Az akupunktúra elősegíti a fehér zsírszövet barnulását azáltal, hogy DIO egereken UCP1 expressziót indukál

Weixing Shen

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Yang Wang

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Sheng-Feng Lu

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Hao Hong

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Shuping Fu

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Suyun He

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Qian Li

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Jingxin Yue

Információs Technológiai Iskola, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, 210023 Nanjing, Kína

Bin Xu

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Bing-Mei Zhu

A Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Oktatási Minisztériumának Akupunktúrás és Orvostudományi Kutatási Laboratóriuma, 210023 Nanjing, Kína

Absztrakt

Háttér

Az akupunktúra és annak lehetséges mechanizmusának hatása a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízott fehér zsírszövetre.

Mód

A négyhetes C57BL/6 J egereket véletlenszerűen felosztották normál étrend és magas zsírtartalmú étrend (HFD) csoportokra. 8 hét után a HFD egereket véletlenszerűen felosztották az elektro-akupunktúrás (EA) és a kontroll csoportra. Az EA csoportba tartozó egereket elektroakupunktúrával, fizikai korlátozás mellett, Zusanli (ST36) és Neiting (ST44) akupunktumokon végeztük, míg a kontrollcsoportban lévő egerek csak fizikai korlátozás alatt álltak. A testtömeget és az étkezés mennyiségét monitoroztuk, biokémiai módszerekkel mértük a szérum leptin, koleszterin és triglicerid szintet. Az EA fehér zsírszövetekre gyakorolt ​​hatását qPCR, immunblot, immunhisztokémiai (IHC), immunprecipitációs és hideg állóképességi kísérlettel értékeltük.

Eredmények

A WAT/testtömeg arány csökkent (P Kulcsszavak: Akupunktúra, barnulás, elhízás, UCP1, fehér zsírszövet

Háttér

Az elhízás az egyik vezető globális egészségügyi kockázati tényező, és más egészségügyi problémákkal is összefügg, mint például a 2-es típusú cukorbetegség, a szív- és érrendszeri betegségek és a rák. Nagy kockázatú alanyokban a testtömeg 5-10% -os csökkenése 58% -kal csökkentheti a cukorbetegség kockázatát [1]. A meglévő elhízás elleni gyógyszereket és terápiákat korlátozták a mellékhatások, beleértve a hangulatváltozásokat, az öngyilkossági gondolatokat, valamint a gyomor-bélrendszeri vagy kardiovaszkuláris szövődményeket, és nem sikerült minden betegnél megfelelő súlykontrollt elérni [2]. Ily módon az elhízás a mai orvosi kihívássá vált.

Hosszú évek óta az akupunktúrát az elhízás kezelésére használják Kínában, és világszerte klinikai vizsgálatok során tanulmányozták [10–12]. Biztonságos és hatékony alternatív terápiát biztosít, egyre inkább elfogadja az elhízott betegek a választott kezelést, valamint elismerést kap mind a Nemzeti Egészségügyi Intézet, mind a WHO részéről. Az akupunktúra elhízást célzó mechanizmusa azonban továbbra sem tisztázott.

Az elektroakupunktúra (EA) stimuláció indukálja-e a WAT ​​„barnulását”? Jelen tanulmányban diétával indukált elhízott egereket alkalmaztunk állatmodellként, és EA-val kezeltük őket Zusanli (ST36) és Neiting (ST44) akupontokon. Vizsgálatunk először derítette ki, hogy az elektro-akupunktúrás kezelés indukálhatja az UCP1 expresszióját a WAT-ban és elősegítheti a WAT ​​barnulását.

Mód

Antitestek és primerek

Antitestek

Goatanti-UCP1 (Santa Cruz, Cat # sc-6528, 1: 500 hígítás Western Blot-hoz); Nyúl anti-Prdm16 (Abcam, Cat. Ab106410, 1: 1000 hígítás Western Blot-hoz); Nyúl anti-SirT1 (Abcam, Cat # ab32441, 1: 1000 hígítás Western Blot-hoz); Nyúl anti-GAPDH (Cell Signaling, Cat # 2118, 1: 2000 hígítás Western Blot-hoz); Nyúl anti-Pparγ a Western blot számára (Cell Signaling, Cat # 2443, 1: 1000 hígítás a Western Blot számára); Egér anti-Pparγ immuncsapásra (Santa Cruz, Cat # sc-7273); Mose anti-acetil-lizin (sejtjelzés, Cat. 05-515, 1: 1000 hígítás Western Blot-hoz).

