérése egér szérumban

A szérum hormonszint elemzéséhez vérrögöt vettünk a farok vena cava alvadék aktivátorral bevont tubus segítségével, majd 2000-ben centrifugáltuk g 15 percig 4 ° C-on. Az összes koleszterin és a nagy sűrűségű lipoprotein (HDL) szintjét a szérum mintákban automatikus hematológiai analizátorral (Beckman coulter, Kalifornia, USA) határoztuk meg. A szérum mintákban a leptin szintjét egér leptin enzimmel kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készlet segítségével határoztuk meg (Abcam, Inc., Cambridge, Egyesült Királyság).

A széklet mikrobiota piroszekvenálása

Minden csoportból (NCD, HFD, EC és LMT1-48) egér székletmintákat gyűjtöttünk. Genom DNS-t extraháltak a székletmintákból, és elemezték a bél mikrobiális közösségét. Az illumina szekvenálást a koreai Szöulban található Macrogen, Inc.-nél (www.macrogen.com) végeztük. Minden szekvenált mintát az Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library protokolljai szerint készítettünk a V3 és V4 régiók amplifikálásához (519F-816R). Az amplifikációhoz használt vonalkódolt fúziós primer szekvenciák a következők voltak: 314F: 5 'CCTACGGGNGGCWGCAG 3', 806R: 5 'GACTACHVGGGTATCTAATCC 3'. Ezután a végső tisztított terméket kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval (qPCR) számszerűsítettük a qPCR Quantification Protocol Guide (KAPA Library Quantification kit for Illumina Sequencing platformok, San Diego, CA, USA) szerint, és LabChip GX HT DNS alkalmazásával minősítettük Nagy érzékenységű készlet (PerkinElmer, MA, USA). Ezután a páros végű (2 × 300 bp) szekvenálást Macrogen végezte a MiSeq ™ platform segítségével (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA), a szokásos protokollok szerint. Az adatok elemzéséhez a párosított végű szekvenciákat a FLASH szoftver segítségével egyesítették (v.1.2.11). 15 Kiváló minőségű szekvenciákat előzetesen feldolgoztunk és klaszterezettünk CD-HIT-OUT szoftverrel. 16 A mikrobiota közösség sokféleségének és taxonómiájának elemzését QIIME szoftverrel végeztük (v.1.8.0). 17.

Mikrokomputertomográfiai elemzés

Minden csoportból öt reprezentatív egér testtömegét mikro-képalkotó rendszerrel (NFR Polaris G90; NanoFocusRay Co. Ltd., Suwon-si, Korea) elemeztük. A háromdimenziós (3D) képeket 3D elemző szoftver segítségével rekonstruáltuk (Amira5.4.1, Visage Imaging GmbH, Németország). A hasi szubkután és zsigeri zsírszövetekre a csigolya szintjén zsírszöveti régiókat rajzoltak (L2 – L3 régió).

Statisztikai analízis

Az összes kísérlet adatait a Prism szoftver (Prism, 7. verzió; GraphPad szoftver, San Diego, CA, USA) segítségével elemeztük. Párosítatlan diák t-tesztet használtunk a kísérleti csoportok összehasonlítására; P értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha *P

ÁBRA. 1. A LAB-k antimikrobiális aktivitása az elhízást kiváltó baktériumok ellen. (A) A LAB antimikrobiális aktivitásának meghatározására használt szűrési módszer sematikus ábrázolása. (B) A legnagyobb antimikrobiális aktivitást mutató LAB törzs kiválasztásához a LAB törzsek aktivitását korongdiffúziós agar módszerrel értékeltük, az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. Az LMT1-30, LMT1-48 és LMT2-46 törzsek által termelt gátlási zónákat összehasonlítottuk. (C) A LAB-k antimikrobiális aktivitásának értékeléséhez a kiválasztott LAB-okból származó sejtmentes felülúszókat Enterobacter cloacae az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. E. kloakák összehasonlítottuk a különböző LAB-kokultúrákban kapott kolóniaképző egységek számát. A görbe alatti területet használtuk a LAB antimikrobiális hatásainak további értékelésére. A hibasávok az átlag ± SEM értéket képviselik. *P

1. táblázat: A kiválasztott tejsavbaktériumok antimikrobiális aktivitása az elhízást kiváltó Enterobacter cloacae Baktériumok

Ezután megvizsgáltuk, hogy a LAB antimikrobiális aktivitása savas pH-változásoknak vagy metabolitjaik felülúszóban kifejtett hatásának köszönhető-e. A LAB felülúszók pH-ja 24 óra tenyésztés után 3,95 volt. Ezért teszteltük a LAB antimikrobiális aktivitását E. kloakák együttes tenyésztéssel fix körülmények között, 3,95 pH mellett. Különböző koncentrációjú (0%, 5%, 10%, 15% és 20%) LAB vagy HCl sejtmentes felülúszókat együtt tenyésztettünk E. kloakák 24 órán át. Száma E. kloakák A CFU drámaian csökkent a három kiválasztott LAB jelenlétében, összehasonlítva a kontroll HCl csoportban (1C. Ábra, bal panel). A görbe alatti területet (AUC) kiszámítottuk, hogy összehasonlítsuk a LAB antimikrobiális aktivitását a HCl felülúszó kontrollcsoportéval. A legmagasabb antimikrobiális aktivitás a E. kloakák megfigyelték a L. plantarum LMT1-48 csoport (1C ábra, jobb oldali panel).

