Patkánymodell, többértékű meszesedéssel, amelyet részösszeges nephrectomia és magas foszfortartalmú étrend vált ki

Nefrológiai Intézet, NanJing LiShui Népi Kórház

Zhongda Kórház Lishui fiókja, Orvostudományi Kar, Délkelet-Egyetem

87. sz. Dingjiaqiqoa, Nanjing (Kína)

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Bevezetés

A kalcium-foszfát kristályok lerakódásával járó méhen kívüli meszesedés gyakori krónikus vesebetegség (CKD) szövődménye, amely magában foglalja az érrendszeri meszesedést [1], a szelep meszesedését (VC) [2] és a bőr meszesedését [3]. Az erek meszesedése és a VC aktív folyamatot vezettek be, amelynek során a vaszkuláris simaizomsejtek vagy a szelep interstitialis sejtjei fenotípusos átalakuláson mennek keresztül osteoblastszerű sejtekké, sok szempontból hasonlóan a csontanyagcseréhez [2, 4]. A VC és az érrendszeri meszesedés a CKD gyakori szövődménye, a CKD-ben szenvedő betegeknél a kardiovaszkuláris betegség (CVD) és az összes okú halálozás kritikus mutatói [5-7] vagy végstádiumú vesebetegségek [8]. A vesebetegség: A globális eredmények javítása (KIDGO) című cikkben közzétett irányelvek szerint az ismert VC-vel rendelkező CKD-s betegeknél van a legnagyobb a CVD kockázata [9]. A VC előfordulása a CKD progressziójával növekszik, a 3. stádiumú CKD-ben kb. 40% -os, az 5. stádiumú CKD-ben pedig 80–99% -os előfordulási gyakoriság [10–14]. A CKD VC alapvizsgálatai azonban kihívást jelentenek a megfelelő kutatási modell hiánya miatt.

Egy korábbi tanulmányban Shuvy és mtsai. [15] magas adenintartalmú (0,75%) és magas foszfáttartalmú (HP) étrendet (1,5%) használt 7 héten keresztül az aorta VC modelljének megállapításához. A VC rövid időtartama egyértelműen nem esett egybe a klinikán CKD-s betegeknél megfigyelt VC időtartamával, és ennek a modellnek a vesefunkciója helyreállítható volt. Ezen túlmenően az egyszívű szelepek általában nem érintettek, és az aorta (45–59%) és a mitrális (34–55%) szelepek voltak a leggyakrabban érintettek [16]. A legtöbb jelenlegi tanulmány az érrendszer meszesedésére összpontosít. A CKD vaszkuláris meszesedésének állatmodelljében az ér kalcium (Ca) tartalma több mint kétszerese volt a normális erekénél [17]. Ezért azt terveztük, hogy létrehozzunk egy stabil urémiás modellt, amely jobban összeegyeztethető a vesedialízisben szenvedő betegek klinikai eredményeivel, és felmérjük az aorta- és mitrális szelep változását.

A CKD leggyakrabban alkalmazott módszerei közé tartozik a műtét (5/6 nephrectomia, 5/6Nx) [18], elektrokautéria [19] és a gyógyszerindukció (adenin [20], oxalát [21]). A laboratóriumunkban alkalmazott jól bevált 5/6Nx modell utánozza az emberi CKD-t megnövekedett szérum kreatinin (Scr) szinttel [22] és tubulointerstitialis fibrózissal [18]. 5/6Nx után az étrendben a megnövekedett foszfátszint parathormon szekréciót indukálhat, ami rendezetlen Ca és foszfor anyagcserét okoz, ami felgyorsítja a VC-t. Az étrendben általában a foszfát koncentrációja 1,2 [23] és 1,8% [24]. Nemrégiben kifejlesztettünk egy patkány modellt a CKD-ben, amelyet adenint és 1,8% foszfátot tartalmazó étrend indukált [20]. Vizsgálatunkban és más tanulmányainkban azonban nem volt nyilvánvaló VC az 1,8% -os foszfáttartalmú táplálékkal etetett patkányok között, amint azt a mikrokomputertomográfiai (mikro-CT) vizsgálat is mutatja [25]. Ezért a foszfát koncentrációjának növelése az étrendben 8 hétig VC-t indukálhat. A szelepsejtek magasabb szintű gyulladásgátló mRNS-t expresszálnak, mint az érsejtek [26], jelezve, hogy a HP diéta 8 hetes időtartama nem volt elegendő. Ezért meg kell határoznunk a foszfát optimális koncentrációját a különböző időtartamú HP étrendben.

