A Hodgkin-limfóma telomeráz- és ALT-mechanizmusai közötti átmenet és annak prediktív értéke a klinikai kimenetelben

Telomeráz expresszió Hodgkin lynphoma (HL) sejtvonalakban. (A) PCR-alapú telomer megismételt amplifikációs protokoll (TRAP) vizsgálat a telomeráz aktivitás (TA) jelenlétének meghatározására HL sejtvonalakban. A lízispuffer (LB) belső kontrollként szolgál az amplifikációhoz, a hamis negatívumok kivételével. Minden HL sejtvonal expresszálta a TA-t. (B) Hisztogram, amely a relatív telomeráz aktivitás (RTA) szeres változását mutatja a HL sejtvonalakban a CT magas értékhez képest (pozitív kontroll 100%). (C) A hTERT fehérje fluorecenciájának intenzitásának meghatározása immunfluoreszcenciával; 10 000 sejtet pontoztak. Minden adat három független kísérletet reprezentál, és az átlag ± standard hibájaként van kifejezve. A kísérleteket három példányban hajtottuk végre.

teljes

Az alternatív telomer-hosszabbító (ALT) fenotípus jellemzése HL-sejtvonalakban. (A) A PML testek mennyiségi meghatározása HL sejtvonalakban immunfluoreszcenciával. Tízezer sejtet elemeztek minden sejtvonalra. (B) A PML fehérje Western blotjai a HL sejtvonalakban. Gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázt (GAPDH) alkalmaztunk terhelés kontrollként. (C) A kicsi és nagy sejtek gyakorisága a TRF2 és PML kolokalizációjával a PLA vizsgálattal. (D) Reprezentatív sejtek a PML és a TRF2 kolokalizációjával a PLA assay-vel (sárga nyíl), valamint a PML (piros) és a PNA-telomerek (zöld) manuális colocalization-jével (sárga nyíl) (40x-es nagyítás). (E) A T-SCE mennyiségi meghatározása a HL sejtvonalak kromoszómáiban CO-FISH festés után. Kromoszómák, amelyek (i) egy T-SCE eseményt, (ii) két T-SCE eseményt értékeltek, egyidejűleg használva mind a vezető, mind a lemaradó szálú szondákat, és (iii) négy T-SCE eseményt mindkét szálon és mindkét oldalon p és q karokat értékeltünk. (F) T-SCE (fehér nyíl) metafázisok képe a KMH2 sejtekben és telomer deléciók (zöld nyíl) (63 × nagyítás).

Telomeráz és PML test expresszió HL sejtvonalakban. (A) a hTERT (zöld jel) és a PML (piros jel) expresszió négy osztályba osztotta a HDLM2 sejteket: (i) jel nélküli sejtek (kék keret), (ii) hTERT pozitív sejtek (zöld keret), (iii) sejtek hTERT és PML expresszió (sárga keret), és (iv) PML testtel rendelkező sejtek (piros keret) (10-szeres nagyítás). (B) Az egyes cellatípusok gyakoriságának pontozása e besorolás szerint. Minden sejtvonalon kétezer sejtet pontoztak. (C) A fluoreszcencia intenzitást a különböző sejttípusokban a hTERT és PML jelek automatikus kvantifikálásával mértük. A hTERT és a PML fluoreszcenciájának intenzitását a sejtek területe normalizálta, és az eredményeket a sejtek területének kvartilisai szerint ábrázoltuk. A medián, 95% -os konfidencia intervallum, min és max.

hTERT és PML expresszió öt HL sejtvonalban CD15/CD30 fenotípus szerint. (A) Minden sejtvonalból négy alpopulációt rendeztünk a CD30 és CD15 expresszió szerint: CD30−/CD15−, CD30 +/CD15−, CD30 +/CD15 +, CD30−/CD15 +; (B) hTERT és PML expresszió CD30 +/CD15− -ben; (C) CD30 +/CD15 +; (D) CD30−/CD15−-ben; és (E) a CD30−/CD15 + -ban. Sejtek festés nélkül (kék), sejtek csak hTERT expresszióval (zöld), sejtek PML és hTERT expresszióval (sárga) és sejtek csak PML expresszióval (piros). (F) A CD30 +/CD15 + L428 sejtek és a CD30−/CD15− HDLM2 sejtek reprezentatív képe, amelyek különböző típusú PML és hTER expressziót mutatnak (40-szeres nagyítás).

Két különböző HL-beteg nyirokcsomóinak sejtjeiben a sejtek CD30 (vörös) és hTERT fehérje (zöld) immunfluoreszcenciájának elemzése (A) nagyon magas szintű hTERT jelenlétét mutatja a CD30-hiányos kis sejtekben (rózsaszín nyilak), (40-szeres nagyítás), (B) a hTERT és a CD30 expresszió együtt lokalizációja Hodgkin sejtekben, (fehér nyilak) és (C) a hTERT expresszió hiánya HRS sejtekben (sárga keret) (40 × nagyítás).

Az APB-k jelenlétének in situ elemzése a HL-nyirokcsomók metszeteiben. (A) A PML/TRF2 kölcsönhatások elemzéséhez proximity ligation assay-t (PLA) alkalmaztunk. A sárga keret a kis cellákat jelzi, többszörös és erős jelekkel, a kék keret pedig a nagy cellákat, kevés jelzéssel (40-szeres nagyítás). (B) A PML (piros) és a PNA telomerek (zöld) IF-FISH festése a PML együttes lokalizációját mutatja a kis sejtekben lévő telomer szekvenciákkal (sárga keret) és a PML magas expresszióját HRS sejtekben, kevés ko-lokalizációs jel mellett (narancssárga) keret) (40 × nagyítás).

A telomeráz és az ALT közötti átmenet elemzése HL-nyirokcsomókban 38 betegnél. Kilenc beteg nyirokcsomóinak magas telomerázszintje volt, 24-et mind a telomeráz-expresszió, mind a magas PML-testek jelenléte jellemzett, ötnél pedig alacsony vagy nem észlelhető hTERT-expresszióval (40-szeres nagyítás) magas PML-testek mutatkoztak.

Az EBV + HL betegek magas APB expressziójának és a klinikai eredmény kapcsolatának elemzése: (A) teljes túlélés, (B) progressziótól való mentesség és (C) esemény nélküli túlélés.