Alkoholos és magas zsírtartalmú étrend által kiváltott krónikus hasnyálmirigy-gyulladás egérmodellje

T. Clinkinbeard 1, 2 , R. H. Kline 2 , L.P. Zhang 2 , S.L. McIlwrath 2 , J. F. Watkins 1 , K.N. Westlund 2, *

Cikk információk

Azonosítók és oldalszám:

Cikktörténet:

nyílt hozzáférésű licenc: Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Attribution 4.0 nemzetközi nyilvános licenc (CC-BY 4.0) feltételei szerint terjesztenek, amelynek egy példánya a következő címen érhető el: (https://creativecommons.org/licenses//4.0/legalcode). Ez a licenc korlátlan felhasználást, terjesztést és sokszorosítást tesz lehetővé bármely adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra kerül.

Absztrakt

Háttér/Célok:

Az akut hasnyálmirigy-gyulladás kémiailag indukált rágcsáló modelleken végzett vizsgálata hasznos adatokat szolgáltatott; alkoholos krónikus hasnyálmirigy-gyulladás modelljei nem állnak rendelkezésre egereknél. Jelen tanulmány célja a kizárólag alkoholos és magas zsírtartalmú (AHF) diétával kiváltott krónikus pancreatitis egérmodelljének jellemzése.

Mód:

Az egereket folyékony, magas zsírtartalmú étrenddel etették, amely 6% alkoholt, valamint magas zsírtartalmú étrend-kiegészítést (az összes étrendi zsír 57% -a) tartalmazott öt hónapon keresztül, vagy kontrollként, normál chow ad libitum. A fájdalomindexként használt fájdalommal kapcsolatos intézkedések között szerepelt a hátsó mancsok mechanikus érzékenysége, amelyet von Frey-filamentumok és sima/érdes textúrájú lemez segítségével határoztak meg. A módosított főzőlap-teszt információkat szolgáltatott a zsigeri túlérzékenységre adott magasabb rendű viselkedési válaszokról. Az egereken mechanikai és termikus vizsgálatokat végeztek, mind perifériásan korlátozott μ-opioid receptor agonistával, loperamiddal végzett farmakológiai kezeléssel, mind anélkül.

Eredmények:

Az AHF-diétát folytató egerek mechanikus és hő túlérzékenységet, valamint krónikus hasnyálmirigy-gyulladásra utaló fibrotikus szövettani vizsgálatot mutattak. Az alacsony dózisú, periférián korlátozott opiát-loperamid mind a mechanikai, mind a hő túlérzékenységet gyengítette.

Következtetés:

Az alkohollal és magas zsírtartalmú étrenddel etetett egerek szövődményt fejlesztenek ki, amely megfelel a krónikus hasnyálmirigy-gyulladásnak, valamint az opioid-érzékeny mechanikai és hőérzékenység.

1. BEMUTATKOZÁS

2004-ben az Egyesült Államokban a hasnyálmirigy-gyulladás becsült 373,3 millió dollár közvetlen és közvetett költségbe került [1]. 100 000 emberből nyolcnál diagnosztizálnak krónikus hasnyálmirigy-gyulladást az Egyesült Államokban évente [2], és ezen személyek legfeljebb 50% -a élhet 20 évvel a diagnózis után [3]. 100 000 ember közül ötvenen élnek krónikus hasnyálmirigy-gyulladásban [4, 5]. Ezen betegek közül sokan súlyos, kezelhetetlen fájdalmat szenvednek el.

