ACE fenotipizálás az emberi szívben

Szerepek Adatkúra, vizsgálat, módszertan, validálás

Társulási Vegyészeti Kar, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország, Bakulev Center for Cardiovascular Surgery, Moszkva, Oroszország

Szerepek Formális elemzés, Felügyelet, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

Társulási Vegyészeti Kar, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország, Bakulev Center for Cardiovascular Surgery, Moszkva, Oroszország

Szerepek Adatmegőrzés, vizsgálat, validálás

Társulási Vegyészeti Kar, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország, Bakulev Center for Cardiovascular Surgery, Moszkva, Oroszország

Szerepek konceptualizálás, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet

Hovatartozás Bakulev Center for Cardiovascular Surgery, Moszkva, Oroszország

Szerepek Adatmegőrzés, források

Hovatartozás Bakulev Center for Cardiovascular Surgery, Moszkva, Oroszország

Szerepek Adatmegőrzés, források

Hovatartozás Bakulev Center for Cardiovascular Surgery, Moszkva, Oroszország

Szerepek Formális elemzés, Finanszírozás megszerzése, Források

Arizonai Egyetem Egészségtudományi Egyetem, Tucson, Arizona, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, felügyelet, validálás, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Arizonai Egyetem Egészségtudományi Egyetem, Tucson, Arizona, Amerikai Egyesült Államok, Aneszteziológiai Tanszék, Illinoisi Egyetem, Chicago, Chicago, Illinois, Amerikai Egyesült Államok

Victoria E. Tikhomirova,
Olga A. Kost,
Olga V. Krjukova,
Elena Z. Golukhova,
Naida I. Bulaeva,
Aigerim Z. Zholbaeva,
Leo A. Bokeria,
Joe G. N. Garcia,
Szergej M. Danilov

Ábrák

Absztrakt

Az angiotenzin-konvertáló enzimet (ACE), amely számos peptidet metabolizál és kulcsszerepet játszik a vérnyomás szabályozásában és az érrendszer átalakításában, 1-es típusú membránglikoproteinként fejezzük ki a különböző sejtek, beleértve a szív endothelsejtjeit is. Feltételeztük, hogy a lokális konformáció és ezért a szív ACE tulajdonságai eltérhetnek a tüdő ACE-jétől, e szervek eltérő mikrokörnyezete miatt.

Módszerek és eredmények

ACE fenotipizálást (ACE szint, konformáció és kinetikai jellemzők) hajtottunk végre az emberi szívben, és összehasonlítottuk a tüdőben megfigyeltekkel. A szívszövetekben az ACE-aktivitás 10–15-gyel alacsonyabb volt, mint a tüdőben. Kimutatták, hogy mind a szív-, mind a tüdőszövetekben különféle ACE-effektorok, LMW endogén ACE-gátlók és HMW ACE-kötő partnerek vannak jelen. A szív ACE „konformációs ujjlenyomata” (azaz az ACE felületén lévő különböző epitópokhoz kötődő 17 mAb mintája) jelentősen különbözött a tüdő ACE-jétől, ami tükrözi ezen ACE-k helyi konformációinak különbségeit, amelyeket valószínűleg különböző ACE-glikoziláció szabályoz ezek a szervek. A szív és a tüdő ACE-k szubsztrátum-specifitása és pH-optimája is különbözött. Sőt, még a szívben is a látszólagos ACE-aktivitások, a helyi ACE-konformációk és az ACE-gátlók tartalma pitvarokban és kamrákban különbözik.

Következtetések

A szív és a tüdő ACE-jének helyi konformációiban és kinetikai tulajdonságaiban mutatkozó jelentős különbségek demonstrálják az ACE szövetspecifikumát, és strukturális bázist biztosítanak a szív- és tüdő-ACE-k megkülönböztetésére alkalmas mAb-k kifejlesztésére, mint potenciális vérvizsgálat a pitvarfibrillációs kockázat előrejelzésére.

Idézet: Tikhomirova VE, Kost OA, Krjukova OV, Golukhova EZ, Bulaeva NI, Zholbaeva AZ és mtsai. (2017) ACE fenotipizálás az emberi szívben. PLoS ONE 12 (8): e0181976. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181976

Szerkesztő: Michael Bader, Max Delbruck Centrum fur Molekulare Medizin Berlin Buch, NÉMETORSZÁG

Fogadott: 2017. április 17 .; Elfogadott: 2017. július 10 .; Közzétett: 2017. augusztus 3

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a munkát az Orosz Föderáció Tudományos és Oktatási Minisztériuma támogatta [támogatás száma 14.Z50.31.0026].

