A placenta D-vitamin metabolizmusa és összefüggései a keringő D-vitamin metabolitokkal terhes nőknél
Heyjun Park, Madeleine R Wood, Olga V Malysheva, Sara Jones, Saurabh Mehta, Patsy M Brannon, Marie A Caudill, Placenta D-vitamin anyagcsere és társulásai a keringő D-vitamin metabolitokkal terhes nőknél, The American Journal of Clinical Nutrition, 106. évfolyam, 2017. december 6., 1439–1448. Oldal, https://doi.org/10.3945/ajcn.117.153429
ABSZTRAKT
Háttér: Kevéssé ismert a placenta D-vitamin-anyagcseréje és annak hatása az anyában keringő D-vitamin-koncentrációkra az emberekben.
Célkitűzés: Ez a tanulmány a placenta D-vitamin anyagcseréjének jelenlegi megértését és annak szerepét kívánta elősegíteni az anyai keringő D-vitamin metabolitok terhesség alatt.
Tervezés: A táplálkozási vizsgálat során 24 egészséges terhes nő (26–29 hét vemhesség) egyetlen héten keresztül elfogyasztott egyetlen mennyiségű D-vitamint (511 NE/nap diétából és egy kolekalciferol-kiegészítő). Meghatároztuk a placenta és a vér D-vitamin metabolitjainak koncentrációját és a placenta messenger RNS (mRNS) D-vitamin metabolikus út komponenseinek bőségét. Ezenkívül a tenyésztett humán trofoblasztokat 13 C-kolekalciferollal inkubáltuk, hogy megvizsgáljuk a D-vitamin metabolitok intracelluláris képződését és szekrécióját, valamint a célgének szabályozását.
Eredmények: A placenta szövetében a 25-hidroxi-D3-vitamin [25 (OH) D3] szorosan korrelált (r = 0,83, P
BEVEZETÉS
Az emberi terhesség alatt jelentős változásokat figyeltek meg a D-vitamin metabolitok és a kapcsolódó fehérjék keringő koncentrációiban. Például kimutatták, hogy az 1,25-dihidroxi-D3-vitamin [1,25 (OH) 2D3], egy bioaktív D-vitamin-metabolit és a D-vitamint kötő fehérje (DBP), a keringő D-vitamin-metabolitok hordozója, keringő koncentrációja a terhesség alatt 1,5–2,0-szeresére nő (1–4). Hasonlóképpen a 25-hidroxi-D3-vitamin [25 (OH) D3] (2, 5–7), a D-vitamin fő formájának növekedése a vérben, valamint a 25 (OH) D3 C3-epimer [3-epi-25 (OH) D3] (7–9) is megfigyeltek néhány tanulmányban. Ennek ellenére a keringő D-vitamin metabolitjainak ezen terhesség okozta változásainak mögöttes mechanizmusai nagyrészt ismeretlenek.
A placenta D-vitamin-anyagcseréjének és annak az anyánál keringő D-vitamin-koncentráció emberekben való jelenlegi megértésének elősegítése érdekében ez a tanulmány megvizsgálta a placentaszövet D-vitamin-metabolizmusának biomarkereinek összefüggéseit a hosszú távon részt vevő terhes nők által nyert anyai vérrel. ellenőrzött etetési vizsgálat. Megvizsgálták a placenta D-vitamin metabolitjainak a D-vitamint metabolizáló gének placenta expressziójával való összefüggését is. Ezenkívül humán placenta sejttenyésztési modellt használtak a 13 C-jelölt kolekalciferol placentafelvételének és metabolikus sorsának, valamint a kolekalciferolnak a cél gén transzkriptumra gyakorolt hatásának feltárására.
MÓD
Emberi táplálkozási vizsgálat
Tanulmányterv, résztvevők és mintagyűjtés
A vér és a placenta D-vitamin metabolitjának mérése
Meghatároztuk a szérum 25 (OH) D3, a szérum 3-epi-25 (OH) D3 és a plazma 24,25 (OH) 2D3 mennyiségét egy stabil izotóppal hígított folyadékkromatográfia – tandem tömegspektrometria (LC-MS/MS) alkalmazásával. módszertan, amelyet részben a korábban leírt D-vitamin külső minőségértékelési rendszerben való részvétel révén validáltak (7). A plazma 1,25 (OH) 2D3 (immundiagnosztikai rendszerek) és a DBP (R&D rendszerek) koncentrációit ELISA kitek alkalmazásával számszerűsítettük. A szabad 25 (OH) D3 koncentráció becslését egy korábban publikált (25) egyenlet felhasználásával végeztük.