Az embereknél a krónikus hasnyálmirigy-gyulladás kialakulása számos lehetséges járulékos kockázati tényező következménye lehet, amelyek egyike az alkohol szenzibilizáló hatása a hasnyálmirigy sejtjeire [6]. Az alkohol által aktivált helyi hasnyálmirigy-reaktív immunsejtek, a csillagképes sejtek és kölcsönhatásuk más hasnyálmirigy- és behatoló immunsejt-típusokkal hozzájárulnak az extracelluláris mátrixfehérjék túltermeléséhez és a hasnyálmirigy működését zavaró krónikus hasnyálmirigy-gyulladás patogeneziséhez [7-10]. Ez a túltermelés akkor fordul elő, amikor a hasnyálmirigy stellátum sejtjei megpróbálják helyrehozni a sérült hasnyálmirigy sejteket [11]. Felmerült, hogy a magas alkoholszint csökkenti a fehérjék oldhatóságát a duktális térben, ami a csatornák eldugulásához és az azt követő hasnyálmirigy-emésztéshez vezet [3].

Az Emésztési Betegségek Országos Bizottsága (NCDD) az Országos Cukorbetegség és Emésztési és Vesebetegségek Intézetének (NIDDK) égisze alatt értékeli a jobb állatmodellek előállítását a krónikus hasnyálmirigy-gyulladás tanulmányozásának elősegítésére [12, 13]. Jelenleg nem léteznek olyan egérmodellek, amelyekben a krónikus hasnyálmirigy-gyulladást csak ad libitum, magas zsírtartalmú folyékony étel, hozzáadott alkohol és zsírsav kiegészítés kombinációjával indukálják. A kémiai irritáló anyagok, például a cerulein vagy a dibutil-ón-diklorid (DBTC) által kiváltott pancreatitis jelenlegi rágcsálómodelljei eredményesnek bizonyultak az akut hasnyálmirigy-gyulladás vizsgálata során [14]. Az akut modellek azonban nem adják meg a klinikán látható krónikus hasnyálmirigy-gyulladás tüneteinek körét, amelyet hajlamosító kockázati tényezők okoznak. Hasonlóképpen, egy krónikus modell alkalmasabb a hosszú távú, gyengítő krónikus hasnyálmirigy-gyulladás fájdalmainak kezelésére.

Jelen tanulmányban alkohol és magas zsírtartalmú étrend (AHF) által indukált krónikus hasnyálmirigy-gyulladás modelljét írják le módosított Lieber-DeCarli [15] diéta alapján, amely 6% etanolt, hozzáadott kukoricaolajat és kiegészítő zsírzsírt tartalmaz. Ezt az étrendet patkányokban nagy sikerrel alkalmazták krónikus hasnyálmirigy-gyulladás kiváltására 4-5 héten belül, ezt igazolták a hasnyálmirigy szövettana és a fájdalommal kapcsolatos viselkedési vizsgálatok [16 - 19]. Jelen tanulmány célja (1) egy étrend által kiváltott krónikus hasnyálmirigy-gyulladás modell előállítása az AHF-et tápláló egerekben, és (2) az ebből eredő fájdalommal kapcsolatos viselkedés és hasnyálmirigy-patológia jellemzése. A krónikus alkoholos hasnyálmirigy-gyulladás kórszövettani megerősítése magában foglalta a jelentős hasnyálmirigy-fibrózis, a zsírvakuolizáció és a rossz sejtfelépítés bizonyítékát. Az egér krónikus hasnyálmirigy-gyulladásos modelljében a perifériásan korlátozott opiáttal, a loperamiddal végzett antagonizmus után a fájdalommal kapcsolatos mechanikai és hő túlérzékenységi magatartás gyengült.

2. MÓDSZEREK

A vizsgálatokat az Országos Egészségügyi Intézet által kiadott, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató szerint hajtották végre. Az összes eljárást a Kentuckyi Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

2.1. A hasnyálmirigy-gyulladás kiváltása

Öt hónapos hím egereket használtak C57BL/6 háttérrel, amelyek kevesebb mint 40 g voltak (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Az állatokat 21-24 ° C-on, fordított fényben, sötét 14: 10-órás ütemben tartottuk. A kontroll egereket 10,4% zsírtartalmú rágcsáló chow-val etettük (Mouse Breeder Diet 8626, Teklad, Madison, WI, USA). Az AHF hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedő egereket folyékony táplálékkal (LD101A, Test Diet, Richmond, IN, USA) etettük, hozzáadott kukoricaolajjal (3,3%, 33/1000 g) és kiegészítő szalonnazsírral, amelyet naponta egy fűszeres tálban adtunk (1 g). A teljes zsírtartalom

