A tetraciklin hatása a miokardiális infarktus méretére elhízott patkányokban, kémiailag indukált vastagbélgyulladásban

Szerepek konceptualizálás, adatgondozás, hivatalos elemzés, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, írás - eredeti tervezet

Kísérleti Orvostudományi Intézet, Almazov Nemzeti Orvosi Kutatóközpont, Szentpétervár, Orosz Föderáció, „Probiocode SP” tudományos kutatóközpont, Moszkva, Orosz Föderáció

Szerepek Adatkúra, vizsgálat, módszertan, validálás

Kísérleti Orvostudományi Intézet, Almazov Nemzeti Orvosi Kutatóközpont, Szentpétervár, Orosz Föderáció, Szentpétervári Pavlovi Állami Orvostudományi Egyetem Kórélettani Tanszéke, Szentpétervár, Orosz Föderáció

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, módszertan, szoftver

Társulási Tudományos Kutatóközpont „Probiocode SP”, Moszkva, Orosz Föderáció, Sevcsenko Transznisztriai Állami Egyetem, Fizikai és Szanokreatológiai Tanszék, Tiraspol, Moldovai Köztársaság

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizualizáció

A Moldovai Műszaki Egyetem Mikroelektronikai és Orvostechnikai Mérnöki Tanszéke, Chisinau, Moldovai Köztársaság

Szerepek vizsgálata, módszertan, validálás

Szerepek Formális elemzés, módszertan, szoftver, vizualizáció

Kísérleti Orvostudományi Intézet, Almazov Nemzeti Orvosi Kutatóközpont, Szentpétervár, Orosz Föderáció

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizsgálat

Kísérleti Orvostudományi Intézet, Almazov Nemzeti Orvosi Kutatóközpont, Szentpétervár, Orosz Föderáció, „Probiocode SP” tudományos kutatóközpont, Moszkva, Orosz Föderáció

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, projekt adminisztráció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Jurij Ju Borcsev,
Sarkis M. Minasian,
Inessa Yu Burovenko,
Victor Yu Boršcsev,
Egor S. Protsak,
Natalia Yu Semenova,
Olga V. Borscseva,
Michael M. Galagudza

Cikk
Szerzői
Metrikák
Hozzászólások
Média közvetítés
Peer Review

Ábrák

Absztrakt

Háttér

A legfrissebb bizonyítékok arra utalnak, hogy az antibiotikumok által kiváltott bél mikroflóra összetételében bekövetkező változások, valamint az ezekből fakadó szisztémás immunendokrin hatások módosíthatják a szívizom toleranciáját az iszkémia-reperfúziós sérülésekkel szemben. Ennek a vizsgálatnak a célja a tetraciklin (TTC) hatásának vizsgálata volt a miokardiális infarktus méretére az elhízott patkányoktól kémiailag indukált vastagbélgyulladásban (CIC) nyert izolált szívekben. A TTC által kiváltott infarktusméret és a bél mikrobiom összetételének, valamint a citokinek és rövid láncú zsírsavak (SCFA) plazmaszintjeinek összefüggését is tanulmányozták.

Mód

Az elhízást Wistar patkányok indukálták magas zsírtartalmú, magas szénhidráttartalmú étrend öt héten keresztül történő táplálásával. 3% ecetsav (2 ml) egyszeres rektális beadása patkányoknak CIC-t eredményezett. Egészséges patkányok, valamint elhízott patkányok CIC-vel kaptak TTC-t (napi 15 mg 3 napig) szondán keresztül. A patkányokat eutanizáltuk, majd izolált szívperfúziót hajtottak végre szimulált globális iszkémiával és reperfúzióval. Az infarktus méretét hisztokémiai úton határoztuk meg. A lipopoliszacharid (LPS) és a plazma citokinszintjét enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal, míg a plazma SCFA szintjét gázkromatográfiával/tömegspektrometriával mértük. A bél mikrobiómáját reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval elemeztük.