Alapozók

A primereket a Primer 5.0 szoftverrel tervezték. UCP1 (előre: 5′-TGGAAAGGGACGACCCCTAA-3 ′, hátramenet: 5′-CAGGAGTGTGGTGCAAAACC-3 ′), Prdm16 (előre: 5′-CTTAGCCGGGAAGTCACAGG-3 ′, hátramenet: 5′-PTCCGAC 5′-GTCACACTCTGACAGGAGCC-3 ′, hátramenet: 5′-CACCGCTTCTTTCAAATCTTGT-3 ′), GAPDH (előre: 5′-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3 ′, hátramenet: 5′-CAGGGATGATGTTCTGG).

Állatok és csoportosítás

A négyhetes C57BL/6J egereket (n = 100) a Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Kísérleti Állatközpontja szállította, és véletlenszerűen felosztották őket normál étrend (NF, n = 20) és magas diétás ételcsoportokra ( HDF, n = 80). Az NF csoportba tartozó egereknek normál étrendet, a HDF csoportba tartozó egereknek pedig D12451 rágcsáló étrendet adtak 45 kcal% zsírral (a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.-től vásárolták). Az egereket minden héten súlyozták, miután nyolc órán át éheztek. Nyolc hét elteltével az elhízott egereket a testtömeg 20% ​​-os növekedése határozta meg az NF egerekhez képest, majd véletlenszerűen felosztották őket kontrollcsoportra és elektroakupunktúrás csoportra (EA). A vizsgálatot a Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá, és az összes eljárást az Országos Egészségügyi Állatgondozási és Felhasználási Intézet iránymutatásainak megfelelően végezték.

Elektroakupunktúrás beavatkozás

Az EA csoportba tartozó egereket fizikailag visszatartottuk, majd elektroakupunktúrával kezeltük a Zusanli (ST36) és a Neiting (ST44) elemeket, míg a kontrollcsoportban lévő egereket ugyanúgy fékeztük, akupunktúra nélkül. Az EA egerekhez két akupunktúrás tűt (Gauge-28, 0,5 cm) külön-külön behelyeztek minden egyes akupunktumba, és elektromos áramot juttattak a tűkhöz 2/15 Hz paraméterű elektromos stimulátoron keresztül 1 mA intenzitási szinten ( Han Acuten, WQ1002F, Peking, Kína) 30 percig, naponta egyszer, a hét hat napján. Az egerek testtömegét és táplálékfogyasztását hetente ellenőriztük. Négy hetes EA-kezelés után az összes egeret CO2-val leöltük, és mintákat gyűjtöttünk.

qPCR elemzés

A teljes RNS-t TRIzol® reagens (Invitrogen, Cat # 15596-026) alkalmazásával izoláltuk a gyártó ajánlásai szerint. Az RNS-koncentrációkat mennyiségileg meghatároztuk és reverz átírással használtuk az első szálú cDNS-szintézishez használt ThermoScript ™ RT-PCR rendszer segítségével (Invitrogen, Cat. 11146-016). A gén expressziókat GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Cat # A6001) alkalmazásával detektáltuk a Strata gén MX3000P Real-Time PCR rendszerben (Genetimes, Kína). A relatív génexpressziós szinteket △△ Ct-val számítottuk, és összehasonlítottuk a GAPDH-val, mint belső kontrollval.

Immunblot

Az SDS töltőpufferben lévő mintákat melegítettük (100 ° C, 5 perc), SDS-PAGE-nak vetettük alá, PVDF- vagy nitrocellulóz-membránokba helyeztük és blokkoltuk (4 ° C, egy éjszakán át) PBST-ben (PBS 0,05% Tween 20-val), amely 5 % zsírmentes száraz tej vagy 5% BSA. A blotokat primer antitesttel inkubáltuk blokkoló pufferben (egy éjszakán át, 4 ° C), majd egy második antitesttel (1: 1000).

2000 hígítás, 1 óra, RT). A jeleket SuperSignal® West Femto maximális érzékenységű szubsztrát segítségével detektáltuk. Az endogén GAPDH immundetektálását alkalmaztuk annak jelzésére, hogy ekvivalens mennyiségű fehérje volt jelen az SDS PAGE-hoz hozzáadott mintákban (üregek/sávok. Μg/L).

