A leptin terhes egereknek nemi specifikus hatása a placentára és az utódok metabolikus fenotípusaira

Fiziológiai genetika laboratóriuma, Citológiai és Genetikai Intézet, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai kirendeltsége, Novoszibirszk, Oroszország

Levelezés

E. I. Denisova, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai fióktelepének Fiziológiai Genetikai Laboratóriuma, Prospekt Lavrentyeva 10, Novoszibirszk, 630090, Oroszország

Fax: +7 383 333 12 78

Tel .: +7 383 363 49 63

Fiziológiai genetika laboratóriuma, Citológiai és Genetikai Intézet, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai kirendeltsége, Novoszibirszk, Oroszország

Fiziológiai genetika laboratóriuma, Citológiai és Genetikai Intézet, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai kirendeltsége, Novoszibirszk, Oroszország

Fiziológiai Tanszék, Novoszibirszki Állami Egyetem, Novoszibirszk, Oroszország

Fiziológiai genetika laboratóriuma, Citológiai és Genetikai Intézet, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai kirendeltsége, Novoszibirszk, Oroszország

Fiziológiai genetika laboratóriuma, Citológiai és Genetikai Intézet, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai kirendeltsége, Novoszibirszk, Oroszország

Levelezés

E. I. Denisova, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai fióktelepének Fiziológiai Genetikai Laboratóriuma, Prospekt Lavrentyeva 10, Novoszibirszk, 630090, Oroszország

Fax: +7 383 333 12 78

Tel .: +7 383 363 49 63

Fiziológiai genetika laboratóriuma, Citológiai és Genetikai Intézet, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai kirendeltsége, Novoszibirszk, Oroszország

Fiziológiai genetika laboratóriuma, Citológiai és Genetikai Intézet, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai kirendeltsége, Novoszibirszk, Oroszország

Fiziológiai Tanszék, Novoszibirszki Állami Egyetem, Novoszibirszk, Oroszország

Fiziológiai genetika laboratóriuma, Citológiai és Genetikai Intézet, az Orosz Tudományos Akadémia szibériai kirendeltsége, Novoszibirszk, Oroszország

Absztrakt

Rövidítések

Az „egészség és betegség fejlődési eredete” paradigma szerint az egyén egészsége az intrauterin és a korai posztnatális állapotoktól függ [1]. Kimutatták, hogy a terhesség alatti elhízás növeli az anyagcsere-betegségek kockázatát az utódokban [2]. Az azonban továbbra sem ismert, hogy az anyai közeg milyen tényezői okoznak változásokat az utódok fenotípusaiban és azokban a mechanizmusokban, amelyek közvetítik e tényezők hosszú távú hatásait.

Az adipocita hormon leptin kulcsszerepet játszik az energia homeosztázis szabályozásában [3], és a keringő leptin szintje arányos a test zsírtömegével [4]. Jelentős számú tanulmány kimutatta, hogy a leptin részt vesz a fejlesztési programozásban [5-8]. Az utódok elhízása ellen védőhatást észleltek, amikor a leptint a vemhesség ideje alatt vagy a vemhesség második felében adták patkányoknak és egereknek standard étrenden [5, 7, 9, 10]. A leptin korai terhesség és terhesség közepén történő beadása korlátozott táplálékkal rendelkező egerekben azonban kimutatta, hogy növeli a nőstény utódok hajlandóságát az étrend okozta elhízás (DIO) kialakulására [11]. A leptin programozási hatásai valószínűleg a beadás időpontjától, az anyai tápanyag viszonyoktól és az utódok nemétől függenek.