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Rövidítések: ACE, angiotenzin-konvertáló enzim; AF, pitvarfibrilláció; FA-, furanakrilil-; HHL (Hip-His-Leu), hippuril-L-hisztidil-L-leucin; HMW, nagy molekulatömeg; LMW, alacsony molekulatömegű; PTM, fordítás utáni módosítások; RAS, renin-angiotenzin rendszer; ZPHL (Z-Phe-His-Leu), karbobenzoxi-L-fenil-alanil-L-hisztidil-L-leucin

Bevezetés

A pitvarfibrilláció (AF) a leggyakoribb szívritmuszavar, amely jelentős kardiovaszkuláris morbiditást és mortalitást okoz [1]. Bár kockázati tényezőket írtak le, az AF kockázat előrejelzéséhez nincsenek elérhető vérvizsgálatok.

A renin-angiotenzin rendszer (RAS) aktiválása végérvényesen fontos szerepet játszik a pitvarfibrilláció patogenezisében [2–4]. Az angiotenzin II a RAS elsődleges mediátora, amelyet főleg angiotenzin I-ből állít elő angiotenzin-konvertáló enzim (ACE, EC 3.4.15.1, CD143). Ismert, hogy az AF-ben szenvedő betegeknél az ACE-expresszió megnövekedett a szívszövetben, különösen a pitvarokban [2]. A transzgénikus egereken végzett tanulmány azt is kimutatta, hogy a megnövekedett ACE-expresszió a szívben oka lehet az AF-nek és a hirtelen szívhalálnak [5]. Az ACE-gátlók és az angiotenzin-receptor blokkolók is csökkentik az AF előfordulását, és megakadályozhatják az AF-hez kapcsolódó szövődményeket a betegeknél és a kísérleti modellekben is [3].

Az ACE egy Zn 2+ peptidildipeptidáz, amely kulcsszerepet játszik a vérnyomás szabályozásában az angiotenzin II termelésével és a bradikinin lebontásával, valamint a vaszkuláris, ezen belül a szív, a patológia és az átalakítás kialakulásával. Az ACE konstitutív módon expresszálódik az endoteliális és néhány hámsejt felszínén, valamint az immunrendszer sejtjei (makrofágok, dendritikus sejtek) [6,7]. Az ACE expresszióját a normális és kóros emberi szívekben korábban tanulmányozták [8,9]. A mai napig számos új szubsztrátot azonosítottak az ACE számára (AcSDKP, angiotenzin 1–7), és új funkciókat javasoltak az ACE számára, mint például a sejten belüli jelátvitel, az antigén bemutatása [10–12]. Az ACE szubsztrátjának, az AcSDKP anti-fibrotikus és gyulladáscsökkentő hatása különösen fontosnak tűnik az AF patogenezise szempontjából azoknál a betegeknél, akiknek megnövekedett a szív ACE-szintje [13].

Annak ellenére, hogy az RAS-aktiváció szorosan összefügg az aritmiákkal, az ACE plazmaszintje nem korrelál az AF-vel és a kamrai aritmiákkal. Általában a plazma ACE pontosan tükrözi a szöveti ACE szintjét [14]. A vér ACE az endothel sejtekből származik, főleg a tüdőkapillárisokból, amelyek csaknem 100% -os ACE-expressziót mutatnak, szemben a szisztémás keringésben csak 5–15% -os ACE-pozitív kapillárisokkal [15]. Ennek alapján becslésünk szerint a szívkapillárisokból leadott ACE a vér teljes ACE-jének legfeljebb 1% -át képviselheti. Ezért tűnik úgy, hogy a betegek teljes plazma ACE-szintje nem prediktív paraméter az AF-ben szenvedő betegek számára. Mivel azonban a pitvari ACE háromszorosára nő az AF-ben szenvedő betegeknél [2], a határozott szívből származó ACE (főleg pitvarból származó ACE) mennyiségi meghatározása a plazmában elméletileg felhasználható prediktív tesztként az AF kockázatára.

