Pancreapedia

Könyvjelző/Keresés ebben a bejegyzésben

Módszerek típusa:

Bejegyzés verziója:

Idézet:

AttachmentSize
Alkoholos hasnyálmirigy-gyulladás modellezése etanolos etetéssel és lipopoliszacharid (LPS) fertőzéssel 537,77 KB

Bevezetés

hasnyálmirigy-gyulladás

A hasnyálmirigy-gyulladás a krónikus alkoholfogyasztás ismert szövődménye, akut (nekro-gyulladás) és krónikus (fibrózis és acináris atrófia) megnyilvánulásokkal. A nekrózis-fibrózis szekvencia, amelyben az alkoholos krónikus hasnyálmirigy-gyulladás az akut sérülés ismételt epizódjaiból alakul ki, végül visszafordíthatatlan károsodáshoz és funkcióvesztéshez vezet, ma már széles körben elfogadott. Ezt a koncepciót támasztja alá az a klinikai megfigyelés, miszerint az alkoholos hasnyálmirigy-gyulladás gyakori rohamaival járó betegek gyorsabban krónikus betegséggé válnak. Bár elismert tény, hogy az alkoholos hasnyálmirigy-gyulladás kockázata növekszik az alkoholfogyasztás növekedésével, a nagyivók kevesebb mint 5% -ánál alakul ki klinikailag nyilvánvaló hasnyálmirigy-gyulladás, ami arra utal, hogy további nyilvánvaló hasnyálmirigy-sérülés megindításához szükséges kiváltó tényező szükséges (1, 11). A lipopoliszacharid (LPS vagy endotoxin, amely a gram-negatív baktériumok sejtfalából származik) potenciális, klinikailag jelentős kiváltó tényező, mivel az alkoholistákban, akár egyetlen falatozás után is, megemelkedett vér endotoxin-koncentráció (a bélben lévő gram-negatív baktériumokból származik) ( 5.) Ezenkívül a vér endotoxinszintje korrelál a hasnyálmirigy-gyulladás súlyosságával (2).

Figyelemre méltó, hogy az alkohol hosszú távú ad libitum adása patkányokban nem okoz hasnyálmirigy-sérülést, ami egybeesik az emberi helyzettel (8). Ezért további ingereket (például caerulein beadása, caerulein és ciklosporin, trinitrobenzol-szulfonsav (TNBS) stb.) Alkalmaztunk a hasnyálmirigy akut és krónikus elváltozásainak kiváltására. Míg ezek a modellek hozzájárultak az alkoholos hasnyálmirigy-gyulladás megértéséhez, e tényezők egyike sem bizonyítottan fiziológiai jelentőségű.

Bhagwandeen és Apte és mtsai (3) alkoholos hepatitisének korai modelljére és egy újabban kifejlesztett alkoholos akut hasnyálmirigy-gyulladás modelljére (6) építve hoztuk létre az alkoholos hasnyálmirigy-gyulladás patkánymodelljét etanol adagolás alapján (Lieber-DeCarli folyékony diéták). ) és ismételt intravénás LPS injekciókat E.Coli-tól. Ez a modell összefoglalja az emberi krónikus hasnyálmirigy-gyulladás fő jellemzőit, azaz az acináris atrófiát és a fibrózist (9). Ennél is fontosabb, hogy a hasnyálmirigy-elváltozások az alkohol megvonása után egy héten belül teljesen visszafejlődnek (10).

Ez a fejezet az alkoholos étrend elkészítésének, a csoportos etetésnek és az LPS beadásának módszertanát mutatja be patkányokban.

1.0 Anyag

  1. Folyékony diétás csövek (100 ml), Bio-Serv, Frenchtown, NJ 08825
  2. Folyékony diétás csőtartók, Bio-Serv, Frenchtown, NJ 08825
  3. Drótfenekű ketrecek (egyedi gyártmányú)
  4. Broome stílusú rágcsáló-tartó, 554-BSRR (patkányok), Plas-Labs, Lansing, Michigan 48906
  5. Broome stílusú rágcsáló-tartó, 551-BSRR (egerek), Plas-Labs, Lansing, Michigan 48906