A leptin befolyásolhatja a magzat fejlődését a placenta funkcióira gyakorolt ​​hatása révén [12]. A méhlepény tápanyagokkal és növekedési faktorokkal látja el a magzatokat, ezáltal meghatározva a magzat növekedési ütemét és az utódok születési súlyát [13, 14]. Viszont a születési súly megjósolja az egyén jövőbeli egészségét. Emberekben a túl alacsony vagy túl magas születési súly a 2-es típusú cukorbetegség és az elhízás fokozott kockázatával jár [15, 16]. Egerekben szexuális dimorfizmust figyeltek meg a terhesség alatti elhízásra adott placenta válasz esetén [17, 18]. Ez arra utal, hogy egyes, az elhízással összefüggő anyai tényezők (köztük az emelkedett leptinszint) eltérő módon befolyásolhatják a hím és női magzatok placentájának funkcióit. Nem ismert, hogy az anyai leptin befolyásolja-e a magzat növekedési sebességét, a tápanyag-transzporterek és a növekedési faktorok expresszióját a placentában terhesség közepén, és hogy a placenta válasza a leptin működésére nem-specifikus-e.

Jelen tanulmány célja az volt, hogy megvizsgálja a leptin egereknek a terhesség közepén történő alkalmazásának az utódok metabolikus fenotípusaira, a magzat súlyára és a placentában lévő gének expressziójára gyakorolt ​​hatását az utód neme szerint. Megállapítottuk, hogy a terhes egereknek a leptin beadása különböző módon befolyásolta a hím és nőstény utódok egyes fenotípusos tulajdonságait, és ez a hatás ideiglenes magzati növekedési korlátozással és nemi specifikus placenta reakcióval társult a leptin injekciókra. Javasoljuk, hogy a terhesség közepén alkalmazott leptin nemspecifikus programozási hatása összefüggésbe kerülhessen a férfi és a női magzatok placentájára gyakorolt ​​különböző hatásokkal.

Mód

Etikai jóváhagyás

Valamennyi kísérletet a Laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató (1996) és a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó orosz nemzeti utasítások szerint hajtották végre. A jegyzőkönyveket a Citológiai és Genetikai Intézet (Orosz Tudományos Akadémia szibériai osztálya) Független Etikai Bizottsága hagyta jóvá.

Fogyókúrák

A szokásos chow étrendet pellet formában szállították, és az Assortiment Agro-tól (Moszkva régió, Turacovo, Oroszország) vásárolta meg. Az obezogén ételek édes vajas kekszet, zsír- és napraforgómagot tartalmaztak. Az állatok a standard chow mellett obesogén táplálékot kaptak. Az állatok minden egyes táplálékból felesleges mennyiséget kaptak, beleértve a chow-t is, úgy, hogy bevitték ad libitum.

Állatok

A C57BL/6J egereket a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, ME, USA) vásároltuk, majd a Citológiai és Genetikai Intézet viváriumában tenyésztettük. Az egereket 12: 12-órás világos-sötét (7 óra 30 perc – 19 óra 30 perc világos) körülmények között, 22 ° C környezeti hőmérsékleten tartottuk. Az egereket biztosítottuk ad libitum hozzáférés a kereskedelmi egér chow-hoz és vízhez.

A nőstényeket 10–14 hetes korukban pározták a hímekkel, és egyedileg helyezték el őket attól a naptól kezdve, amikor a kopulációs dugót kimutatták (0. terhességi nap, GD0). A nőstények GD12-en szubkután injekciókat kaptak rekombináns egér leptinből (4,0 µg · g –1 BW) sóoldatban 500 µg · ml – 1 végkoncentrációban oldva, vagy 9 óra 00 perc múlva sóoldattal (kontroll) injektálták őket. Korábbi kutatásaink szerint az ebben a dózisban egereknek a késői terhességben beadott leptin nem befolyásolta az utódok életképességét, de ez a beadás befolyásolta az utódok fenotípusát [5]. A leptin- és sóoldattal kezelt egereket három kísérleti csoportra osztottuk.

Az egyik csoportban 14 leptinnel kezelt és 17 sóoldattal kezelt nőst mértek az injekció előtt és 24 órával az injekció után, és gyors lefejezéssel feláldozták őket. Törzsi vérükből mintákat gyűjtöttek, magzatukat és placentájukat lemérték. A magzati májmintákat összegyűjtöttük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk a későbbi nemi meghatározás céljából.

