Az alkohol a koleszterin anyagcseréjének befolyásolásával súlyosabb zsírmájbetegséget vált ki

1 Zhejiang Műszaki Egyetem, Hangcsou, Zhejiang 310014, Kína

2 Zhejiang Kínai Orvostudományi Egyetem, Hangcsou, Zhejiang 310053, Kína

3 Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325035, Kína

Absztrakt

Célkitűzések. A zsírmájbetegség (FLD) a morbiditás és a halálozás egyik fő oka világszerte. Az étrendi koleszterin és az alkoholfogyasztás fontos kockázati tényező az FLD előrehaladásában, de továbbra is nem tisztázott, hogy az alkohol indukál-e súlyosabb FLD-t koleszterin bevitelével. Itt elsősorban a Lieber-DeCarli diétát alkalmaztuk az FLD egérmodell létrehozására az alkohol és a koleszterin metabolizmus májkárosodásra gyakorolt szinergetikus hatásainak vizsgálatára. Az aszpartát-transzamináz (AST), az alanin-transzamináz (ALT), az alacsony sűrűségű lipoprotein-koleszterin (LDL-c) és az összes koleszterin (TC) szintjei, a gyulladásos gócok és a patogenezis indexei hematoxilin és eozin (H&E) és Oil Red O a festésből kiderült, hogy az alkohol a koleszterin anyagcseréjének befolyásolásával súlyosabb májkárosodást vált ki, amely elsősorban a koleszterin felszívódásának, szintézisének és kiválasztódásának a májra vagy a vékonybélre gyakorolt hatásával függ össze. Ezenkívül a bélkoleszterin felszívódásának gátlása, de nem a zsír, szacharóz és alkohol, az Ezetimibe általi felszívódás a szervezet anyagcseréjében, jelentősen javította az FLD-t a magas zsír-koleszterin-szacharóz- és alkohol-diétával táplált patkányokban. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az alkohol fontos szerepet játszik a koleszterin anyagcserében az FLD-ben.

1. Bemutatkozás

A zsírmájbetegség (FLD), ezen belül főként az alkoholos zsírmájbetegség (AFLD) és az alkoholmentes zsírmájbetegség (NFALD), a világszerte a morbiditás és a halálozás egyik fő oka. A NAFLD megbetegedése Kínában 15%, 12,9

Világszerte 46%, míg Kínában az AFLD 4,5% [1]. Az FLD spektruma magában foglalja a steatosist, a steatohepatitist, a progresszív fibrózist és a hepatocelluláris carcinomát, és számos tényező befolyásolja, beleértve az alkoholfogyasztást, a magas zsírtartalmú étrendet és a magas koleszterinszintű étrendet. Eközben a mértéktelen vagy krónikus alkoholfogyasztás és a magas zsírtartalmú koleszterinszintű étrend népszerű tendencia a lakossági asztali szokásokban.

Ezek a megállapítások arra utaltak, hogy a koleszterin és az alkohol fontos szinergetikus hatással lehet az FLD kialakulására. Kevés olyan kutatás volt, amely azt a mechanizmust érintette, hogy az alkohol hogyan indukálja a koleszterin-diétával szinkronban a súlyosabb FLD-t. Célunk az volt, hogy meghatározzuk, hogy az alkohol és a magas koleszterinszint együtt hat-e a súlyos FLD kiváltására. Ebben a vizsgálatban az egereket szokásos Lieber-DeCarli folyékony étrenddel (LD), LD plusz 0,5% koleszterin étrenddel, LD plusz 4% alkohol diétával vagy LD plusz 4% alkohol és 0,5% koleszterin diétával táplálták, hogy utánozzák az emberek étrendbeli szokásait. az alkoholfogyasztás koleszterin anyagcserére gyakorolt hatásának vizsgálata, beleértve annak felszívódását, szintézisét és kiválasztását. Ezen túlmenően arra kerestük a célt, hogy ellenőrizzük, hogy a bél koleszterin felszívódásának gátlása, de nem a zsír, szacharóz és alkohol felszívódása a szervezet anyagcseréjében az Ezetimibe segítségével, jelentősen javíthatja-e az FLD-t a magas zsír-koleszterin-szacharóz-tartalmú és alkohollal táplált patkányokban, vagy sem. A kísérleti eljárásokat az 1. ábra mutatja.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Anyagok és reagensek