Immuncsapadék

A patkány epididymális zsírszöveteket jéghideg pufferben, amely 10% glicerint tartalmaz, mmol/l 50 HEPES-sel, 100 nátrium-pirofoszfáttal, 100 nátrium-fluoriddal, 1 EDTA-val, 1X proteáz inhibitor koktéllal (Sigma, Cat # P8340) és 1% Triton X-vel, -100 vagy 1% NP-40. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítottuk (100 000 g, 30 perc, 4 ° C). Az előtisztított lizátumokat (500 μg) inkubáltuk (egy éjszakán át, 4 ° C) 2 μg anti-Pparγ-val (Santa Cruz). G-fehérje gyöngyöket adtak hozzá; 2 órán át 4 ° C-on végzett inkubálás után a gyöngyöket centrifugáltuk (2000 g, 30 s), ötször mostuk jéghideg lízispufferrel, és 5% β-merkaptoetanolt tartalmazó 1 × SDS mintapufferben melegítettük 95 ° C-on. 5 percig szabadul fel a kötött fehérje. Az eluátumokat SDS-PAGE-nak vetjük alá Western-blot céljából.

A szérum leptin, koleszterin és triglicerid szint Elisa kimutatása

Az Elisa készletet a ShangHaiQiaDu Biotechnology CO.LTD, a Leptin (Cat # QD20613), a koleszterin (Cat # QD20142) és a triglicerid (Cat # QD20195) cégektől vásároltuk. A szérumszintet a gyártó ajánlásai szerint detektáltuk. Röviden, a standardokat és minden 40 μl egér szérumot 96 lyukú bevonattal ellátott lemezre adtunk 10 μl biotinnal jelzett antitesttel, 37 ° C-on 30 percig inkubáltuk, majd ötször mostuk, majd HRP-konjugátum reagenssel 60 percig inkubáltuk. 37 ° C. Ötször mossuk, majd adjunk hozzá 50 μl kromogén-oldatot és B kromogén-oldatot, 15 percen át kerüljük a fény megőrzését 37 ° C-on, 50 μl leoldó oldatot adunk hozzá, az OD értékeket 450 nm-en detektáljuk a Multiskan FC (Thermo Scientific, USA). A leptin, a koleszterin és a triglicerid szintjét standard görbével számszerűsítettük.

Szövettani elemzés és immunfluoreszcens festés

A zsírszövetet 4% formalinnal rögzítettük és paraffinba ágyazottuk, üveglemezeken 25 μm vastagságú szeletekre szeleteltük, xilolban viasztalanítottuk (5 × 4 perc) és hidratáltuk (100%, 95% és 75% etanol) 2 × 3-ig. percenként. A tárgylemezeket mikrohullámú sütőben 3x5 percig melegítettük célantigén-visszanyerési oldatban (Dako), lehűtöttük szobahőmérsékletre, PBS-ben mostuk (3x5 perc), blokkoltuk és áteresztettük 10% szamár szérumban, amely 0% triton X- 100 ° C-on 6 órán át 4 ° C-on. A tárgylemezeket egy éjszakán át primer antitesttel blokkoló pufferben inkubáltuk, majd PBS-sel (3x5 perc) mostuk, majd szekunder antitestekkel (Alexa Fluor 488 vagy Alexa Fluor 594) (Molecular Probes) két órán át blokkoló pufferben inkubáltuk. A tárgylemezeket fluoreszcens mikroszkóppal néztük meg (Nikon TE2000, Japán).

Egerek hideg állóképességi kísérlete

Az egereket párna, étel és víz nélkül hagyták ketrecükben egy 4 ° C-os hideg helyiségben. A rektális hőmérsékleteket háromóránként elektrohőmérővel (TH212, Hongauchengyun Co. Ltd., Kína) detektáltuk.

Statisztika

Az adatokat átlag ± szórás (SD) formájában adtuk meg. A statisztikai elemzést az SPSS 18.0 alkalmazásával végeztük; több csoportos összehasonlítást végeztek ANOVA-val, és két csoport-összehasonlítást határoztak meg párosítatlan 2-farkú Student t teszttel. P 1 A, A, 1B), 1 B), akár öt hetes beavatkozás után is. A kezelés első három hetében mind az EA, mind a kontroll csoportban az egerek étvágycsökkenést mutattak, amely azonban a kontroll egerek kezelésének ötödik hetére csökkent, de az EA egerekben tovább növekedett, ami arra utal, hogy az elektro-akupunktúra fokozott étvágy ezekben az egerekben bizonyos mértékig.

zsírszövet

Az elektro-akupunktúrával kiváltott UCP1 expresszió elősegítette a WAT ​​barnulást