A második csoportban kilenc leptinnel kezelt és kilenc sóoldattal kezelt egeret áldoztak le 7 órával a leptin injekció után, és minden placenta és magzati máj mintáját folyékony nitrogénben lefagyasztották. A magzatok nemének kimutatásakor hat leptinnel kezelt és hat sóoldattal kezelt anya placentáját választották ki a placenta gén expressziójának vizsgálatára. A kiválasztott gátaknak hét-kilenc és két vagy több magzata volt mindkét nemből. Az alom legkönnyebb és legnehezebb placentáját kizártuk a génexpresszió elemzéséből, mivel a placenta mérete kimutatta, hogy befolyásolja a glükóz és aminosavak transzportereit kódoló gének expresszióját [19] .

A harmadik csoportot a leptin beadásának az utód fenotípusokra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára használtuk. Születéskor kilenc leptinnel kezelt és hét sóoldattal kezelt nősténytől született kölyköket lemértek, és a több mint hét kölyköt tartalmazó almokat hét kölyökre csökkentették. A kölyök testtömegét (BW) a szülés utáni 1., 7., 14., 21. és 28. napon mértük. A szülés utáni 28. napon minden alomból két hímet és két nőstényt elválasztottak anyjuktól, és egyedileg helyezték el őket, és a testtömegüket és a táplálékfelvételt (FI) hetente egyszer, 16 hetes korukig mérték. Ebben az időszakban az összes állatot standard chow-étrenddel etették ad libitum. 16 hetes korától kezdve minden alom egy hím és egy nősténye folytatta a szokásos étrendet, egy hím és egy nőstény pedig a szokásos chow mellett kekszet, sertészsír- és napraforgómagot is kapott. Ez a keverék utánozza a cafeteria étrendet, és erősíti az elhízás gyors fejlődését egerekben [5]. Az egér BW-ket hetente egyszer mértük 8 hét alatt. Az obesogén ételek fogyasztását nem mértük. A kísérlet végén az állatokat lefejezéssel leöltük, vérmintákat gyűjtöttünk és megmértük a hasi zsírpárnák súlyát.

Anyagok

Az egér rekombináns leptint a PeproTech-től (Princeton, NJ, USA) szereztük be.

Plazma vizsgálatok

A leptin koncentrációit kereskedelmi készletekkel mértük (leptin: R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, intra-assay: 3,8–4,3%; interassay: 3,8–5%). A plazma glükózkoncentrációkat kereskedelmi készlet segítségével mértük (Fluitest GLU; Analyticon Biotechnologies, AG 35104, Lichtenfels, Németország).

Relatív kvantitatív valós idejű PCR

A magzati nem meghatározása

A magzatok nemét genomi DNS PCR alkalmazásával határoztuk meg a következő primerekkel: SX_F, 5′-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3 '; SX_R, 5′-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA ‐ 3 ′ [20]. Aljanabi és Martinez ([21]) [19] szerint a magzati májból DNS-t extraháltak sóoldattal. A nemet a magzatok körülbelül 85% -ában határozták meg.

Statisztikai analízis

Eredmények

A leptin gátakra történő beadásának hatása a GD12-re a gátak, magzatuk és placentáik súlyára

A leptin hatása a gátakra, azok magzatára és placentájára az injekció után eltelt időtől függ. A leptinnel és sóoldattal kezelt gátak nem különböztek a testtömeg-változásukban (−1,2 ± 0,3%, n = 9; –1,1 ± 0,4%, n = 9; sóoldat, illetve leptin), de az injekció beadása után 7 órán belül különböznek magzatuk súlyától. A sóoldat beadásának eredményeihez képest a leptin beadása a férfi magzatok súlyának arányos csökkenését eredményezte (P

vemhes

Sóoldat Leptin P (Hallgatói t-teszt)
Női BW növekedés (a kezdeti%) 4,7 ± 0,7 (17) 2,0 ± 0,08 (14) 0,02
Alom méret 6,8 ± 0,3 (17) 6,9 ± 0,5 (14) NS
A leptin plazmakoncentrációi (ng · ml −1) 6,3 ± 1,3 (8) 10,1 ± 2,2 (7) NS
Plazma glükózkoncentráció (m m) 7,2 ± 0,4 (8) 7,5 ± 0,4 (7) NS

