A szarvasmarha tej exoszómáiban lévő mikroRNS-ek biológiailag elérhetőek az emberben, de nem váltanak ki robusztus gyulladásgátló citokinválaszt

Absztrakt

Háttér

A szarvasmarha tej exoszómáit bioaktív élelmiszer-vegyületekként és a gyógyszer-szállítás hordozóiként vizsgálták. Mindkét vizsgálati vonal összefogja az immunfunkciókat, például az immunszabályozást a tej exoszómákba kapszulázott mikroRNS-ek abszorpciójával a fajhatárokon át, valamint annak lehetőségét, hogy az exoszómák és azok rakományai immunválaszt váltsanak ki, ha gyógyszeradagolásban alkalmazzák őket. Ez a tanulmány értékelte a szarvasmarha tejből származó immunrendszerrel kapcsolatos mikroRNS-ek biohasznosulását és a plazma citokinkoncentrációjának változását az emberek tejfogyasztása után, valamint a citokinek szekrécióját az emberi perifériás vér mononukleáris sejtjeivel (PBMC) tenyésztették az immun releváns mikroRNS-ekkel transzfektált tej exoszómákkal.

Eredmények

Az emberi plazmamintákat tejelő étkezés előtt és időnként időközönként gyűjtötték, és hat immunreleváns mikroRNS és kilenc citokin koncentrációját elemezték. A miR-15b-5p, miR-21-5p, miR-106b-5p és miR-223-3p csúcskoncentrációja plazmában 60 ± 9,80–162 ± 31,80% -kal magasabb volt a tejfogyasztás után (Ct értékek 23 ± 1,2 26 ± 1,1 ciklus) az alapértékekhez képest (P 0,05). Amikor az éheztetett alanyok PBMC-tenyészeteit immun-releváns mikroRNS-ekkel transzfektált tej exoszómákkal egészítették ki, az IL-1β, IL-6, IL-10 és a TNF-alfa koncentrációi 29 ± 12% -tól 220 ± 33% -kal voltak magasabbak mint a nem transzfektált exoszómákkal tenyésztett kontrollok (P 0,05).

Következtetések

A szarvasmarha tej exoszómáiban lévő mikroRNS-ek biológiailag hozzáférhetők. A tej exoszómák orális beadást követően nem váltják ki a plazma citokinek növekedését.

Próba regisztráció

ISRCTN nyilvántartási azonosító: 16329971. Visszamenőlegesen bejegyezve 2019. február 7-én.

Háttér

Az exoszómák nano méretű részecskék, amelyek alapvető szerepet játszanak a sejtek közötti kommunikációban [1]. A kommunikáció különféle rakományok, például az RNS-ek, a fehérjék és a lipidek különféle fajtáinak átvitelével valósul meg a donorból a befogadó sejtekbe [1,2,3]. Az exoszóma-rakományok közül a mikroRNS-ek (miR-ek) különös érdeklődésre tartanak számot, mert az mRNS-ben degradáció kiváltásával vagy az mRNS transzlációjának megakadályozásával hibridizálódnak a komplementer szekvenciákkal 3'-nem transzlált régiókban az mRNS-ben és a csend génekben [4, 5]. Az ember több mint 60% -aHomo sapiens, hsa) Az mRNS-ek feltételezett kötőhelyeket tartalmaznak az emberi genomban kódolt körülbelül 2000 miR-hez [6, 7]. A MiR-ek emberben gyakorlatilag minden génhálózatot szabályoznak, és számos fiziológiai és kóros állapotban szerepet játszanak az emberekben [8, 9]. A gének miR-ek általi negatív szabályozása különösen fontos az immunválasz szabályozó áramköreinek finomhangolásához [10].

Hagyományosan a miR-eket a gének endogén szabályozóinak tekintik, összhangban azzal a megfigyeléssel, hogy a miR-eket endogén gének kódolják, és a Dicer knockout egerekben a miR érésének elvesztése embrionális halálos [11,12,13,14,15,16]. Azt a paradigmát, miszerint a miR-eket kizárólag endogén szintézis útján nyerik, vitatták a jelentések, amelyek azt sugallják, hogy étrendi miR-ek növényekben és szarvasmarhákban (Bos taurus, bta) a tej biológiailag hozzáférhető és hozzájárul a miR-ek testkészletéhez emberekben és állatokban [17, 18]. Például 2012-ben kiderült, hogy a rizsből származó MIR-168a (Oryza sativa; osa-A MIR-168a) kimutatható emberi és állati szérumokban, és osa-A MIR-168a csökkenti az LDL receptor adapter fehérje 1mRNS expresszióját, ezáltal gátolja az LDL receptor expresszióját az egér májában [17]. A miRs exoszómákba való beágyazása ellenállást nyújt a tejfeldolgozó üzemekben és az emberi gyomor-bél traktusban a zord körülmények között, és ezután megkönnyíti a miR-ek bélben történő felszívódását [19,20,21,22]. A tej miR-ek biológiai hozzáférhetőségével kapcsolatos felfedezéseket öt független laboratórium erősítette meg (áttekintve [23]). Ez a felülvizsgálat azokat a tanulmányok korlátait is tárgyalja, amelyek nem bizonyították a tej miR-ek biohasznosulását.