A placenta 25 (OH) D3-at és a 24,25 (OH) 2D3-ot homogenizált placenta szövetekből (0,4 g) extraháltuk 1 ml metanolban folyadék-folyadék extrakciót követően (600 μl acetonitril, 1 ml metil-terc-butil-éter és 25 μl belső standard), szilárd fázisú extrakció Oasis HLB patronok felhasználásával (3 cm3/60 mg) és derivatizálás 50 μl 0,1 mg/ml 4- (2- (6,7-dimetoxi-4-metil) -3-oxo-3,4-dihidrokinoxalinil) -etil) -1,2,4-triazolin-3,5-dion (26, 27). 215 μmol d3-25 (OH) D3/L (IsoSciences) és 1,7 μmol d6-24,25 (OH) 2D3/L (Toronto Research Chemicals Inc.) tartalmú belső standard oldatot adtunk a homogenizált szövetekhez a az extrakció (27). Az extraktumokat 110 μl 60:40 arányú metanol-víz oldatban szuszpendáltuk, és LC-MS/MS rendszerbe injektáltuk a D-vitamin metabolitjainak mennyiségi meghatározásához. Az LC-MS/MS körülmények követték a 24,25 (OH) 2D3 (7) keringésének protokollját.
Genotipizálás
A D-vitamint metabolizáló gének [azaz a CYP2R1 és DBP gének] egyetlen nukleotid polimorfizmusának genotípusait az EndPoint Genotyping szoftver segítségével egy Roche LightCycler 480-on, az Applied Biosystems TaqMan Genotyping Assays (Life Technologies) alkalmazásával határoztuk meg, amint azt korábban leírtuk (7). ).
A D-vitamin metabolikus út komponenseinek Messenger RNS mennyiségi meghatározása a placenta szövetekben
Az RNS-t a placenta szövetmintáiból RNeasy Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával extraháltuk, és a koncentrációkat NanoDrop ND-1000 műszerrel határoztuk meg. A reverz transzkripciót nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával, kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciót (qRT-PCR) (Applied Biosystems ABI 7300 rendszer) hajtottuk végre. A TaqMan gén expressziós tesztjei (Thermo Fisher Scientific) a következők voltak: Hs00167999_m1 (CYP24A1), Hs00168017_m1 (CYP27B1), Hs01379776_m1 (CYP2R1), Hs01119018_g1 (LRP2) és Hs00153607_m1. A reakció körülményei 50 ° C 2 percig, 95 ° C 10 percig és 40 ciklus 95 ° C 15 másodpercig és 60 ° C 1 percig. A 2 −ΔΔ ciklusküszöb módszer (28) alapján a célgének adatait a messenger RNS (mRNS) bőségének változásaiként fejeztük ki, melyeket a háztartási génre [β-glükuronidáz (Hs99999908_m1)] normalizáltunk, és a kalibrátor.
In vitro placenta trophoblast sejttenyésztési modell
HTR-8/SVneo sejtkultúra
A HTR-8/SVneo sejtek (immortalizált humán első trimeszteres placenta extravillus trofoblasztok) Charles H. Graham (Queen's University) ajándékai voltak (29). A sejteket (passzázsszám: 17–21) tenyésztőedényre (BD Biosciences) szélesztettük 1,39 × 106 sejt/tálca magsűrűség mellett, és standard RPMI 1640 táptalajban tenyésztettük, amely 1,25–5% szarvasmarha-magzatot tartalmazott, 2 mM L-glutamin (az összes a Corning Life Sciences cégtől származik) és minden egyes D-vitamin kezelés [azaz 13 C2-kolekalciferol vagy 13 C5-25 (OH) D3; jelöletlen kolekalciferol, 25 (OH) D3 vagy 1,25 (OH) 2D3] 37 ° C-on, 5% szén-dioxid és 95% levegő nedvesített atmoszférában. Száz százalékos etanolt adunk a standard táptalajhoz kontroll kezelés céljából (0,1% etanol). A sejtszámot és az életképességet két példányban határoztuk meg TC10 sejtszámláló (Bio-Rad) és tripán kék kizárási teszt alkalmazásával. A kísérletet háromszor megismételtük. Minden egyes replikáción belül minden kezelést három példányban hajtottunk végre.
Jelöletlen D-vitamin kezelés és a D-vitamin metabolikus enzimek qRT-PCR-je
A D-vitamin expozíciónak a D-vitamin metabolikus enzimek génexpressziós válaszára gyakorolt hatásának vizsgálatához a placentában HTR-8/SVneo sejteket tenyésztettünk 72 órán át kolekalciferol, 25 (OH) D3 vagy 1,25 ( OH) 2D3. Az egyes kezelések végső D-vitamin-koncentrációja 2500, 5000 és 10 000 nM kolekalciferol (Cayman Chemical), 500 nM 25 (OH) D3 (Cayman Chemical) és 100 nM 1,25 (OH) 2D3 (Sigma-Aldrich) volt.
Az egyes minták sejtpelleteit összegyűjtöttük, és az összes RNS-t extraháltuk (PerfectPure RNS Cell and Tissue Kit), mennyiségileg meghatároztuk, és reverz transzkripciónak és qRT-PCR-nek vetettük alá. A TaqMan gén expressziós vizsgálata a CYP24A1, a CYP27B1, a CYP2R1 és a β-glükuronidáz esetében a reakciókörülmények és az adat expressziós módszerrel megegyezett a placenta szöveteknél használt qRT-PCR protokollban leírtakkal.