Eredmények

A TTC-kezelés szignifikáns infarktusméret-korlátozást eredményezett (50 ± 7 vs. 62 ± 4% a kontroll egereknél, p2 masszív kardiomiocita pusztulást szenvedett és krónikus szívelégtelenség alakult ki [5]. Azt is beszámolták, hogy a az echinocandin család kardiotoxicitást okozhat [6].

Eredményeink megerősítették a TTC infarktus-korlátozó hatását egészséges patkányokban. A DIO és a CIC együttélése azonban megfordította a TTC kardioprotektív hatását. Az infarktus nagysága szignifikánsan nagyobb volt a TTC-vel kezelt elhízott, CIC-ben szenvedő állatok szívében, mint a kontroll patkányok szívében. A TTC ezen hatása nem társult az SCFA-szint változásával, de a bél mikrobiota specifikus profiljának, az endotoxémia mértékének vagy a citokin-egyensúlyhiánynak tulajdonítható. Eredményeink alátámasztják az antimikrobiális szerek óvatos alkalmazását olyan társbetegségben szenvedő betegeknél, akiknél szintén nagy az akut koszorúér-szindróma kockázata.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Valamennyi eljárást a Laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató (NIH 85–23. Kiadvány, felülvizsgált 1996), valamint a kísérleti és egyéb tudományos célokra használt gerinces állatok védelméről szóló európai egyezménynek megfelelően hajtották végre. Az Almazov Országos Orvosi Kutatóközpont intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága jóváhagyta a vizsgálati protokollt (17-DI-1. Protokoll; 2017. május 30.). A vizsgálat során minden erőfeszítést megtettünk az állatok védelme és szenvedéseik minimalizálása érdekében. A kísérletek megfeleltek az ARRIVE irányelveknek (http://www.nc3rs.org/ARRIVE).

Állatok

A vizsgálathoz hím Wistar patkányokat (életkor: 11–12 hét; súly: 300–320 g) nyertünk. Az állatokat 12/12 órás világos/sötét ciklus alatt tartottuk, és szabad hozzáférést kaptunk az élelemhez és a vízhez.

Reagensek

A kísérletekben használt összes vegyi anyag analitikai minőségű volt, és Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) vásároltuk, hacsak másképp nem jelöljük meg.

DIO kialakulása patkányokban

A DIO-t úgy fejlesztették ki az állatokban, hogy magas zsírtartalmú, magas szénhidráttartalmú étrendet (HFCD; 40% zsír, 45% szacharóz; Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA) öt hétig a szív izolálása előtt tápláltak [15].

A vastagbélgyulladás kiváltása

A vastagbélgyulladást DIO-val kezelt patkányokban 3% -os ecetsav (2 ml) egyszeres rektális adagolásával 2 mm átmérőjű polietilén cső alkalmazásával 5,5 cm mélységig a végbélbe illesztettük [16]. A patkányokat úgy helyeztük el, hogy a hátsó végtagok a végbélbe történő csepegtetés során a fej fölé emelkedjenek, majd 1 percig az oldat szivárgásának megakadályozása érdekében.

Kísérleti terv

Az állatokat véletlenszerűen a következő öt csoportba soroltuk (1. ábra): kontroll (CON, n = 14, mindegyik patkány 1 ml hordozót kapott), TTC (n = 13, mindegyik patkány 15 mg TTC-t kapott 1 ml normál sóoldatban) ), DIO (n = 14, DIO patkányokat kezeltünk vivőanyaggal), DIO + CIC (n = 14, DIO és CIC patkányokat kezeltünk vivőanyaggal) és DIO + CIC + TTC (n = 14, patkányok) DIO-val és CIC-vel kezeltek TTC-vel). Mindegyik kezelést naponta egyszer, három napon át intragasztrikus úton adtuk be. A kezelés utolsó napja után az állatokat öt napig hagyták felépülni a szív izolálása előtt. A CON és a TTC csoportba tartozó állatok kivételével az összes állatot HFCD-vel etették a gyógyulási időszak alatt. A CON és a TTC csoportok standard chow-t kaptak (12% zsír, 0% szacharóz; Lab Diet, St. Louis, MO, USA). A szívbehúzást megelőző hét nap során minden nap 9: 00–10: 00 órakor a következő részleteket rögzítették: klinikai állapot, testtömeg, valamint víz- és ételfogyasztás. A boncolást követően a vakbélt, valamint a retroperitoneális, epididymális és zsigeri zsírpárnákat kivágták és megmérték.