57%. A folyékony étrendben lévő alkoholt hetente 0-ról 4% -ra, 5% -ra, majd 6% -ra emelték. Az AHF-vel táplált egereket a vizsgálat további részében 6% alkoholtartalom mellett tartottuk. A testtömeget hetente ellenőriztük.

2.2. A fájdalommal kapcsolatos viselkedések értékelése

2.2.1. Mancs kivonási küszöb tesztelése

Az egereket egy megemelt teflon drótfenekű asztalra tettük Plexi üveg fülkékben (7 x 4 x 4 cm), és 30 percig akklimatizáltuk. Von Frey-szálak ((4,74) 6,0 g; (4,31) 2,0 g; (4,08) 1,0 g; (3,61) 0,4 g; (3,22) 0,16 g; (2,83) 0,07 g; (2,36) 0,02 g; (1,65) 0,008 g)) felvittük a hátsó mancsok talpi felületére, a korábbiakban leírtak szerint a mechanikai elvonási küszöb meghatározásához [17-20]. A mancs visszavonási küszöbének csökkenése a mechanikus túlérzékenységre utal.

2.2.2. Sima vagy durva mechanikus lemez

A vizsgálati készülék egy átlátszó plexiüveg dobozból (11 x 8 x 8 cm) állt, sima padlóval vagy durván texturált padlóbetéttel. A durva betét egy polisztirol mennyezeti lámpatest diffúzor texturált oldala volt (Cat. # 89091, Lowes, Mooresville, NC, USA). A felderítő tevékenységet, beleértve a gyakoriságot és az időtartamot, valós időben követtük nyomon, és 5 perces tesztek során egyedi szoftverrel rögzítettük.

2.2.3. Módosított 44 ° C-os főzőlap-vizsgálat

Az egereket 10 percre 38 ° C-os főzőlapra helyeztük, hogy lassan előmelegítsük az állatok lábát. Ezután az állatokat 44 ° C-os főzőlapra helyeztük egy 10 perces tesztidőszakra [21]. Az ugrások, a nevelési események számát és az első ugrás késését az egyedi szoftver segítségével rögzítettük.

2.3. Vizsgálati gyógyszerek

2.3.1. Mu-opioid-receptor agonista

A loperamidot (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA) 2-hidroxi-propil-P-ciklodextrin (Sigma-Aldrich) sóoldatban készített 20% -os oldatában szuszpendáljuk és a megfelelő dóziskoncentrációra hígítjuk. A loperamid injekciókat intraperitoneálisan (i.p.) 0,4, 0,6, 0,8 vagy 1,2 mg/kg dózisban végeztük. A viselkedésvizsgálatok 60 perccel az injekció beadása után kezdődtek [1, 22].

2.4. Szövettan

Az egereket transzkardiálisan 4% paraformaldehiddel (PFA) perfundáltuk, a pancreata-t pedig egy éjszakán át kivágtuk és utólag rögzítettük, majd 70% -os etanolra cseréltük. A hasnyálmirigy szöveteit paraffinba ágyaztuk, motoros mikrotómával (Microm 350; Heidelberg, Németország) metszettük (10 μm), és üveglemezekre helyeztük.

2.4.1. Sirius vörös festés a kollagén számára

A hasnyálmirigy metszeteket deparaffinizáltuk, rehidratáltuk és Sirius Red-tel (0,1%; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) és Fast Green ellenfestéssel festettük. Nikon Eclipse E1000 mikroszkópot használtunk 20-szoros objektívvel, állatonként öt szakaszból álló véletlenszerű képek rögzítésére az ACT-1 szoftver segítségével. Számítógéppel segített densitometriát (NIH ImageJ) alkalmaztunk a Sirius Red által vörösre festett fibrotikus szövetek százalékos arányának kiszámításához.