13 C2-kolekalciferol és 13 C5-25 (OH) D3 kezelés és 13 C-jelölt D-vitamin metabolit mérés sejtekből és táptalajból
A kolekalciferol metabolikus sorsának feltárása érdekében a HTR-8/SVneo sejteket 24, 72 és 96 órán át tenyésztettük 13 C2-kolekalciferollal (Cambridge Isotope Laboratories) vagy 13 C5-25 (OH) D3 (IsoSciences LLC), amelynek eredményeként a végső koncentráció 5000, illetve 500 nM. Ezeket a 13 C2-kolekalciferol és 13 C5-25 (OH) D3 adagolási koncentrációkat a jelöletlen D-vitamin kezelés adatainak felhasználásával választottuk ki. Az egyes kezelések mintái az egyes tenyésztési időpontokban a sejtpelletekből és a táptalajokból álltak 3 tenyésztési csészéből. Az egyes minták sejtpelleteit és táptalaját külön gyűjtöttük be, és a mérésig -80 ° C-on tároltuk.
Statisztikai analízis
Valamennyi elemzést a JMP Pro 12 szoftver (SAS Institute), a STATA 14. verzió (StataCorp) és a SigmaPlot 11. verziójú szoftver (Systat Software) felhasználásával végeztük. A normálisan nem elosztott adatokat ln-transzformáltuk, és aritmetikai átlagként ± SD-ként vagy geometriai átlagként (95% CI) mutatjuk be, hacsak másképp nincs meghatározva. A P értékek kétoldalas tesztek voltak, és az 1. és a 2. kiegészítő táblázat , és azok, akiknek a P 1. TÁBLÁZAT jelentőségi szintje van
A terhes nők kiindulási jellemzői és terhességi eredményei a harmadik trimeszterben 1
| Kor, y | 29 ± 3 |
| Terhességi BMI, kg/m 2 | 24 ± 3 |
| Etnikum, n | |
| kaukázusi | 14 |
| afro-amerikai | 1 |
| latinó | 4 |
| ázsiai | 4 |
| Egyéb | 1 |
| Paritás, n | |
| Primiparas | 11. |
| Multiparas | 13. |
| Multivitamin-kiegészítők használata a tanulmányi belépés előtt, n | |
| Igen | 20 |
| Nem | 4 |
| Szezon a tanulmányi belépéskor, n | |
| Áprilistól szeptemberig | 13. |
| Októbertől márciusig | 11. |
| GC rs7041 G> T polimorfizmus, n | |
| GG | 8. |
| GT | 10. |
| TT | 6. |
| CYP2R1 rs10741657 A> G polimorfizmus, n | |
| AA | 4 |
| AG | 18. |
| GG | 2 |
| CYP2R1 rs12794714 A> G polimorfizmus, n | |
| AA | 5. |
| AG | 18. |
| GG | 1 |
| Terhesség hossza, hé | 39,9 ± 0,7 |
| Terhességi súlygyarapodás, kg | 15,9 ± 4,6 |
| Szállítási mód, n | |
| Hüvelyi | 17. |
| Császármetszés | 5. |
| Kor, y | 29 ± 3 |
| Terhességi BMI, kg/m 2 | 24 ± 3 |
| Etnikum, n | |
| kaukázusi | 14 |
| afro-amerikai | 1 |
| latinó | 4 |
| ázsiai | 4 |
| Egyéb | 1 |
| Paritás, n | |
| Primiparas | 11. |
| Multiparas | 13. |
| Multivitamin-kiegészítők használata a tanulmányi belépés előtt, n | |
| Igen | 20 |
| Nem | 4 |
| Szezon a tanulmányi belépéskor, n | |
| Áprilistól szeptemberig | 13. |
| Októbertől márciusig | 11. |
| GC rs7041 G> T polimorfizmus, n | |
| GG | 8. |
| GT | 10. |
| TT | 6. |
| CYP2R1 rs10741657 A> G polimorfizmus, n | |
| AA | 4 |
| AG | 18. |
| GG | 2 |
| CYP2R1 rs12794714 A> G polimorfizmus, n | |
| AA | 5. |
| AG | 18. |
| GG | 1 |
| Terhesség hossza, hé | 39,9 ± 0,7 |
| Terhességi súlygyarapodás, kg | 15,9 ± 4,6 |
| Szállítási mód, n | |
| Hüvelyi | 17. |
| Császármetszés | 5. |
Az értékek átlag ± SD-k, hacsak másként nem jelezzük. CYP2R1, 25-hidroxiláz gén; GC, D-vitamint kötő fehérjegén.
- Anyagcsere és a máj határtalan anatómiája és élettana
- Az anyagcsere fokozza a vékony vastag étrendet
- Anyagcsere népszerű mítoszok és 9 egyszerű módja annak, hogy feljavítsd!
- Anyagcsere babákban és gyerekekben 0-5 év
- RJ-ROBBINOK Kalcium-anyagcsere és húgyúti kövek