A leptin gátakra gyakorolt ​​hatása a GD12-re az utódok metabolikus fenotípusaira

Utóda BW elválasztás előtt, FI és BW pedig elválasztás után

A leptin adása gátaknak a GD12-en nem befolyásolta a magzat életképességét vagy súlyát a vemhesség végén: az újszülött kölykök száma és súlya megegyezett a leptinnel és sóoldattal kezelt anyákban (1. táblázat, 2. ábra).

A leptin beadása csökkentette a kölyök növekedési sebességét a szülés utáni 7. napról 28. napra, és szignifikánsan csökkentette a női és a hím utódok BW-jét elválasztás előtt (2. és 3. ábra).

Az elválasztás után a leptinnel kezelt gátak utódai növekedési hullámot mutattak, amely lehetővé tette számukra a felzárkózást (3. ábra). Az elválasztást követő első 2 hét során a leptinnel kezelt anyaállatok hím utódai, de nem a nőstény utódok, szignifikánsan nagyobb súlygyarapodást értek el, mint a kontrolldámáké [5,66 ± 0,38 g (n = 12) és 7,31 ± 0,28 g (n = 17), P

Az utódok válasza az obesogén étrendre

Az obesogén étrend elhízás kialakulását váltotta ki férfiaknál és nőknél egyaránt (P

A leptin beadásának hatása a placenta génexpressziójára

A férfi és női magzatok placentájában található génexpresszió összehasonlítása feltárta az SNAT2 aminosav transzporterek mRNS-szintjének nemtől függő különbségeit (P

Vita

Ebben a tanulmányban azt a feltételezést teszteltük, hogy a terhesség közepén az egereknek beadott leptin programozási hatása az utód nemétől függ. Ezenkívül azt javasoltuk, hogy a férfi és a női magzatok placentájának funkcionális válaszaiban mutatkozó bármilyen különbség megalapozhatja a leptin nemtől függő programozási tevékenységét. Egyszer injektáltunk leptint a GD12-re, és értékeltük a placenta és a magzatok akut válaszát erre az injekcióra, valamint az alkalmazás hosszú távú hatásait a hím és nőstény utódok metabolikus fenotípusára. Noha a leptin egyetlen injekciója nem utánozza az elhízásra jellemző leptinszintet, ez a modell lehetővé teszi számunkra, hogy felmérjük, hogy a fejlődés 12. napján a magzatok érzékenyek-e az anyai leptin hatására, és feltárjuk-e a magzatok akut válaszát és placenta. Megállapítottuk, hogy a nőstény egerek vérében a leptinszint átmeneti növekedése GD12-nél hatással van az utódok fenotípusára, és egyes fenotípusos tulajdonságokra gyakorolt ​​hatás az utódok nemétől függ.

Megállapítottuk, hogy a terhesség közepén a prenatális leptin-expozíció nem akadályozta meg a DIO kialakulását, de eltörölte a hiperglikémiát mindkét nem elhízott állatában. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a terhesség alatti hiperleptinaemia javította a DB/+ nőstény egerek utódainak glükóz metabolizmusát [8]. Eredményeink összhangban vannak ezzel a megállapítással, és arra engednek következtetni, hogy a 12. és 13. terhességi nap közötti specifikus időszak kritikus fontosságú az egér utódaiban a glükóz homeosztázisos rendszerek kialakulásához. Egerekben a hipotalamusz leptinnel aktivált idegsejtjeinek szaporodási csúcsa, amelyek szabályozzák az energiaegyensúlyt és a glükóz homeosztázist, a 12. napon következik be [22, 23]. Kimutatták, hogy a leptin elősegíti a hipotalamusz idegi progenitor sejtjeinek migrációját és differenciálódását [24]. Az Ob-Rb leptin-receptort az egér magzati agyában a postcoitalis 10,5 naptól kezdve találtuk [25]. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a hipotalamusz idegsejtjeinek megnövekedett leptinszintje közvetlenül befolyásolhatja az energiaegyensúlyt és a glükóz homeosztázist szabályozó idegsejtek kialakulását.