Összes koleszterin (TC), triglicerid (TG), nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-c), alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin (LDL-c), alanin transzaminamin (ALT), aszpartát transzamináz (AST) és foszforsav transzamináz (ALP) ) készleteket mind az Medical System Biotechnology Co., Ltd.-től (Ningbo, Zhejiang, Kína) vásároltuk. A hematoxilint, az eozint, a Massont és az olajvörös O-t mind a Nanjing Jiangcheng Technology Co., Ltd.-től (JiangSu, Kína) szerezték be. Antitestek az autópályaszerű receptor 4 ellen (TLR-4), nukleáris faktor κB65 p (NF-κB p65), alacsony sűrűségű lipoprotein receptor (LDLR), peroxiszóma proliferátor-aktivált alfa receptor (PPAR)α), szterin szabályozó elemet megkötő 2. transzkripciós faktor (SREBP2), szterin szabályozó elemet megkötő 1. transzkripciós faktor (SREBP1), 7-alfa-koleszterin-hidroxi-láz (CYP7A1), Niemann-Pick C1 Like 1 (NPC1L1), 3-hidroxi -3-metilglutaril-koenzim A-reduktázt (HMGCR), ATP-kötő G8 kazettát (ABCG8), ATP-kötő G5 kazettát (ABCG5) és GAPDH-t mind a Santa Cruz Biotechnology-tól (USA) vásároltunk. Az I. típusú B típusú scavenger receptor (SR-BI) elleni antitestek Abcam-től (Cambridge, USA) voltak. HRP konjugált kecske anti-nyúl IgG (PV-6001) és HRP konjugált kecske anti-egér/nyúl IgG (PV-6000) a Zhongshan Goldenbridge Biotechnology Co. (Peking, Kína) cégtől származik.

2.2. Állatok és kísérleti tervezés

Negyvennyolc specifikus kórokozótól mentes hím ICR egeret és harminc hím SD patkányt vásároltunk a Zhejiang Orvostudományi Akadémiától (Hangzhou, Kína); az engedély száma SCXK (Zhe) 2014-0001. A szálláshely a laboratóriumok területén betartja a GB14925-2010 (Laboratóriumi állat-szükséglet a környezetre és a lakhatási létesítményekre) nemzeti elveket. Az ellátás és a kísérleti művelet megfelelt a „Zhejiang tartományi közigazgatási laboratóriumi állatok szabályának” szabályainak. Az egereket minden csoportban ketrecenként háromba helyeztük, és egy hét akklimatizáció után párosan etettük.

Az egereket véletlenszerűen négy csoportba osztottuk (n = 12) a súly szerint, és a következő értékeket követtük: Normal LD csoport (NLG, etetés a standard Lieber-DeCarli folyékony étrenddel), Koleszterin LD csoport (CLG, normális LD plusz 0,5% koleszterin (m/vLD) alkoholcsoport (ALG, 4% LDv/vkoleszterin és alkohol LD csoport (CALG, 4% LD alkohol + 0,5% koleszterin). A Lieber-DeCarli diéta (LD) táplálék-összetevőjét készítettük el, és az egereket páros etetéssel láttuk el, ahogy azt korábban leírtuk [10]. E négy LD-étrend kalóriatartalma megegyezett (1. táblázat). A különböző csoportokba tartozó egereket 5 hétig megfelelő étrenddel etették FLD modellek felállítása céljából. A kísérlet során értékelték a testsúlyt és a kalóriafogyasztást.

Az SD patkányokat először véletlenszerűen 3 csoportba osztották (

= 10) a súly szerint. A normál csoport (NG) a kísérlet első 4 hetében standard pellet-chow étrendet és vizet kapott. Eközben a magas zsír-koleszterin-szacharóz- és alkohol- (ACHFCSD-) indukált patkányok (MG és EG), amint azt korábban leírtuk [11], magas zsír-koleszterin-szacharóz-étrendet és 22% alkohol-vizet fogyasztva az első 4-et A kísérlet heteiben jelentősen megnőtt az ALT, az AST és a TC (az adatokat nem mutatjuk be). A következő 12 hétben az MG patkányokat állítottuk be mint kontroll kontrollcsoportot, és továbbra is magas zsír-koleszterin-szacharózt és alkoholt kaptak; Az EG patkányok magas zsír-koleszterin-szacharózt, alkoholt és Ezetimibet kaptak (1 mg/kg dózisban, p.o.). A kísérlet során értékeltük a testsúlyt (az adatokat nem közöljük).