Az un-coupling protein 1 (UCP1) gént általában specifikusan expresszálják a barna zsírszövetben (BAT), és BAT markernek tekintik. Ebben a tanulmányban egy öt hetes elektro-akupunktúrás kezelés után az EA egerekben a WAT ​​durván sötétebbnek tűnt a kezeletlen kontroll egerekben mért értékhez képest (2. C ábra), ami arra utalt, hogy az elektro-akupunktúra elősegítheti a WAT ​​BAT-ra való átállását . Megállapítottuk azt is, hogy az UCP1 gén expressziója WAT-ban csaknem 14-szeresére nőtt az EA egerekben, mint a kontroll egerekben (2. A ábra), és az UCP1 fehérje expressziója szintén szignifikánsan megnőtt az EA egerekben (2. B ábra). Adataink határozottan arra utalnak, hogy az elektro-akupunktúrás kezelés a WAT ​​barnulását eredményezi EA egerekben. Mivel az UCP1 elsősorban felelős a termogén hatásokért és a lipidmobilizációért emlősökben, immunhisztokémiai úton elemeztük az adipocita méretet, és a kontroll egerekhez és a normál táplálék egerekhez képest a WAT ​​nyilvánvalóan kisebb méretét figyeltük meg az EA egerekben (2.D ábra). az akupunktúrás kezelés elősegítheti az elhízási egerek lipolízisét.

Az elektro-akupunktúra elősegítette a fehér zsírszövet barnulását az UCP1 expresszió indukálásával DIO egerekben. (A) Az Epi-WAR-ban az UCP1 expressziójának mRNS-ét qPCR segítségével detektáltuk. Az adatokat átlagként ± SD értékként fejeztük ki, n = 16 minden csoportban, * P 3 D), ami arra utal, hogy az EA egerek jobban bírják a hideg ingerlését, mint a kontroll egerek. Az UCP1 expressziós adatokkal kombinálva eredményeink azt sugallják, hogy a WAT ​​megbarnulása az EA egerekben felelős lehet a test hőfokának fenntartása érdekében történő nagyobb hőtermelésért.

Az elektro-akupunktúrás kezelés megváltoztatta a BAT-val kapcsolatos génexpressziót és a Pparγ-acetilezést a WAT-ban

Az UCP1 transzkripcióját molekuláris mechanizmusok sora szabályozza, amelyekben Pparγ, SirT1 és Prdm16 vesz részt. Megállapítottuk, hogy a Pparγ génexpressziója 1,5-szeresére nőtt az EA egerek WAT-jában, mint a kontroll egerekben (4. ábra A), bár fehérje szintje nem változott (4. ábra D), de a Pparγ acetilezése nyilvánvalóan csökkent az EA-ban egerek elektro-akupunktúrás kezelés után (4. ábra E). A Prdm16, amely az UCP1 transzkripciót szabályozó Pparγ ko-aktivátora, nem mutatott különbséget az expressziós szintekben az EA és a kontroll csoport között (4. ábra D). A Sirt1 fehérjét kódoló és az UCP1 expresszióját hiszton dezacetilezéssel szabályozó SirT1 [7] fehérje szintjén emelkedett az EA csoportban (4. ábra D). Nem meglepő, hogy két másik specifikus BAT marker, a COX4il (4. ábra B) és Nrbf1 (4. ábra C) génexpressziója jelentősen megnőtt az EA egerek WAT-jában, összehasonlítva a kontroll egerekével. Ezek az adatok ismét megerősítették, hogy az elektro-akupunktúra elősegítette a WAT ​​barnulást.

Következtetések

Eredményeink együttvéve először is azt a kísérleti bizonyítékot szolgáltatták, hogy az EA az UCP1 expresszió indukálásával átalakíthatja a WAT-ot a BAT-ba, és ez lehet az egyik mechanizmus, amellyel az akupunktúra befolyásolja a fogyást.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát Kína Nemzeti Alapkutatási Programja (973 program, Grand No.2012CB518501), a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81273838, 81303018, 81303019 támogatásszám), a Jiangsu főiskolák és egyetemek Nemzeti Természettudományi Alapítványa támogatta. Grant No. 11KJA360003), a TCM Nanjing Egyetem (YS2012ZTX411 nagyszám). Köszönetet mondunk a WX LIU-nak (Pennsylvaniai Egyetem Állatorvostudományi Iskola) az angol nyelv szerkesztéséért.