2.4.2. Hematoxilin és eozin (H&E) festése

A deparafinizált tárgylemezeket csapvízben öblítettük, és 1 percig festettük 0,1% hematoxilinnel (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). A tárgylemezeket mostuk, dehidratáltuk és 1 percig festettük 0,1% eozinnal, mielőtt a fedél átcsúszott volna a Permount-tal (Fisher Scientific).

Minden hasnyálmirigy fotomikrográfiáját 5 véletlenszerűen kiválasztott szakaszból vettük, és elemeztük morfológiai változásokat.

2.5. Statisztikai analízis

Az adatokat átlagként ± S.E.M. A különböző időpontokban vagy különböző dózisú csoportok közötti összehasonlításokat kétirányú varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük, amelyet Tukey többszörös összehasonlítása követett a SigmaPlot 12.0 verzió (Systat Software, San Jose California, USA) segítségével végzett tesztek utáni tesztekkel. Kétfarkú t-próbákat alkalmaztunk, ahol szükséges. A p≤0,05-et szignifikánsnak tekintették.

3. EREDMÉNYEK

3.1. A krónikus AHF táplált egereknél fokozódott a fibrózis és a szövettan összhangban van a krónikus hasnyálmirigy-gyulladással

Az AHF-el táplált egerek hasnyálmirigy-szövettana a krónikus hasnyálmirigy-gyulladásban gyakori morfológiai rendellenességeket mutatott: sejtes atrófia, adipociták és megnövekedett intralobuláris terek. 1B , C , E ), összehasonlítva a kontroll egerek hasnyálmirigy szöveteivel (1. ábra). 1A , D ). Az AHF-vel táplált egerek hasnyálmirigy-szövetében lipid vakuolák zsíros beszivárgásai voltak láthatóak. Mindkét csoportnak daganatszerű szerkezete volt (1. ábra). 1C ).

Az AHF-vel táplált egerek hasnyálmirigy szövetmintáiban szignifikánsan megnövekedett Sirius vörös foltos fibrózist azonosítottak a kontrollokkal összehasonlítva (ábra. 1F ) (kontroll: 5,5 ± 1,2%, AHF: 21,0 ± 2,7%; p

3.2. Az állatok krónikus táplálású AHF-diétával mechanikus túlérzékenységet fejlesztettek ki

A másodlagos mechanikus túlérzékenységet úgy értékeltük, hogy meghatároztuk a spontán menekülési magatartásokat (nevelési események és nevelési időtartam) egy sima vagy érdes felületen, valamint teszteltük a hátsó mancs visszahúzási küszöbeit (ábra. 2 ). Durva felületen az AHF-táplálékkal etetett állatok lényegesen nagyobb szökési nevelési viselkedést mutattak (AHF [n = 6]: 38,8 ± 3,5; kontrollok [n = 7]: 26,0 ± 4,2; p 2A , B ). Az spontán menekülési viselkedésben nem észleltek különbségeket, amikor az állatokat sima felületen tesztelték (nevelési események: AHF: 31,8 ± 4,2; kontrollok: 24,5 ± 5,5; nevelési idő: AHF: 33,0 ± 5,4 s; kontrollok: 23,5 ± 5,6 s). Hasonlóképpen, az AHF-el táplált egerek hátsó mancsának mechanikai visszavonási küszöbértéke szignifikánsan csökkent (0,49 ± 0,16 g), összehasonlítva a von Frey-rostvizsgálat kontrolljaival (1,33 ± 0,23 g; p 2C ).