A kísérletek végén az egereket és a patkányokat egy éjszakán át éheztettük, és vért nyertünk a szem vénás plexusából. A vért ezután 3500 rpm/perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk, hogy biokémiai analízishez szérumot kapjunk. A kísérlet végén az egereket és a patkányokat eutanáziával feláldoztuk, és összegyűjtöttük a májszöveteket. A máj és a vékonybél egy részét 4% -os semleges pufferelt formalinba helyeztük, és paraffinba ágyazottuk a hematoxilin-eozin (H&E), az immunhisztokémia (IHC) vagy a Masson trichrom (Masson) festése céljából. A friss máj többi részét folyékony nitrogénben lefagyasztották, és 80 ° C-on tárolták olajvörös O festés és Western blot elemzés céljából.

2.3. A szérum biomarkerek meghatározása

A TC, TG, LDL-c és HDL-c szérum lipidprofilját, valamint az ALT, az AST és az ALP májfunkciós biomarkereit a megfelelő készletekkel mértük a megfelelő készletekkel egy automatikus biokémiai analizátorral (TBA-40FR, Toshiba, Japán), amint azt korábban leírt [11].

2.4. A máj hisztopatológiai értékelése H&E, Oil Red O és Masson Staining segítségével

A májszegmenseket 4% semleges pufferolt formalin-oldatban rögzítettük legalább 72 órán át, és paraffinviaszba ágyazottuk. A beágyazott májszöveteket 4-nél levágtuk μm vastagságú szakaszokat, és H&E-vel és Massonnal festettük, ahogy azt korábban leírtuk [12, 13]. Kivette a májszövetek egy kis részét -80 ° C-ból, és elkészítette a fagyasztott TOT-ot a máj beágyazásához. A beágyazott májszöveteket 8-nál elvágtuk μm vastagságú -20 ° C-on, majd olajvörös O-val festettük, ahogy azt korábban leírtuk [2, 10]. Az összes festést biológiai mikroszkóppal (BA410, Motic, Kína) fényképeztük és az Image-Pro Plus szoftverrel elemeztük a lipidlerakódás, a gyulladás és a fibrózis elváltozásának megbecsléséhez.

2.5. Western Blot elemzés

A Western blot hasonló volt, mint azt korábban leírtuk [14]. Röviden, 50

2.6. A gyulladás és koleszterin metabolizmus csomópontok immunhisztokémiai (IHC) elemzése

Az immunhisztokémiai (IHC) festés hasonló volt, mint azt korábban leírtuk [12]. Az előkészített paraffinos máj- vagy vékonybél-szakaszokat 3% H2O2-mal helyettesítettük az endogén kataláz megelőzésére és inaktiválására 10 percig szobahőmérsékleten. Ezután a szakaszoknak antigén-visszakeresést kellett végezniük citrátpuffer folyadékkal (Beyotime, Jiangsu, Kína). A mintákat a primer TLR-4, LDLR, SR-BI, NPC1L1, PPAR antitesttel reagáltattukα, SREBP2, SREBP1, CYP7A1, ABCG8 és ABCG5 egy éjszakán át 4 ° C-on. Ezután a megfelelő szekunder antitesteket (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology Co., Peking, Kína) 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. DAB festés után a magot hematoxilinnel festettük, és semleges gyantákkal lezártuk. A pozitív festés sárga vagy barna színű volt a biológiai mikroszkóp alatt. A fehérje expressziók adatait szemikvantitatívan elemeztük integrált opciós sűrűségként (IOD) a mikrofotó pozitív területén az Image-Pro Plus szoftverrel.

2.7. Statisztikai analízis

Valamennyi értéket átlag ± szórásként fejeztük ki. Az adatokat egyirányú varianciaanalízisnek vetettük alá. A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha a P érték kevesebb, mint 0,05. Minden elemzést az SPSS 15.0 verziójú szoftverrel végeztünk.

3. Eredmények

3.1. A koleszterin-diétás alkohol kevesebb hízást okoz, mint a koleszterin-diéta

A négy diétás csoport egereinek alapsúlya hasonló volt (25,72 ± 2,13 g). A kísérlet végére az egerek tömegében nem volt különbség az NLG és a CLG között. Ezzel szemben az egerek kevesebb súlyt kaptak az ALG-ben és a CALG-ban, mint az NLG-ben (P
a)
b)
c)

A koleszterin kezdetben az NPC1L1 révén felszívódik a szervezet anyagcseréjébe a vékonybélben [44]. Eredményeink azt mutatták, hogy a koleszterinben gazdag étrend önmagában vagy az alkoholfogyasztással kombinálva is jelentősen növelte az NPC1L1 expressziót a vékonybélben. Ezenkívül kiválasztottuk az Ezetimibet, az NPC1L1 szelektív inhibitorát a vékonybél nyálkahártyájában, és igazoltuk, hogy a bél koleszterin felszívódásának gátlása, de nem a zsír, szacharóz és alkohol felszívódása a szervezet anyagcseréjében jelentősen javíthatja az FLD-t patkányokkal etetett patkányokban. magas zsír-koleszterin-szacharóz és alkohol. Ezek az adatok azt jelezték, hogy a koleszterin metabolizmus fontos helyet foglal el a koleszterin és az alkohol által indukált FLD-ben. Az eredmények azt mutatták, hogy a koleszterin anyagcsere fontos szerepet játszik a koleszterin és az alkohol okozta FLD-ben.