Korábbi eredményeink szerint [5] a hím utódok a szülés előtti leptin expozícióval szemben nagyobb érzékenységet mutattak, mint a nőstény utódok érzékenysége: a leptinnel kezelt anyáktól született hímek 6 hetes korukban súlyosabbak lettek, mint a kontroll hímek. felgyorsult növekedési ütem az elválasztás után. A nőstény egereknek a terhesség végén történő beadása azonban ellenkező hatást váltott ki: csökkentette a hím utódok táplálékfelvételét és a testtömegét is [5]. A terhesség alatt a hyperleptinaemia csökkentette az egerek utódainak BW-jét is [5, 7]. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a leptin programozási tevékenység nagymértékben függ az embrió fejlődésének szakaszától.

A leptin beadásának a magzatok növekedésére gyakorolt ​​hatását valószínűleg a placenta funkcióira gyakorolt ​​hatása közvetíti. A genetikai modellben korábban azt tapasztaltuk, hogy az A y egerekben a megnövekedett leptinszint együtt jár a magzatok és a placenta súlyának csökkenésével is [34] .

Érdekes módon az A y egerekben a megnövekedett leptinszint az alacsonyabb expresszióval is összefüggésbe hozható Slc2a1 csak női magzatok placentájában [34]. Eredményeink együttvéve azt mutatják, hogy a terhesség közepén a nemi egerekben a vér leptinszintjének emelkedése specifikusan gátolja a GLUT1-et kódoló gén expresszióját a placentában. A GLUT1 a placenta leggyakoribb glükóztranszportere, és szabályozza a placenta glükózfelvételét és a transzplacentális glükóz transzfert a magzatba [39]. A leptin által kiváltott gátlás hatása Slc2a1 a placenta metabolizmusán és a transzplacentáris glükóztranszferen történő expresszió lehet a növekedési retardáció oka a női magzatokban. Bár a leptin fontos szerepet játszik a placenta fiziológiájában [40], mindeddig nincs bizonyíték arra, hogy a leptin befolyásolná a Slc2a1 gén a méhlepényben. A leptin hatása a Slc2a1 a placentában található gént valószínűleg néhány metabolikus jel közvetíti, amelyeket a gátak generálnak a leptin beadására válaszul.

A leptin beadása gátolta a magzat növekedését anélkül, hogy befolyásolta volna a placenta gén expresszióját Igf1 és Igf2, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a magzat növekedését és a placenta morfogenezisét, a szubsztrát transzportját és a hormon szekrécióját [41]. A hím magzatok és placentáik súlyának arányos csökkenése a leptin beadása után arra utal, hogy a placenta fizikai méretének csökkenése a leptin okozta növekedési retardáció egyik fő oka lehet a hím magzatokban. Az exogén leptin különböző hatásait az egér placenta súlyára a terhesség stádiumától és az anyai étrendtől függően mutatták ki: a leptin csökkent terhesség végi egerekben a normál étrendben lévő egerek magzati és placenta súlyát [32], a táplálékkal korlátozott egerekben pedig megnövekedett placenta a terhesség korai szakaszában [42]. Eredményeink egyetértenek Yamashita megfigyelésével et al., bár az anyai vér rövid távú leptin-növekedésének a placenta súlyára gyakorolt ​​hatásának mechanizmusai nem tisztázottak.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetünket szeretnénk kifejezni Alekszandr Dzjubenkónak a cikk grafikai absztraktjának elkészítésében nyújtott segítségért. A tanulmányt az Orosz Alapkutatási Alapítvány (17-04-01357-a projekt) és a 0259-2019-0002 költségvetési projekt támogatta.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.