3.2.1. Egyadagos Loperamid attenuált-mechanikus túlérzékenység

A loperamid perifériásan korlátozott mu-opioid agonista, amelyet általában hasmenés elleni szerként alkalmaznak. Az AHF-táplálékkal etetett állatok szisztémásán loperamidot (0,6 mg/kg, i.p.) kaptak, és meghatározták a mancs megvonási küszöbértékeit. 2D ). A mechanikus túlérzékenység jelentősen megfordult 1 óra elteltével (AHF + Loperamid [n = 6]: 0,93 ± 0,33 g; AHF + VEH [n = 4] 0,24 ± 0,10 g) és 2 órán át (AHF + Loperamid: 1,10 ± 0,35 g; AHF + VEH 0,15 ± 0,10 g) az injekció beadásának időpontja, az injekció előtti szintre való visszatérés 3 órával.

3.3. Az AHF táplált egerek hőérzékenységet okoztak

A módosított főzőlapon a kísérleti állatokat az analgeziométerre helyeztük, és a hőérzékenység meghatározása céljából feljegyeztük az 5 perces vizsgálati periódus alatti tenyésztési események számát. A módosított 44 ° C-os főzőlap-teszt alkalmazásával az AHF-vel táplált egerek lényegesen többet nevelkedtek, mint a kontroll állatok (AHF: 59,8 ± 7,5; kontroll: 32,8 ± 1,4; p 3A ). 38 ° C-on nem észleltek különbséget a két csoport között; az AHF-et tápláló egerek 23,0 ± 6,7, a kontrollállatok pedig 19,8 ± 8,0-szor.

3.3.1. Loperamid dózistól függően gyengített nokifenzív válaszok a 44 ° C-os módosított főzőlap-tesztben

Az AHF-táplálékkal etetett egereket egyetlen alacsony dózisú loperamiddal (i.p.) kezeltük, és a hőérzékenységet 1 órával később mértük a módosított 44 ° C-os főzőlap segítségével (ábra. 3B ). A szisztémás loperamid dózisfüggően csökkentette a nevelési eseményeket (0,4 mg/kg: 36,5 ± 4,9; 0,8 mg/kg: 31,3 ± 4,3 esemény; 1,2 mg/kg: 27,7 ± 5,3). Csak a loperamid legnagyobb koncentrációja volt képes jelentősen csökkenteni a nevelési események számát (p

4. MEGBESZÉLÉS

Jelen tanulmány egy nem invazív, alkoholos és magas zsírtartalmú étrend által kiváltott krónikus hasnyálmirigy-gyulladás egérmodelljét mutatta be, amelyet vad típusú egerekben termeltek káros vegyi anyagok hiányában. Az AHF diétamodell kimutatta a szövettan és a fájdalommal kapcsolatos viselkedést, amelyek nagyon hasonlítanak a krónikus hasnyálmirigy-gyulladás klinikai tüneteihez, amint azt az NCDD és a NIDDK nemrégiben felszólította [12]. A klinikán a krónikus hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedő betegek akár 70% -a is visszaél az alkohollal, és a hasnyálmirigy-gyulladás kockázata megduplázódik túlsúlyos és elhízott személyeknél [11, 23]. Az AHF egérmodell olyan étrendet alkalmaz, amely magas zsírtartalmú alkoholt tartalmaz, így „kettős találatot” vált ki az állat anyagcseréjében. Ez megzavarja a homeosztázist, krónikus hasnyálmirigy-gyulladást és fájdalommal kapcsolatos viselkedést eredményez.