Részletekért lásd a szöveget. AA – ecetsav, HFCD - magas zsírtartalmú, magas szénhidráttartalmú étrend, Veh-vehikulum, TTC – tetraciklin, SCFA-k - rövid szénláncú zsírsavak.

Biokémiai és immunológiai paraméterek értékelése

Saphena vénából vért vettünk a biokémiai és immunológiai paraméterek elemzésére standard vérgyűjtési technikával egy nappal a szív izolálása előtt. A teljes vért kétszer 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk, hogy szérumot kapjunk. Biokémiai analizátort (BioChem Analette; HTI, North Attleboro, MA, USA) használtunk a laktát, laktát-dehidrogenáz (LDH), lúgos foszfatáz (ALP), karbamid és húgysav szérumszintjének meghatározására. Az alfa tumor nekrózis faktor (TNF-α), az interleukin (IL) -8, a monocita kemoattraktáns protein-1 (MCP-1), a C-reaktív fehérje (CRP) és a lipopoliszacharid (LPS) szérumkoncentrációit enzim alkalmazásával mértük. kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készletek (MR-96A; Mindray, Shenzhen, Kína) a gyártó utasításainak megfelelően. Minden ELISA tesztet három példányban hajtottunk végre.

DNS-extrahálás és a bél mikrobiota elemzése

A bél mikrobiota profilját a székletmintákban két szakaszban határoztuk meg. Először a DNS-t extraháltuk a széklet-szuszpenziók felülúszóiból DNS-kivonó készlet segítségével (QIAamp DNA Stool Mini Kit; QIAGEN, Hilden, Németország) száraz blokkfűtésben (Termit; DNA-Technology LLC, Moszkva, Oroszország), majd inkubáció. Ezután valós idejű polimeráz láncreakciót (PCR) hajtunk végre a T100 ™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) és a Colonoflor-16 reakcióelegy (Alpha-Lab, Saint-Petersburg, Oroszország) felhasználásával. Az olvadásgörbe-analízist az amplifikáció után azonnal elvégeztük a megcélzott PCR-termék azonosítására, amelyet spektrofotométerrel (NanoDrop ND-1000; Peqlab, Erlangen, Németország) számszerűsítettünk. A baktériumok számát kolóniaképző egységben (CFU)/g fejezzük ki.

Az SCFA-k elemzése

Az SCFA-k plazmakoncentrációit gázkromatográfiával értékeltük lángionizációs detektálással (GC-FID). A következő SCFA-k koncentrációit mértük: ecetsav, propionsav, izovajsav és izovalerinsav. Az SCFA-kat retenciós idejük és jellegzetes tömegfragmens-ionjaik alapján azonosítottuk GC-FID rendszeren (Agilent 7890A; Agilent Technologies, Wilmington, NC, USA) kiválasztott ion-monitorozás sémájával. Az SCFA mennyiségi meghatározása a kromatogramok automatikus integrálásával történt GC/MSD ChemStation szoftver (Agilent Technologies) alkalmazásával.

Elszigetelt szív perfúzió Langendorff szerint

A patkányokat nátrium-pentobarbitállal (60 mg/kg intraperitoneálisan) altattuk. Mindegyik szívet bilaterális thoracotomián keresztül kivágtuk, és a felemelkedő aortán keresztül Krebs-Henseleit pufferrel perfundáltuk (amely a következőkből áll [mmol/l-ben]: NaCl, 118,5; KCl, 4,7; NaHCO3, 25; KH2PO4, 1,2; MgSO4, 1,2; glükóz, 11 és CaCl2, 1,5) állandó 85 Hgmm nyomáson [17]. A perfúziós nyomást gravitáció segítségével egy vízköpenyes, duplafalú üvegoszlop alkalmazásával tartottuk az aorta kanülhöz háromirányú elzáróval. A puffer oxigenizálását karbogénnel (95% O2 plusz 5% CO2) hajtottuk végre egy fordított üvegszűrőn keresztül.

