A tejsavbaktériumok természetes mézből izolált törzseinek gombaellenes aktivitása a patogén Candida fajok ellen

Bulgasem Y. Bulgasem

1 Mikrobiológiai Tanszék, Természettudományi és Kar, Universiti Sains Islam Malaysia (USIM), 71800 Nilai, Malajzia.

Mohd Nizam Lani

2 Élelmiszertudományi és Technológiai Iskola, Universiti Malaysia Terengganu (UMT), 21030 Kuala Terengganu, Malajzia.

Zaiton Hassan

1 Mikrobiológiai Tanszék, Természettudományi és Kar, Universiti Sains Islam Malaysia (USIM), 71800 Nilai, Malajzia.

Wan Mohtar Wan Yusoff

3 Biológiai és Biotechnológiai Iskola, Természettudományi és Technológiai Kar, Universiti Kebangsaan Malaysia, 43600 UKM Bangi, Malajzia.

Sumaya G. Fnaish

4 Közösségi Egészségügyi Tanszék, Orvostudományi és Egészségtudományi Kar, Universiti Putra Malaysia, 43400 UPM Serdang, Malajzia.

Absztrakt

A tejsavbaktériumok (LAB) szerepe a mézben, mint gombaellenes aktivitás, kevés figyelmet kapott, és a gombák gátlásának mechanizmusa nem teljesen ismert. Ebben a tanulmányban a LAB-t izolálták Malajziából, Líbiából, Szaúd-Arábiából és Jemenből származó mézmintákból. Huszonöt izolátumot igazoltunk a LAB katalázvizsgálattal és Gram-festéssel, és gombaellenes aktivitást vizsgáltunk. Négy LAB mutatott gátló aktivitást a Candida spp. kettős agar overlay módszerrel. Ezeket Al-Seder mézből izolált Lactobacillus plantarum HS-ként, Al-Hanon mézből izolált Lactobacillus curvatus HH-ként, a Tualang mézből izolált Pediococcus acidilactici HC-ként és az Al-Maray mézből a 16S rDNS szekvenciával izolált Pediococcus pentosaceus HM-ként azonosították. A Candida glabrata ATCC 2001 növekedését erősen gátolták (> 15,0 mm) és (10

15 mm) a L. curvatus HH és a P. pentosaceus HM izolátumokkal. A nyers felülúszó (sejtmentes felülúszó, CFS) gombaellenes aktivitását kútdiffúziós módszerrel értékeltük. A CFS magas gombaellenes aktivitást mutatott a Candida spp. különösen az L. curvatus HH CFS-je szignifikánsan (p Kulcsszavak: Gombaellenes aktivitás, Méz, Tejsavbaktériumok, Kórokozó Candida fajok

A fruktóz, a glükóz, a szacharóz és a maltóz, a méz túltelített négy kulcsfontosságú cukoroldata, a méz egyéb elemekkel rendelkezik, például glükonsavval, fehérjeenzimekkel, aminosavval, ásványi anyagokkal, vitaminokkal és vízzel [1]. Enyhén savas, 3,2 és 4,5 közötti pH-értékkel, a méz alacsony pH-ja megakadályozza a különféle patogén baktériumok és gombák szaporodását [2]. A méz antimikrobiális aktivitását befolyásolja, hogy a mikrobacsoportok, köztük a baktériumok (Gram-variábilis pleomorf baktériumok, Bacillus spp., Enterobacteriaceae és tejsavbaktériumok [LAB]), penészgombák (elsősorban aspergillusok és penicilliumok) és az élesztők kölcsönhatásban vannak egymással [3]. A méz eredendő elemei bakteriosztatikus vagy baktericid hatással befolyásolhatják a mikroorganizmusok növekedését és túlélési képességét [4]. A cukorban és savban gazdag fermentált ételekkel és szilázs-helyzetekkel összehasonlítva a LAB a méz fő mikroorganizmusa [5], a mézelő méh (Apis mellifera) takarmányozója [6], a méh gyomra, virága, növénye, virága és gyümölcse [7]. ]. A különböző bázisoktól elzárt LAB-t különböző antimikrobiális vegyületek előállításával azonosítják, amelyek képesek megakadályozni a gombák növekedését. Általában a LAB-ban található egyes fajok bioaktív vegyületeket hozhatnak létre, például szerves savat, hidrogén-peroxidot, diacetilt, bakteriocinokat, antimikrobiális peptideket és antibiotikumokat [8,9,10].

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Mézminták

A különféle forrásokból származó tizenöt mézmintát az elemzés előtt szobahőmérsékleten tároltuk. Ennek a vizsgálatnak a mintái Malajziából (Madu Tualang, Madu Tani, tiszta Trigona méz) Líbiából (Al-Seder méz, Al-Hanon méz és Al-Zater méz), Jemenből (Al-Seder méz és Al-Maray méz) kerültek elő. ), Szaúdi arab (Al-Shifaa méz) és Új-Zéland (Manuka méz). PH-mérőt (METTLER TOLEDO, Greifensee, Svájc) használtunk a különböző méz pH-tartományának meghatározásához.