A hasnyálmirigy-metszetek szövettani elemzése megállapította, hogy csak az AHF-étrend indukálta a fibrózist, a rossz sejtfelépítést és a zsír-vakuol képződést, hasonlóan a patkányokkal végzett korábbi vizsgálatainkhoz [17 - 19, 24]. Az AHF-vel táplált egerek hasnyálmirigy-szakaszaiban a fibrotikus szövetek mennyisége szignifikánsan megnőtt, összehasonlítva az életkornak megfelelő vad típusú mintákkal. A megnövekedett fibrózis a krónikus hasnyálmirigy-gyulladásban gyakori jellemző, amelyet a hasnyálmirigy stellát sejtjeinek (PSC), a hasnyálmirigy helyi immunsejtjeinek túlaktiválása okoz [7]. Alkohol-metabolitok és felesleges zsírsav jelenlétében a nyugalmi állapotban lévő PSC-k aktiválódnak [24]. A PSC-k tartós túlaktiválása túlzott kollagéntermelést okoz, ami széleskörű hasnyálmirigy-fibrózist és a krónikus hasnyálmirigy-gyulladásban megfigyelhető jellegzetes károsodást eredményez. A megnövekedett fibrotikus hasnyálmirigy-szövet az AHF-vel táplált egerekben a krónikusan túlaktivált PSC-k indikátoraként értelmezhető egérmodellünkben.

A viselkedési mechanikai és hő túlérzékenységet 7 hét után határoztuk meg AHF-vel táplált egerekben, és a kísérlet végéig tartott. Az AHF-vel táplált állatok szignifikánsan megnövekedett menekülési viselkedést mutattak egy durva tesztfelületről és csökkentették a mancs visszahúzási küszöbértékét a kontrollokhoz képest. Ugyanakkor az AHF-vel táplált állatok jobban reagáltak a hőre, és gyakrabban próbáltak elmenekülni a 44 ° C-os módosított főzőlapról, mint a kontroll egerek. Az alkohol és a zsírsav anyagcseretermékei nemcsak a PSC-ket aktiválják, hanem közvetlenül érzékenyítik a hasnyálmirigyet innerváló nociceptorokat is, ezáltal fájdalommal járó viselkedést váltanak ki. Különösen a tranziens receptor-potenciál (TRP) csatornákat, amelyeket a PSC-k és az érzékszervi neuronok is expresszálnak, azonosították ezen metabolitok transzduktoraiként [19, 24 - 27].

A krónikus fájdalom jelentős probléma a betegek számára, és amelyet a legfontosabb kezelni. A fájdalomcsillapítók laboratóriumi állatkísérleteit hagyományosan az akut fájdalom modellek tesztelésére korlátozták. Jelen tanulmány egy olyan modellt mutat be, amelynek fájdalommal kapcsolatos válaszai legalább 10 hétig fennállnak és alkalmasak a reflexív válaszok stimulálására olyan ingerekkel, mint a von Frey-szál és a főzőlap-tesztek. Ez a modell stabil hátteret biztosít a terápiák hatékonyságának teszteléséhez sok héten keresztül. Az akut modelleken végzett korábbi állatkísérletek második korlátja, hogy a laboratóriumi állatkísérletekben tesztelt gyógyszerek nem mindig bizonyulnak hatékonynak a klinikai fájdalom kezelésében. Az AHF pancreatitis modellben a tartósan fájdalommal összefüggő válaszok jobban hasonlíthatók a krónikus pancreatitisben szenvedő betegek krónikus klinikai fájdalmához. Az új nem opiát fájdalomcsillapítók azonosítása a zsigeri fájdalom jelzésének hatékony csökkentése érdekében kritikus kielégítetlen klinikai szükséglet ennek a gyengítő fájdalommal járó szindrómának.

KÖVETKEZTETÉS

Az AHF-étrend alkalmas krónikus hasnyálmirigy-gyulladás modell kiváltására vad típusú egerekben káros vegyi anyagok hiányában. Megfigyelt hisztopatológia és viselkedési túlérzékenység modellünkben hasonló a klinikai jelentésekhez. Ez azt mutatja, hogy az AHF egérmodell alkalmas krónikus hasnyálmirigy-gyulladás mechanizmusainak tanulmányozására és új farmakológiai beavatkozások azonosítására krónikus időpontokban.

AZ ETIKAI JÓVÁHAGYÁS ÉS A RÉSZVÉTELHEZ HOZZÁADÁS

Az összes eljárást a Kentuckyi Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.