Bebizonyítottuk, hogy az ACE konformációja sejt- és szövetspecifikus, és valószínűleg az enzim különböző glikozilezéséből fakad, tüdő endothelsejtjeiből származó ACE példáján, szemben a makrofágok ACE-jével és a sarcoid granuloma dendritikus sejtjével [16], valamint az ACE-től. a prosztata hámsejtjei [17]. Az ACE-konformációs ujjlenyomat, amely az mAb-készlet különböző epitópokhoz való kötődésének mintáján alapul az ACE felületén [16], ezért potenciálisan lehetővé teszi azon sejtek/szervek nyilvánosságra hozatalát, amelyekből az ACE származik.

Ezt a megközelítést alkalmaztuk itt, hogy bemutassuk az emberi szívből és a tüdőből származó ACE-k konformációs különbségeit, és különbségeket mutattunk a tisztított ACE-k, a szöveti homogenizátumokban lévő ACE-k és az in vivo perfúzió után a vér ACE-i között. Úgy gondoljuk, hogy ezek a különbségek lehetővé teszik olyan monoklonális antitestek (mAb) előállítását, amelyek képesek megkülönböztetni a vérkeringésbe leadott ACE-ket ettől a két szervtől, és ezért képezik az alapját a vérvizsgálatnak az AF kockázatának előrejelzéséhez.

Kísérleti szakasz

Különböző forrásokból származó ACE-k

A munkát az Orvosi Világszövetség Etikai Kódexének (Helsinki Nyilatkozat) összhangban hajtották végre, és a Moszkvai Állami Egyetem Bakulev szív- és érrendszeri sebészeti központjának és a chicagói Illinois-i Egyetem intézményi felülvizsgálati testületei jóváhagyták. Egyik donor sem volt a kiszolgáltatott populációból, és az összes donor vagy a rokon nem adott írásbeli, tájékozott beleegyezést, amelyet szabadon megadtak. Emberi citrált plazma- és szövethomogenizátumok (1: 9, és bizonyos esetekben 1: 3 w/v arány) 10 donorból (öt férfi donor, 54–66 éves és öt női donor, 28–68 évesek), közülük három pitvarfibrillációs donorokat használtunk szomatikus ACE-k forrásaként. A tüdő és a szív ACE-jeit szövethomogenátumokból tisztítottuk anioncserélő kromatográfiával DEAE-Toyopearl 650M-en, majd lisinopril affinitáskromatográfiával - a [18] „S1 táblázat” szerint. A megtisztított ACE-készítmények 7,5% SDS-PAGE 7,5% -os SDS-PAGE-val végzett elektroforézissel homogénnek bizonyultak „S1 ábra”.

ACE aktivitás vizsgálat

Az ACE aktivitást a vérplazmában, az emberi szervek homogenátumaiban vagy a szívkamrák homogenátumaiban két ACE szubsztráttal, 2 mM Z-Phe-His-Leu (ZPHL) és 5 mM Hip-His-Leu (HHL) fluorimetriás vizsgálattal mértük [ 19]. Az ACE aktivitás gátlását az antikatalitikus 5F1 mAb-vel az ACE N-doménjéig és az 1E10 mAb-t a C-doménig 100 μg/μl és 10 μg/μl-es mAb-koncentrációknál hajtottuk végre, 1 mM ZPHL vagy 2,5 mM HHL szubsztrátként.

Az ACE szubsztrátum-specifitása

Számos szintetikus tripeptid szubsztrát és természetes szubsztrát dekapeptid angiotenzin I tisztított emberi szív és tüdő ACE-vel végzett hidrolízisének kinetikai paramétereit 0,05 M foszfátpufferben, pH 7,5, 0,15 M NaCl és 1 μM ZnCl2 tartalommal, 25 ° C-on határoztuk meg. A Z-Phe-His-Leu, Hip-His-Leu és az angiotenzin I enzimatikus hidrolízisének sebességét fluorimetriásan határoztuk meg, míg az FA-tartalmú szubsztrátok, az FA-Phe-Gly-Gly és az FA-Phe Phe-Arg-ot spektrofotometriásan vizsgálták [20].

Az ACE immunológiai jellemzése (lemez immunprecipitációs teszt)

Kilencven hat lyukú lemezt (Corning, Corning, NY) kecske anti-egér IgG (Pierce, Rockford, IL) hídon keresztül [21] anti-ACE mAb-kel vontunk be, és különböző ACE-forrásokkal inkubáltunk, amelyeket egyensúlyba hoztunk az ACE-aktivitás szempontjából. . A meg nem kötött ACE lemosása után lemezhez kötött ACE aktivitást mértünk az ACE szubsztrátumának, a Z-Phe-His-Leu-nak a lyukakba való közvetlen hozzáadásával [21]. Tizenhat mAb-t termeltünk emberi ACE-ként laboratóriumunkban [16], míg a BB9 mAb-t Paul J. Simmons (akkori Brown Foundation of Molecular Medicine, Texasi Egyetem Egészségtudományi Központja, Houston, TX, USA).