A LAB izolálása mézmintákból

A LAB izolálása mézmintákból a Bulgasem et al. [19]. Nagyjából 10 g mézminta szuszpenzióját 90 ml peptonvízben (0,1% w/v) steril stomacher-tasakokban és a tasakok keverését manuálisan végeztük. Ezután 1 ml-t adtunk 9 ml de Man, Rogosa & Sharpe (MRS) táptalajhoz (Oxoid CM359), és az inkubálást 30 ° C-on 24–48 órán át folytattuk, majd sorozatosan hígítottuk peptonvízzel (0,1% w/v). ). Ezt követően 0,1 ml-t terítettünk számos adaptált táptalajra, konkrétan MRS agarra (Oxoid) [20], MRS agarra 0,8% CaCO3-mal [21], MRS agarra 1% glükózzal, paradicsomlé agarra 0,8% CaCO3-ra és paradicsomlé agar 1% glükózzal. A lemezek inkubálása anaerob helyzetben volt anaerob edényben 37 ° C-on 48 órán át, vagy amíg a baktériumtelepek kellően meg nem nőttek. A telepek 4% H2O2-tal végzett kataláz aktivitásának vizsgálatát és a 0,3% CaCO3-ot tartalmazó MRS agaron végzett kataláz-negatív telepek csíkozását 48 órán át 37 ° C-on tartottuk melegen a tiszta telepek elérése érdekében. Az izolátumok Gram festés és tenyésztés tisztaságának validálását morfológiai és mikroszkópos módszerekkel ellenőriztük. Minden negatív katalázt és gram-pozitív LAB izolátumot MRS táptalajban tartósítottunk 15% glicerinnel és -20 ° C-on félretettük további ellenőrzés céljából.

A Candida spp

Az ebben a vizsgálatban szereplő Candida törzseket a Malajziai Putra Egyetem Orvosi Mikrobiológiai Tanszékének eredeti állománykultúrájából nyert mikrobiális gyűjteményekből nyerték. Minden Candida spp. beleértve a C. albcans ATCC14053, C. parapsilosis ATCC22019, C. tropicalis ATCC750, C. krusei ATCC 6258 és C. glabrata ATCC2001 törzseket, amelyeket Sabouraud dextróz agaron (SDA, Oxoid) tenyésztettek 35 ° C-on 24 és 48 órán keresztül, hogy megerősítsék. megvalósíthatóság és egyértelműség. A gombatörzseket további felhasználásig 4 ° C-on tartottuk az SDA-n.

Sejt nélküli felülúszó készítmény

Az izolátumokat MRS táptalajba injektáltuk, és 24 órán át 30 ° C-on melegen tartották. A sejtmentes felülúszó (CFS) előállításához a húslevest centrifugáltuk 11 500 fordulat/perc sebességgel 10 percig 4 ° C-on. (Mini Spin, AG 22331; Eppendorf, Hamburg, Németország). Az izolátum felülúszójának minden szűréséhez steril szűrőt használtunk (0,45 µm pórusméretű szűrő; Millipore, Darmstadt, Hesse, Németország) [22], és ezt a szűrletet használtuk elemzésre.

A Candida spp. Érzékenysége gombaellenes szerekre

LAB izolátumok gombaellenes aktivitása kettős agar overlay módszerrel

Négy LAB izolátum gombaellenes aktivitást határoztak meg a Candida spp. a Magnusson és Schnürer [25] által meghatározott overlay technikával. A LAB-ot folton injektálták az MRS agar lemezekre. A lemezek inkubálása anaerob körülmények között 24 órán át 30 ° C-on volt. Ezeket a lemezeket 15 ml SDA (0,75% puha SD agar) réteggel borítottuk, amely 104 CFU/ml éjszakai Candida tenyésztést tartalmazott a lemezekre. A lemezeket 24 órán át 30 ° C-on aerob módon melegen tartottuk, és megmértük a Candida növekedését gátló zónát, amely a megfelelő LAB-tenyészet felett helyezkedik el. LAB gátlási tesztek Candida spp. két példányban hajtották végre.

A LAB felülúszóinak gombaellenes hatása agar kút diffúziós módszerrel

A LAB-izolátumok erős gombaellenes aktivitást mutattak kettős átfedő foltos technikán keresztül, továbbá Magnusson és Schnürer által meghatározott kút-technikával értékelték [25]. Candida spp. A 24 órán át tenyésztett (104 sejt/ml) tenyészetet SDA-val diverzifikáljuk és a lemezekre adagoljuk. Az agar megszilárdulása után parafafúróval 6 mm mélyedéseket készítettünk. Ezután agarral borította be a kút alapját a szivárgások elkerülése érdekében. CFS változatlan mennyiségű LAB hozzáadása minden üreghez, és a lemezek inkubálása aerob módon 30 ° C-on 24 órán át. A kutakat körülvevő növekedésgátló zóna mérését a kútméret csökkenése után végeztük el. A kísérletet két példányban hajtották végre, az átlagokat pedig a szórások kiszámításával.

A LAB-izolátumok azonosítása API 50 CHL és 16S rDNS génszekvenciákkal

Statisztikai analízis

Az összes adatot átlag ± standard deviációként adtuk meg, és kétirányú elemzési varianciával elemeztük az SAS általános bélésmodell-eljárásával (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), és Tukey-tesztet alkalmaztunk szignifikáns átlagokra a p 4-től 10 5. Minél nagyobb a LAB hígítása, annál nagyobb a LAB populáció száma a mintáknak. Ebben a tanulmányban a Tualang méz magas számú LAB-ot tartalmazott. A mézminták pH-ja 3,5 és 5,7 között változik, a legalacsonyabb pH-értéket a Tualang méz mutatja (1. táblázat). Összesen huszonöt izolátum, amelyek tiszta zónákat mutattak az MRS agaron 0,8% CaCO3-tartalommal és kataláz-negatívumokkal, gram-pozitív festéseket kaptak, és az eredmények azt mutatták, hogy a LAB-izolátumok 52% -osan rúd alakúak és 48% -osan kókusz alakúak voltak. Ezen LAB-izolátumok közül négyet, nevezetesen HS-t, HC-t, HH-t és HM-t választottak ki gombaellenes vizsgálatra patogén Candida spp öt törzsével szemben.