A bal kamra szisztolés nyomását (LVSP) és a bal kamrai végdiasztolés nyomását (LVEDP) izovolumetrikusan mértük egy nem rugalmas polietilén ballonnal, amelyet a bal kamrába juttattunk a bal pitvarba. A léggömböt inzulinfecskendőhöz kapcsolták, és 0,4–0,6 ml forralt vízzel felfújták, így LVEDP-t kaptak th per perc reperfúzióval. Ezenkívül a bal kamrai nyomást (LVP) mértük a globális ischaemia 5., 10., 15., 20., 25. és 30. percében. Bármely szív, amelynek HR-értéke 18 vagy 100 Hgmm, ha az LVEDP értéket a 2. ábrán tartják. A különböző kezelési rendek hatása az állat testtömegére, az étel- és vízfelvételre, valamint a zsigeri zsír és a vakbél súlyára.

(A) A testtömeg heti változásai, (B) víz- és (C) táplálékfelvétel és (D) zsigeri zsír- és (E) vakbéltömegek. Az adatokat átlag ± SD-ként fejezzük ki. * jelzi p 1. táblázat: Biokémiai szérummarkerek Wistar patkányokban a kísérlet végén.

Az eredmények átlagértékeket és szórásokat mutatnak.

Az eredmények átlagértékeket mutatnak ± SD.

Bél mikrobiómája

Néhány bélbaktérium (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Escherichia coli, Faecalibacterium prausnitzii, Bacteroides fragilis és Akkermansia muciniphila) relatív számát, valamint az összes baktériumszámot a 3. ábra mutatja be. Összes baktériumszám és Bacteroides fragilis a TTC és DIO + CIC + TTC csoportokban a szám szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a CON csoportban (3A. és 3F. ábra). Ezenkívül a Lactobacillus spp., A Bifidobacterium spp. És az Akkermansia muciniphila száma csökkentnek bizonyult a DIO csoportban (3B., 3C. És 3G. Ábra). A DIO-val és CIC-vel rendelkező állatoknál kisebb volt a Lactobacillus spp. és a Bifidobacterium spp. de nagyobb az Escherichia coli száma, mint a CON csoportban (3B – 3D. ábra). Hasonló változásokat figyeltek meg a mikrobiota profilokban a DIO + CIC + TTC csoportban. A Faecalibacterium prausnitzii populációja azonban nem különbözött az öt csoport között.

(A) Összes baktériumszám. RT-PCR-rel elemeztük (B) Lactobacillus spp., (C) Bifidobacterium spp., (D) E. coli, (E) Faecalibacterium prausnitzii, (F) Bacteroides fragilis és (G) Akkermansia muciniphila számokat a székletmintákban. Az eredményeket átlag ± SD-ként adjuk meg, és CFU/g-ban fejezzük ki. * p 0,05, ha az értéket összehasonlítjuk a CON csoport adataival). A propionsav, az izovaj és az izovalerinsav szintje nem különbözött a csoportok között (4B – 4D. Ábra).

Az (A) ecetsav, (B) propionsav, (C) izovajsav és (D) izovalerinsav plazmakoncentrációit GC-FID-vel határoztuk meg. Az eredményeket átlag ± SD-ként mutatjuk be. * jelzi az 5. ábrát. Funkcionális paraméterek és a szívinfarktus nagysága izolált patkány szívekben, akiket 30 perc globális ischaemia szenved, majd 120 perc reperfúzió.