Az emberi plazma, valamint a szív és a tüdő homogenizátumainak dialízise és szűrése

A szív és a tüdő homogenizátumainak dialízisét 10 kDa dialízis kazettákban (Pierce, Rockford, IL) és 100 kDa Biotech dialízis csövekben (Spectrum Inc., Houston, TX) végeztük 0,05 foszfátpufferrel, pH 7,5, 0,15 M NaCl és 1 μM ZnCl2, 4 ° C-on. A homogenizátumok szűrését Vivaspin szűrőmembránokon (GE Healthcare, Sartorius Corp., Csehország, NY) végeztük 30 kDa és 100 kDa határértékekkel 12 000 g-nál.

Aminopeptidáz aktivitás

A szöveti homogenizátumok különböző hígítású aminopeptidáz aktivitását 0,01–0,1 mM His-Leu hidrolízis sebességével becsültük PBS-BSA pufferben, pH 8,3, 37 ° C-on.

ACE perfúzió patkányokban

Valamennyi in vivo patkánymódszert/kísérletet a Moszkvai Állami Egyetem Állatkísérleti Etikai Bizottságának irányelvei és előírásai szerint hagyták jóvá, és azok megfelelnek az NIH irányelveknek (Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és felhasználásához). Felnőtt hím Wistar patkányok súlya

300 g-ot kórokozóktól mentes állapotba helyeztünk fűrészporos ágyneművel ellátott, egyedi műanyag ketrecekben, légkondicionált helyiségben állandó hőmérsékleten (23 ± 1 ° C) és 70% -os páratartalom mellett. A patkányokat vízzel és szokásos táplálékkal láttuk el (LabDiet, 5053 (LabDiet; St. Louis, MO, USA)) ad libitum. Valamennyi állatot a kísérlet előtt napi egy héten keresztül naponta ellenőriztük a test egészsége szempontjából. Minden erőfeszítést megtettünk a patkányok szenvedésének minimalizálása érdekében. Megtisztított emberi szív és tüdő ACE-ket, 1000 mU 100 μl-ben (pH 7,4) injektáltunk patkányok farokvénájába (csoportonként két patkány) ketoprofennel végzett érzéstelenítéssel. 30 perc elteltével az eutanáziát lefejezéssel hajtjuk végre, a vért összegyűjtjük és citrát plazmát készítünk. Ebben a pillanatban az emberi ACE körülbelül 30% -a még mindig patkányvérben volt. A humán ACE patkány plazmából való mAb-készlettel történő ACE-re történő kicsapását a fent leírtak szerint hajtottuk végre, de a patkány ACE nyomának kicsapódását ezen mAb-k korrigálták.

Statisztikai analízis

Minden adat átlag ± SEM. A szignifikanciát a STATISTICA 6-tal (StatSoft, Inc., OK) végzett Mann-Whitney-teszt alkalmazásával elemeztük.

Eredmények és vita

Az ACE aktivitása az emberi szívben

Becsültük meg az ACE expresszióját a különböző emberi szövetekben, nevezetesen a szívben, a tüdőben, a vesében és a lépben, összehasonlítva az ACE aktivitását e szövetek homogenátumaiban, valamint az emberi citrált plazmában. Az emberi szív homogenizátumában az ACE-aktivitás (mU/gramm szövetben kifejezve) körülbelül háromszorosa volt, mint az emberi plazmában, és 8-12-szer kisebb, mint az emberi tüdőben (1. ábra). Ez a becslés korrelál az emberi szív és a tüdő radioligand ACE-gátló kötődési helyeinek sűrűségével [22], valamint a tüdőben magas ACE RNS transzkripcióval, míg a szívben elhanyagolható, mint a Humán Protein Atlasban [23].