A miR-ek és azok szarvasmarha-tejben levő exoszómahéjainak vizsgálata két vizsgálati vonalon jelentős tapadást ért el, nevezetesen a miR-ek és az exoszómák szerepét bioaktív élelmiszer-vegyületekként, valamint a tej-exoszómák hordozóként való felhasználását a gyógyszer szállítására. Például a bizonyítékok arra utalnak, hogy a tej exoszómáinak és az RNS-nek az étrend általi kimerülése olyan fenotípusokat vált ki, mint például a purin metabolitjainak 40-szeres növekedése az emberi és az egér testfolyadékaiban és szöveteiben, valamint a tapadás erősségének mérsékelt csökkenése egerekben [24, 25]. Tej exoszómákat alkalmaztak gyógyszerek egerek daganatos helyeire juttatására [26, 27]. Mindkét vizsgálati vonal összefogja az immunfunkciókat, például a miR-ek által a fajhatárokon átívelő immunszabályozást, valamint az immunogén exoszómák beadása által okozott káros hatások lehetőségét a gyógyszer bejuttatásakor.

A szarvasmarha tej exoszómái miR-ket tartalmaznak, amelyek szerepet játszanak az immunfunkcióban, például miR-15b-5p, miR-21-5p, miR-34a-5p, miR-106b-5p, miR-155-5p és miR-223- 3p [7, 10, 28]. Ezeknek a miR-eknek nukleotidszekvenciái azonosak az emberi ortológokkal, ezért a humán mRNS komplementer szekvenciáihoz kötődnek [29]. Ez a tanulmány értékelte a szarvasmarha tejből származó immunfüggő mikroRNS-ek biológiai hozzáférhetőségét és az emberi tejre adott immunválaszokat, valamint a miR-transzfektált tej exoszómákkal tenyésztett humán perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC) által termelt citokinek szekrécióját.

Eredmények

A MiR-ek elemzik a szarvasmarha tej és a szarvasmarha tej exoszómáit

Az RT-qPCR analízissel számszerűsített hat miR mennyisége hasonló volt a szarvasmarha tej és a szarvasmarha tej exoszómáiban. Az 1. ábra használatakor

A szarvasmarha tej és a szarvasmarha tej exoszómák immunfüggő miR-jeinek fordított transzkriptáz kvantitatív PCR elemzése azonos térfogatú tejből. Az értékek ± SEM (n = 3). Ct Ciklusküszöb

Az immunrendszerrel kapcsolatos miR-ek plazmaszintje

Egy korábbi jelentés azt sugallta, hogy a miR elemzést megzavarhatja a NucleoSpin miR plazmaoszlopainak mikrobiális RNS-ekkel való szennyeződése, de ezeket a megállapításokat nem tudtuk reprodukálni [30]. Megvizsgáltuk az oszlopok szennyeződését úgy, hogy molekuláris biológiai minőségű vizet vezettünk át hipoklorittal kezelt és nem kezelt oszlopokon, és összehasonlítottuk a két miR hat Ct-értékét RT-qPCR segítségével (n = 5 kezelésenként). A Ct értékek minden vizsgált mintában 35-nél nagyobbak voltak. A szennyezés hiánya ellenére az óvatosság mellett tévedtünk, és az oszlopokat 0,5% -os nátrium-hipoklorittal kezeltük a miR plazmából történő kivonása előtt [30].

A citokinek koncentrációja a plazmában

A tejfogyasztás nem befolyásolta az emberi plazma citokinkoncentrációját. Kilenc citokint vontak be a testreszabott multiplex vizsgálatba, annak az indoklásnak az alapján, hogy az immunsejtek különféle vonalai különböző citokineket választanak ki. A kilenc vizsgált citokin közül csak a TNF-alfa volt kimutatható a tejfogyasztás előtt és után összegyűjtött plazmában; a plazma TNF-alfa koncentráció látszólagos növekedése három órával a tejfogyasztás után az alapszinthez képest nem volt statisztikailag szignifikáns (o = 0,08 egyirányú ANOVA esetén; 2. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a tejfogyasztás nem váltja ki a citokin koncentrációjának növekedését az emberi plazmában.