A L. plantarum LMT1-48 in E. kloakák-indukált HFD-vel táplált egerek

Az antihízás elleni hatások felmérése L. plantarum LMT1-48 be E. kloakák-okozta elhízás, négy különböző táplálkozási körülményt terveztünk meg, amint azt a 2A. ábra mutatja. A HFD hosszú távú táplálása nagyobb testtömeget okozott a HFD-vel táplált egerekben (34,6 ± 0,5 g), mint az NCD-vel táplált egerekben (25,7 ± 0,5 g). A E. kloakák a HFD csoportba tartozó egereknél a testtömeg enyhe növekedését okozta a csak HFD-csoporttal összehasonlítva, míg a L. plantarum Az LMT1-48 jelentősen csökkentette a testtömeget (36,0 ± 1,2 g az EC csoportban és 29,4 ± 0,9 g az LMT1-48 csoportban, 2B. Ábra). Ezért a következő lépésben mikroszámítógépes tomográfia (CT) pásztázógéppel mértük a zsírtérfogatot a hasi zsírmennyiség változásának értékelésére az étrend okozta elhízott egereknél. Az adminisztráció L. plantarum Az LMT1-48 drámai módon csökkent a hasi zsír mennyiségében E. kloakák-indukált HFD-vel táplált egerek (2C. ábra). A 2D. Ábrán reprezentatív pozitronemissziós tomográfia/CT kép látható, hasi zsír barna színnel ábrázolva.

ÁBRA. 2. A Lactobacillus plantarum LMT1-48 in E. kloakák-elhízott egerek. (A) Az alkalmazott kísérleti elhízott állatmodellek sematikus ábrázolása az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. (IDŐSZÁMÍTÁSUNK ELŐTT) Testsúly (B) és a zsírmennyiség (C) mértük, hogy értékeljük az Lactobacillus plantarum LMT1-48 adminisztráció. n = 5 egér csoportonként. (D) A hasi zsírszakasz reprezentatív mikrokomputertomográfiai képe (L2 – L3 régió). A hasi zsírt barna színnel ábrázolják. A hibasávok az átlag ± SEM értéket képviselik. *P

Tanulmányok kimutatták, hogy a HFD fogyasztása növeli a leptin és a TC szintjét a plazmában. 18–20 Ezért ezeket a paramétereket értékeltük modelljeinkben. A L. plantarum Az LMT1-48 jelentősen csökkentette a leptin és a TC szintjét a plazmában (3A., B ábra). A HDL szintek növekedtek az NCD csoportban mért értékekhez képest, de összehasonlíthatók voltak a HFD és EC csoportokéval (3C. Ábra). Ezért ezek az adatok azt jelzik, hogy a L. plantarum Az LMT1-48 antihízás hatást váltott ki, amely a leptin és a TC szintjének csökkenésével járt együtt E. kloakák-indukált HFD-vel táplált egerek.

ÁBRA. 3. Az adipokinek és a lipidek szérumszintje. Funkcionális hatásai L. plantarum LMT1-48 kezelés in E. kloakák-elhízott egerek. A leptin hormon szérumszintje (A), az összes koleszterinszint (B), és nagy sűrűségű lipoprotein (C) ELISA-val mértük. Szérummintákat gyűjtöttünk a különböző kísérleti csoportokból, az 1. ábra szerint. n = 5 egér csoportonként. A hibasávok az átlag ± SEM értéket képviselik. *P

L. plantarum Az LMT1-48 befolyásolja a bél mikrobiota sokféleségét

Megvizsgáltuk, hogy a L. plantarum Az LMT1-48 befolyásolta a bél mikrobiota sokféleségét E. kloakák-indukált HFD-vel táplált egerek. A székletmintákból származó bél mikrobiota sokféleség nagyobb volt az LMT1-48 csoportban, mint más csoportokban (4. ábra). Különösen a menekültügyi szinten, Verrucomicrobia és Proteobaktériumok drámaian megnőttek az LMT1-48 csoportban (1,62% és 2,75%) az EC csoporthoz képest (0% és 0,29%) (4. ábra). Ezért a L. plantarum Az LMT1-48 segíthet a bél mikrobiota sokféleségének előmozdításában, ami az elhízás enyhülését eredményezi E. kloakák-indukált HFD-vel táplált egerek.

ÁBRA. 4. A mikrobiota közösség modulációja L. plantarum LMT1-48. A székletben a bakteriális phyla relatív bőségét 16S rRNS piroszekvenálással mértük, az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. *A Akkermansia nemzetség, amely a törzs legtöbbet képviselt nemzetsége Verrucomicrobia. # Proteobaktériumok. A színes képek online elérhetők.

Vita

Tanulmányok azt is bizonyítják, hogy a rövid láncú zsírsavakat (SCFA) termelő probiotikumok elhízásgátló tulajdonságokat mutatnak a lipid- és glükóz-anyagcsere szabályozásával, 29–31 az adipocita méretének csökkentésével, 32 a koleszterinszint csökkentésével és a leptin szintjének szabályozásával. 33 Amint ez a tanulmány mutatja, L. plantarum Az LMT1-48 antimikrobiális tulajdonságokat mutatott E. kloakák, amelyek különféle összetevőkből származhatnak, például az SCFA által szekretálva L. plantarum LMT1-48, nem pedig a baktériumok növekedése által kiváltott egyszerű pH-változások. Azonban további vizsgálatokra van szükség az SCFA által termelt SCFA hatékonyságának értékeléséhez L. plantarum LMT1-48 étrend okozta elhízott egerekben.

Összefoglalva, ez az első jelentés, amely bemutatja az L. plantarum LMT1-48 be E. kloakák-indukált HFD-vel táplált egerek. Bár további vizsgálatokra van szükség az emberi testzsír-szabályozás klinikai funkciójának a L. plantarum LMT1-48, ezek a baktériumok jó jelölteket jelentenek a funkcionális egészséges élelmiszerekhez vagy az elhízás új terápiás szereként.