(A) iszkémiás kontraktúra, (B) LVP, (C) LVEDP és (D) CFR értékek a kiinduláskor és a reperfúzió során. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. (E) Az infarktusméret eredményei pontszerű ábrákként jelennek meg, medián értékekkel. (F) A trifeniltetrazolium-kloriddal festett szívszeletek reprezentatív képei. * jelzi a p-t. 6. ábra. A CIC modell validálása a vastagbél hisztopatológiai vizsgálatával.

A vastagbélmintákat az (A) CON, (B) TTC, (C) DIO, (D) DIO + CIC és (E) DIO + CIC + TTC csoportba tartozó állatokból gyűjtöttük a kísérlet végén, paraformaldehidbe rögzítve, és H&E-vel festették. Morfometrikus elemzést végeztünk az (F) teljes bélfal vastagság és a nyálkahártya vastagságának meghatározására. A szöveti metszeteket mikroszkóp alatt, 100-szoros nagyítással figyeltük meg. A skála sávja minden kép esetében 100 μm. A képek legalább négy önálló szakaszt ábrázolnak. * p 2+ -ot jelöl. Ez a hatás releváns a kardioprotekcióban, mivel a patkány szívében az ischaemia-reperfúzió a mátrix metalloproteinase-2 fokozott aktivitását eredményezi [23]. A doxiciklin azonban megakadályozza ezt az aktiválódást, javítja a funkcionális helyreállítást a reperfúzió során, és csökkenti a troponin I és a miozin proteolízisét. Ez azt jelenti, hogy a tetraciklinek különböző mértékben mutatnak védőhatást az IRI-vel szemben.

A DIO hatása az IRI iránti szívizom toleranciára továbbra is ellentmondásos. Jelezték, hogy a szív IRI súlyosbodik azoknál az állatoknál, akiknek magas a zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízás. Ez összhangban áll az elhízott betegek fokozott érzékenységével a szívizom ischaemia iránti klinikai adatokkal [29]. Ezzel szemben más jelentések szerint a HFD paradox módon növelheti az IRI-vel szembeni szívrezisztenciát, aminek oka lehet az intracelluláris pH késleltetett normalizálása reperfúzió után [30,31]. Mivel ebben a vizsgálatban az in vivo modellben nem vizsgáltuk az IRI-vel szembeni szívizom toleranciát, csak arra a következtetésre juthatunk, hogy a DIO ebben a vizsgálatban nem volt hatással az izolált szívmodell II iránti szívizom toleranciájára.

Jelen tanulmánynak számos módszertani korlátja volt. Először az RT-PCR-t használták az "arany standard" metagenomikus elemzés helyett a mikrobiom jellemzésére. Ennek oka az volt, hogy projektünk jelenlegi szakaszában bizonyos baktérium nemzetségek és fajok célzott azonosítását kívántuk elvégezni. Másodszor, a TTC által közvetített kardioprotekciót nem külön-külön értékelték a DIO és a CIC csoportokban, hanem csak a mindkét patológiával rendelkező állatoknál. Harmadszor, a TTC által kiváltott kardioprotekció hátterében álló molekuláris mechanizmus (oka) t és annak elvesztését patkányokban DIO és CIC esetén sem vizsgálták. Jelenleg csak az infarktusméret, a mikrobiota összetétel és a plazma citokinszintek közötti összefüggéseket tárgyalhatjuk. Ezeknek a tényezőknek az infarktus méretkorlátozásában fennálló ok-okozati szerepét azonban további, a koncepciót igazoló vizsgálatokban kell megvizsgálni.

Összefoglalva, adataink megerősítik, hogy a TTC-nek kardioprotektív hatása van egészséges állatokban. Ez a hatás azonban megfordult a CIC-vel rendelkező elhízott állatoknál, ami a bél mikrobiotájának specifikus változásával, valamint a plazmában a citokinek és az LPS jelentősen megemelkedett szintjével járt. Eredményeink azt mutatják, hogy bizonyos antimikrobiális gyógyszereket nem szabad elhízott és egyidejűleg gyulladásos betegségekben szenvedő betegeknél alkalmazni. Ennek oka a szívizom sérülésének fokozott kockázata és a szívinfarktus kedvezőtlen kimenetele.