Ennélfogva ebben a tanulmányban a multivéves meszesedést 5/6Nx és HP táplált CKD patkány modellben vizsgáltuk. Ennek a tanulmánynak a célja a HP diéta hozzájárulása a hosszú távú multivalve meszesedéshez különböző hosszúságú időtartamokban egy CKD modellben, amely jobban kompatibilis a vesedialízisben szenvedő betegek klinikai eredményeivel, mint más CKD modellek.

Mód

Állatok

Nyolc hetes hím Sprague-Dawley patkányok (Nantong Egyetem Állatlaboratóriuma, Kína) (n = 40) normál foszfát (NP) étrendet (0,9% P és 1,0% Ca) tápláltak (Nanjing, Kína), és négy kísérleti csoportra osztották (1. ábra): (A) színlelt + HP (n = 10); (B) színlelt + NP (n = 10); (C) 5/6Nx + HP (n = 20); és (D) 5/6Nx + NP (n = 10). A foszfor koncentrációja az egyes csoportokban a patkányoknak táplált tojásban 2,0, 0,9, 2,0 és 0,9% volt. Az 5/6Nx eljárást a korábban leírt módon hajtottuk végre [18]. Minden állat humánus ellátásban részesült, és a vizsgálati protokollok megfeleltek az intézményi irányelveknek.

1. ábra.

Az 5/6Nx + HP csoport mellékpajzsmirigy-megnagyobbodása. a Az 5/6Nx + HP csoport általános mellékpajzsmirigy-teljesítménye. b A mellékpajzsmirigy megnövekedett súlya az 5/6Nx + HP csoportban, mint a színlelt + HP csoport súlya. c A HE festés és a PCNA expresszió összehasonlítása az 5/6Nx + HP és a színlelt + HP csoportok között.

Szérum biokémia

A vér karbamid-nitrogén (BUN), Scr, Ca, foszfor (P) és 24 órás vizeletfehérje szintjét félautomatikus biokémiai analizátorral (ECA-2000A, Jilin, Kína) és UV-5100 spektrofotométerrel (Sanghaj, Kína) mértük. . A szérum PTH szinteket ELISA-val (Abnova) határoztuk meg.

Szövettan

A szelep hisztopatológiája céljából a patkány szelepeket elkülönítettük és szikével gondosan eltávolítottuk. A szövettani elemzéshez használt szövetmintákat 10% foszfáttal pufferolt formalinban rögzítettük. A szöveteket paraffinba ágyazottuk, metszettük és standard módszerekkel hematoxilinnal és eozinnal (HE), szafraninzölddel, Alcian-kékkel és von Kossával festettük [27].

Western Blotting

A fehérjemintákat nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk, majd félnedvesen polivinilidén-fluorid membránokra helyeztük. A nem specifikus kötőhelyeket 5% szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) blokkoltuk 0,1% Tween 20-ot tartalmazó Tris-pufferolt sóoldatban 1 órán át szobahőmérsékleten (RT). A membránokat Sox9 (ab185966) és a-aktin (ab179467) elleni primer antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. A peroxidázzal konjugált szekunder antitesteket 1 órán át inkubáltuk a membránokkal. A sávokat kemilumineszcens torma-peroxidáz szubsztrát (Merck Millipore) alkalmazásával detektáltuk ImageQuant LAS 4000 képfelvevő rendszerrel.

Immunfluoreszcencia festés

A kriozekciókat (5 μm) 4% paraformaldehiddel rögzítettük, 0,25% Triton X-100-val permeabilizáltuk és szobahőmérsékleten 5% BSA-val blokkoltuk foszfáttal pufferolt sóoldatban. Ezután a tárgylemezeket egy éjszakán át 4 ° C-on immunfestjük a Sox9 elleni elsődleges antitesttel (ab185966). Miután a szekunder antitesttel 1 órán át sötétben, szobahőmérsékleten inkubáltuk, a képeket lézeres pásztázó konfokális mikroszkóppal rögzítettük (LSM 710 META, Zeiss, Németország).