A TNF-alfa plazmakoncentráció diagramjai a tejes étkezés előtt és időzített időközönként. A dobozok az 5. és a 95. percentiliseket jelölik, a vízszintes sávok a mediánok, a hibasávok pedig a minimális és maximális értékeket jelzik. o = 0,08 a 0. órával szemben (egyirányú ANOVA és Sidak többszörös összehasonlítása posthoc teszt; n = 5). TNF-alfa Tumorfekrózis-alfa

Citokinek koncentrációi PBMC táptalajban

A tejfogyasztás önmagában nem indukálta a PBMC-ket az IL-1β, IL-6, IL-10 és TNF-alfa nettó szekréciójának növelésére az ex vitro tejfogyasztás előtt gyűjtött PBMC-khez képest. A tejet fogyasztó résztvevők PBMC-i azonban szignifikánsan magasabb szintet produkáltak ezekben a citokinekben, miután 24 órán keresztül concanavalin A-val (ConA) stimulálták őket (3. ábra). A ConA kezelés önmagában nem váltotta ki a citokinkoncentrációk változását a táptalajban. A 48 és 72 óránál összegyűjtött táptalajok esetében a citokinkoncentráció mintázata megegyezett a tenyészet első 24 órájával (1. és 2. kiegészítő fájl). A tejelő étkezés előtt és után hat órával izolált PBMC-tenyészetekből származó IL-2, IL-4, IL-5, IL-17A és interferon gamma (IFN-γ) koncentrációját 24, 48 és 72 órában nem befolyásolták. tejfogyasztás vagy ConA (3. táblázat).

Vita

Következtetés

A tej exoszómákat tovább kell fontolóra venni, mint életképes lehetőséget a gyógyszerek és a szabályozó RNS diétán keresztül történő bejuttatására.

Mód

Résztvevők

Tizenkét látszólag egészséges felnőtt vett részt ebben a vizsgálatban [7 férfi, 5 nő; életkor (átlag ± SD, évek): 28,8 ± 3,51; testtömeg-index (átlag ± SD, kg/m 2): 23,9 ± 2,40]. A plazmában végzett citokin-elemzésekhez öt alany alcsoportját vettük mintába [2 férfi, 3 nő; életkor (átlag ± SD, évek): 28,4 ± 0,58 év; testtömeg-index (átlag ± SD, kg/m 2): 22,4 ± 1,65]. A kizárási kritériumok között szerepelt a terhesség, a dohányzás, a tejallergia és az ön által bejelentett egészségügyi problémák. A Nebraska-Lincoln Egyetem Intézményi Felülvizsgálati Testülete jóváhagyta ezt a protokollt, és minden alany aláírta a tájékozott beleegyezési űrlapot. Ezt a vizsgálatot visszamenőlegesen klinikai vizsgálatként regisztrálták az ISCRTN nyilvántartással (ISRCTN16329971).

Dizájnt tanulni

A miR-ek mennyiségi meghatározása a szarvasmarha-tejben és a szarvasmarha-tejből származó exoszómákban

Reverz transzkripciós kvantitatív PCR (RT-qPCR) alkalmazásával határoztuk meg az immunrendszerrel kapcsolatos miR-ek jelenlétét a szarvasmarha-tej és a szarvasmarha-tej exoszómákban. Szarvasmarha-tejet (1% zsírtartalmú) egy helyi élelmiszerboltból nyertek. Az exoszómákat ultracentrifugálással izoláltuk, amint azt kisebb módosításokkal korábban leírtuk [21]. Az RNS-t szarvasmarha-tej és szarvasmarha-tej exoszómákból izoláltuk, és a miScript Reverse Transcription Kit használatával reverz átírást végeztünk a gyártó utasításainak betartásával (Qiagen). RT-qPCR analízist hat immunrendszerrel kapcsolatos miR-re végeztünk SYBR Green (Qiagen) és a készletben található univerzális reverz primer, valamint az egyes miR-ekre specifikus primerek alkalmazásával (4. táblázat).