10 donor és a citrált plazma szövethomogenátumainak ACE-aktivitását 2 mmól/l ZPHL-t és 5 mM HHL-t tartalmazó szubsztrátként spektrofluorimetriás vizsgálattal határoztuk meg. A homogenátumokat 1: 9 arányban (tömeg/térfogat) állítottuk elő, majd további 1/10 arányban hígítottuk a feltételezett endogén ACE-gátlók és LMW ACE-effektorok hatásának minimalizálása érdekében. A plazmát 1: 4 arányban PBS-sel hígítottuk. Az adatokat mU/gramm szövetben (homogenizátumok esetén) vagy hígítatlan plazma ml-ben fejezzük ki, p 2. ábra. A hígítás hatása a látszólagos ACE-aktivitásra a szív és a tüdő homogenizátumaiban.

Az ACE-aktivitást 10 donor szív- és tüdőhomogenátumában mértük különböző hígításokban, két szubsztrát, ZPHL és HHL alkalmazásával (mint az 1. ábra jelmagyarázatában). Az adatokat hígítatlan homogenizátumok ACE-aktivitásának% -ában fejezzük ki (A, B), valamint a ZPHL/HHL arány% -a a hígítatlan homogenizátumok arányától (C,D). Mindegyik érték több (2–3) kísérlet átlaga duplikátumokban, p 3. ábra. Különböző ACE-k konformációs jellemzői.

A szív és a tüdő ACE-jének konformációs ujjlenyomatát 17 mAb-vel végeztük a két doménes ACE-vel. Tisztított ACE-oldatok immunprecipitált ACE-aktivitása (A), 10 donor szövethomogenátumai (B), vagy ACE-k a patkány vérkeringésébe történő perfúzió után (C) a szív ACE% -ában („kötési arány”) vannak megadva, a tüdő ACE-jétől. A több mint 20% -kal megnövekedett arányokat narancssárga színnel, több mint 50% -ot sötét narancssárgával, több mint 200% -ot piros színnel emelik ki, míg a csökkent csökkenést több mint 20% -kal sárga, több mint 50% -ot mélykék színnel emelik ki. Az adatok legalább 3 kísérlet átlagai (SD) (mindegyik két példányban), p. 4. ábra. ACE-effektorok a szív- és tüdőszövetekben.

A szív és a tüdő ACE-jének konformációs ujjlenyomat-felvételét 17 mAb-től ACE-készlettel végeztük, mint a 3. ábra jelmagyarázatában. Immunprecipitált ACE-aktivitás a szív és a tüdő ACE -inek anioncserével és affinitáskromatográfiával történő tisztítása után (A, B), dialízis után (C, D) és a szűrést 100 kDa határértékű szűrőn (E, F) a szülőhomogenátumok immunprecipitált ACE-aktivitásának% -ában („kötési arány”) jelenik meg. A több mint 20% -kal megnövelt arányok narancssárgával, több mint 50% -kal sötét narancssárgával, és több mint 100% -kal vörös színnel vannak kiemelve. Az arányok több mint 20% -kal csökkentek sárga színnel, több mint 50% -kal mélykékkel. Az adatok 2–3 kísérlet átlagai ± SD (mindegyik két példányban), p 5. ábra. Az ACE aktivitás függése a pH-tól.

A megtisztított szív és tüdő ACE-k aktivitásának vizsgálata 0,5 mM Z-Phe-His-Leu (A) és 1,3 mM Hip-His-Leu (B) 25 mM acetát-MES-Tris-borát pufferben végeztük, amely 0,15 M NaCl-ot és 1 μM ZnCl2-t tartalmazott. Minden érték több (2–3) kísérlet duplikátumban adott átlaga.

Az 5F1 antikatalitikus mAb [21] N-doménre, az 1E10 és 4E3 mAb-k a C-doménre kifejtett gátló hatása [36], miközben ezek az mAb-k eltérően kötődnek a szív és a tüdő ACE-jéhez (3A. És 3B. Ábra), nem mutatta ki azonban jelentős különbség van e két ACE gátlásának mértékében (nem látható).

Számos szintetikus szubsztrát, valamint egy természetes szubsztrát angiotenzin I hidrolízisének kinetikai paramétereit, tisztított szív- és tüdő-ACE-k segítségével, az 1. táblázat mutatja be. A szubsztrátok közül kettőt, Z-Phe-His-Leu és A Hip-His-Leu az angiotenzin I C-terminális analógjai, míg egy szubsztrát, amelynek C-terminálisán Phe-Arg van, egy másik természetes ACE szubsztrát, a bradikinin, valamint a C-terminális C-terminális analógjának tekinthető. az atriopeptin 2 analógja.