Immunhisztokémia

A paraffinizált szakaszokat viaszmentesítettük vízben, és a viaszmentesített, hidratált szövetrészeket előkezeltük antigén-visszanyerő oldattal (pH 6,0). A metszeteket 3% H2O2-tal inkubáltuk ionmentes vízben 15 percig az endogén peroxidáz blokkolásához, majd PBS-sel öblítettük. Az ICAM-1 (1: 400) és a szaporodó sejtmag-antigén (PCNA) (ab92552, 1: 400) elleni antitesteket adtuk hozzá, és a metszeteket egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk. A sejteket PBS-be merítettük, és az IgG antitest Fab fragmens-HRP polimert adtuk hozzá. Az elegyet ezután 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten (37 ° C), majd ötször PBS-sel mostuk 3 percig. A színt DAB-megoldás segítségével fejlesztették ki.

A bal kamrai működés echokardiográfiai értékelése

Miután 16 hétig táplálták a HP diétát, a patkányokat 2% izoflurán és 100% oxigén 2 l/perc sebességű folyamatos adagolásával érzéstelenítették egy arcmaszkon keresztül. Ezután minden patkányban transthoracalis echokardiográfiát végeztünk ultrahangos rendszerrel (Vevo 2100, VisualSonics Inc., Toronto, ON, Kanada), 21 MHz-es szondával. A bal kamrai ejekciós frakciót és a frakcionális rövidülést kiszámítottuk a bal kamra működésének értékelésére. Három egymást követő szívcikluson végzett méréseket átlagoltuk. Az aorta átmérőjének elemzésénél hosszú tengelyes M-módú nézetet alkalmaztunk, és a szív sebességének és nyomásgradiensének meghatározásához Doppler-echokardiográfiát alkalmaztunk. Az adatok elemzését vak módon hajtották végre.

A szelep mikrostruktúrájának elektronmikroszkópiája

Friss és decellularizált aorta szelepes szórólapmintákat 2,5% glutáraldehid és 4% paraformaldehid keverékében 7,35 pH-értéken 30 percig szobahőmérsékleten rögzítettünk, akár pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) (S-4800, Hitachi, energiadiszperzív spektroszkópiával felszerelve [EDS ]) vagy transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) (HR-TEM, FEI Talos F200S, EDS-sel felszerelt). Rögzítés és etanollal történő dehidratálás után a mintákat ultravékony metszetek és ultramikroszkópos megfigyelés céljából Durcupan gyantába ágyaztuk. Az EDS-t TEM-rel és 200 kV-on működő SEM-mel végeztük, amelyek 500 nm, illetve 30 μm térbeli felbontást biztosítottak.

Röntgendiffrakció

A meszesedett szöveteket fázis- és kristályosodási tulajdonságok szempontjából elemeztük röntgenpor-diffraktométerrel. A szívbillentyű meszesedő területét sztereoszkópikus mikroszkóp alatt eltávolítottuk, háromszor desztillált vízzel mostuk és fagyasztva szárító vákuumrendszerrel szárítottuk. A por röntgendiffrakciós (XRD) méréseket egy Bruker D4 röntgendiffrakciós mérőműszerrel végeztük Cu Kα sugárzással 0,05 (2θ) s –1 (λ = 0,15418 nm) pásztázási sebességgel. A szárított port egyenletesen eloszlatjuk a tárgylemez felületén, és röntgenpor-diffraktométer színpadára helyezzük. A készülék rézet használt célpontként, sugárforrásként Kα-sugárzást (λ = 1,54 nm), 40 kV-os csőfeszültséget, 35 mA-es csőáramot és 5 °/perc letapogatási sebességet; 2θ10∼90 ° diffrakciós intenzitás görbét rögzítettünk.

Statisztikai analízis

Valamennyi eredményt átlag ± szórásként fejeztük ki. Ha az adatok megfeleltek a paraméteres tesztnek, akkor a csoportok közötti különbségeket Bonferroni teszttel hasonlítottuk össze post-hoc analízishez egyirányú ANOVA teszt után. Ellenkező esetben az SPSS 21.0 statisztikai szoftver segítségével egy nemparaméteres tesztet (például rang-összeg tesztet) használtunk az elemzéshez. Különbségek a o értékek