Plazma miR elemzés

A szarvasmarha miR-ek döntő többségének nukleotidszekvenciája megegyezik az emberi ortológjaikkal. Ezért a reverz transzkripciós kvantitatív PCR (RT-qPCR) nem tett különbséget a szarvasmarha és az emberi érett miR-15b-5p, miR-21-5p, miR-34a-5p, miR-106b-5p, miR-155-5p, miR között. -223-3p és miR-1-3p [29]. A MiR-1 nem mutatható ki a szarvasmarha tejben, és negatív kontrollként használtuk [53, 54]. A MiR-eket a NucleoSpin miRNS plazmakészlet (Macherey-Nagel) segítségével izoláltuk a plazmából, és reverz transzkripciós kvantitatív PCR-rel (RT-qPCR) vizsgáltuk a fent leírtak szerint. Heintz-Buschart és mtsai. számoltak be arról, hogy az RNS-tisztításhoz használt spin-oszlopok szennyezettek lehetnek mikrobiális RNS-ekkel, és hamis pozitív eredményeket hozhatnak a miR elemzésben [30]. Noha nem tudtuk reprodukálni a centrifugálási oszlopok szennyeződését, úgy döntöttünk, hogy tévedünk az óvatosság mellett, és használat előtt 0,5% -os nátrium-hipoklorittal tisztítottuk az oszlopokat [30]. A plazma miRs-koncentráció és az időgörbék görbék alatti területeit (AUC) lineáris trapézszabály alkalmazásával számítottuk ki, és a miR-ek látszólagos biohasznosulásának felmérésére használtuk [55].

Citokin elemzés

A PBMC-ket a tejfogyasztás előtt és után hat órával összegyűjtöttük, és 10% (térfogat%) autológ plazmával, 1% penicillinnel/sztreptomicinnel és 0,1% nátrium-piruváttal kiegészített RPMI-1640-ben szuszpendáltuk. A PBMC-ket T25 tenyésztőlombikokban tenyésztettük 5 ml táptalaj végtérfogatában, 2x106 sejt/ml sűrűségben. Két aliquotot készítettünk; az egyik alikvot részt ConA-val kezeltük 15 μg/ml végkoncentrációban, a második alikvot részt oldószerrel kezeltük (vivőanyag-kontroll). A sejteket legfeljebb három napig tenyésztettük, és a táptalaj felülúszóit a tenyésztés megkezdése után 24, 48 és 72 órával gyűjtöttük össze. A sejtmentes felülúszók citokin-koncentrációját egyedi Milliplex Map Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Immunoassay Kit (EMD Millipore) alkalmazásával határoztuk meg IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 10, IL-17A, IFN-y és TNF-alfa a gyártó utasításai szerint (Millipore Billerica, Inc.). A mintákat Bio-Plex Magpix olvasó rendszer és Bio-Plex Manager szoftver (Bio-Rad, Inc.) segítségével elemeztük.

PBMC-tenyészet miR-terhelt exoszómákkal

Az emberi éheztetett vérből származó PBMC-ket tej exoszómákkal vagy exoszómákkal tenyésztették, amelyeket szintetikus immun-releváns miR-ek (miR-15b-5p, miR-21-5p, miR-155-5p és miR-223-3p) keverékével transzfektáltak, vagy a miR-t 106 sejt/ml sejtsűrűséggel keverte, az előbbiek szerint [31]. A kódolt miR-t úgy terveztük meg, hogy véletlenszerűen randomizáltuk a négy immunrendszerrel kapcsolatos miR nukleotidszekvenciáját. Két különböző koncentrációjú exoszómát (1 × 105 vagy 1 × 10 10 exoszóma részecske/ml) használtunk PBMC tenyészetekben. Az exoszómával kiegészített PBMC kultúrákat ConA-val vagy oldószerrel kezeltük a fentiek szerint. Sejtmentes tenyészet felülúszókat 24 és 48 órával a tenyésztés megkezdése után gyűjtöttünk, és a Milliplex kit alkalmazásával elemeztük a citokineket.

statisztikai elemzések

Két- és egyirányú ANOVA-t alkalmaztunk két, illetve egy független változó hatásának vizsgálatakor. Sidak posthoc tesztjét alkalmazták, amikor összehasonlították a kezeléseket egy kijelölt kontrollal, míg Tukey posthoc tesztjét alkalmazták az összes csoport összehasonlításakor. Az AUC-értékeket a GraphPad Prism 6 (GraphPad Software) alkalmazásával számoltuk ki. A farmakokinetikai adatokat ismételt intézkedések ANOVA Fisher által védett legkevésbé szignifikáns különbségteszt alkalmazásával elemeztük post hoc összehasonlításra. A citokinanalízishez Friedman rangösszeg tesztet alkalmaztunk, majd páronkénti összehasonlítást végeztünk Nemenyi többszörös összehasonlító teszt alkalmazásával. Az adatokat átlag ± SEM értékként jelentjük. A kezelés hatásait statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha P

Az adatok és anyagok rendelkezésre állása

A tanulmány során keletkezett összes adatot tartalmazza ez a közzétett cikk, valamint annak 1. és 2. kiegészítő fájlja.