További mechanizmusok, amelyek révén az alkohol elősegítheti a májgyulladást, szintén lehetséges. A lehetséges mechanizmusok közé tartozik, hogy az alkohol elpusztítja a belek természetes gátját, és növeli a bél nyálkahártyájának permeabilitását. Ennek eredményeként az LPS enterohepatikus keringésbe kerül, ami a TLR4/NF aktiválásához vezet-κB útvonal a máj Kupffer sejtjeiben, és nagy gyulladásos faktorok felszabadulását indukálja, amelyek végül májkárosodást eredményeznek. Patkányokban az étrendi alkoholról azt javasolják, hogy aktiválja a Kupffer-sejteket, ami gyulladásos beszivárgáshoz vezet [45]. Ezenkívül bebizonyosodott, hogy kísérleteink során az alkohol- és koleszterin-diéta beállítása több gyulladásos beszivárgást okoz, mint önmagában az alkohol- vagy koleszterin-diéta.

Összegzésképpen elmondható, hogy a koleszterin-diéta és az alkohol-diéta által kiváltott FLD kombinálva szintetizálhatja az alkoholos és alkoholmentes zsírmájbetegség rizikófaktorait, és gátolhat néhány hasznos visszacsatolási szabályozási mechanizmust az FLD előfordulásának és fejlődésének felgyorsítása és súlyosbítása érdekében. Jelen tanulmány kimutatta, hogy az alkoholfogyasztás a koleszterin bevitelével a koleszterin metabolizmusának befolyásolásával súlyosabb FLD-t indukál, ami főleg a koleszterin felszívódásának (LDLR ↑ és NPC1L1 ↑), szintézisének (PPAR)α↓, SREBP1/2 ↑ és HMGCR ↑), és kiválasztódás (CYP7A1 ↓ és ABCG5/8 ↓) a májban vagy a vékonybélben. Eredményeink arra utalhatnak, hogy az alkoholfogyasztás és a magas koleszterinszintű étrend kombinációja hosszú ideig nagyon rossz, mivel felgyorsítja az FLD kialakulását. A mechanizmusok vizsgálata bizonyos jelentőséggel bír az FLD megelőzése és kezelése szempontjából. A jövőbeni kutatásokban több kísérleti módszerre van szükség a szignifikánsan megváltozott mutatók érvényesítéséhez, és több állatmodellt és eltérő modellezési időt kell figyelembe venni egyes mutatók eltéréseinek szemléltetésére, vagy a klinikai mintákkal.

Adatok elérhetősége

A vizsgálat eredményeinek alátámasztására használt adatok kérésre a megfelelő szerzőtől állnak rendelkezésre.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségek.

A szerzők közreműködése

Bo Li és Shan-Shan Lei egyformán járultak hozzá a munkához.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt támogatta Kína Nemzeti Kulcsfontosságú Kutatási és Fejlesztési Programja (2017YFC1702200 - Su-Hong Chen), a Kínai Nemzeti Tudományos Alapítvány (81673638 és 81874352 Su-Hong Chen, 81873036 Gui-Yuan Lv, és 81803760 Bo Li), Zhejiang tartomány kulcsfontosságú kutatási és fejlesztési programja (2017C03052-től Gui-Yuan Lv-ig és 2015C02032-ig Su-Hong Chenig), valamint a Kínai Posztdoktori Tudományos Alapítvány (2018M632506-tól Bo Li-ig).

Kiegészítő anyagok

S1. Ábra: 4% alkohollal és 0,5% koleszterin LD-vel táplált egerek szérum TC-szintje 3 hét etetés után és máj TC-tartalma 5 hét etetés után. A szérum TC-t automatikus biokémiai analizátorral detektáltuk, és a máj TC-tartalmát össz-koleszterin-vizsgálati készlettel (a NanJing JianCheng Bioengineering Institute-tól vásároltuk) mértük az utasítások szerint. (Kiegészítő anyagok)