1.1 Reagensek

1. Lieber-DeCarli folyékony étrend készítése

Charles Lieber munkája nagymértékben alakította az alkoholos májbetegség megértését. Lieber egyik legfontosabb eredménye annak bizonyítása volt, hogy az alkoholfogyasztás önmagában (és nem az étrend hiányosságai) májkárosodáshoz vezetett. 1963-ban Charles Lieber és Leonore DeCarli az etanol-etetést folyékony étrend részeként hozta létre (7). Ebben az étrendben az etanol, ha van jelen, helyettesíti a szénhidrátokat, és az összes kalória 36% -át teszi ki. Az alkoholos étrend és a kontroll étrend ugyanannyi kalóriát tartalmaz az étrend térfogatára. Ez megkönnyíti az izokalorikus mennyiségű (= hasonló mennyiségű kalória, azaz hasonló mennyiségű) étrend beadását az állatok és a hozzájuk tartozó kontrollok vizsgálatához (páros etetés vagy csoportos etetés a kontrollok számától függően).

1. táblázat Tápláléktartalom Lieber-DeCarli folyékony étrendben

Eltérő rendelkezés hiányában az összes vegyi anyag analitikai reagens minőségű és a Sigma Chemical Company-tól (St Louis, Missouri, USA) kapható.

a) Vitamin keverék

b) Sóoldat

Megjegyzés: A törzsoldatokat az étrend megkezdése előtti héten készítjük el, és azok szobahőmérsékleten stabil az etetési idő alatt.

Jegyzet: . Az elegyet szobahőmérsékleten addig keverjük, amíg csapadék nem látható. Ez körülbelül 1 órát vesz igénybe. Az olajkeverék 3 napig stabil 4 ° C-on, sötétben

d) Kontroll folyékony étrend

Az étrend különböző összetevőit egy keverőbe adjuk a fenti táblázat szerint. A karrageenant és a xantham-gumit is egyenletesen megszórják az összetevőkre, hogy elkerüljék a csomók képződését az étrendben. Az étrendet ezután összekeverjük a turmixgépben (3-4 impulzus, mindegyik 10 másodperc). Az étrend ezt követően kétszeres ionmentes H2O-val egészítette ki a végső térfogatot. A kontroll étrendet legfeljebb 3 napig, 4 ° C-on tároljuk.

e) Folyékony alkoholos étrend

Az étrend különböző összetevőit egy keverőbe adjuk a fenti táblázat szerint. Az alkoholt adják utoljára. Az étrendet ezután egy keverővel keverjük össze a fent leírtak szerint. Az étrendet a kívánt térfogatra töltjük fel ddH2O-val. Az alkoholos étrendet legfeljebb 3 napig, 4 ° C-on tárolják.

2. LPS oldat elkészítése

  1. LPS tól E.Coli B26: 026 (1 mg/injekciós üveg), liofilizált por, n ° L2654, Sigma Chemical Company (St Louis, Missouri, USA).
  2. NaCl 0,9% (steril), Becton Dickinson (BD)

Az E.Coli B26: 026 törzs LPS-ét 0,9% -os NaCl-oldattal 5 mg/ml végkoncentrációra hígítjuk (200 ml NaCl 0,9% injekciós üvegenként)) közvetlenül használat előtt. Az oldatnak az injekció beadásakor szobahőmérsékleten kell lennie.

2.0. Mód

1. Lieber-DeCarli folyékony diéták beadása

Alomtárs, hím, elválasztott Sprague-Dawley patkányokat (110-130 g) külön-külön huzalfenék ketrecekben tartanak (5. ábra), és izokaloros mennyiségű (azaz azonos térfogatú) Lieber-DeCarli folyékony étrendet etetnek velük. Mivel ebben a modellben a két változó alkohol és LPS, elvben a következő csoportokra van szükség:

i) Kontroll táplálékkal etetett patkányok (C);

ii) alkohollal táplált patkányok (A);

iii) Kontroll-diéta táplált patkányok, akik LPS injekciókat kaptak;

iv) Alkohollal táplált patkányok, akik LPS injekciót (AL) kaptak.

Az étrendeket egy állatkvartetten belül állítják be, minden csoport egy-egy képviselőjével. Javasoljuk, hogy összehasonlítható súlyú (+/- 5%) állatokat vegyen fel egy adott kvartettbe, mivel kalóriaigényük valószínűleg hasonló lesz.

A kvartett minden egyes állatának étrendi bevitelét úgy kell összehangolni, hogy a kvartettben lévő összes patkány izokalor mennyiségű étrendet kapjon. A sebességkorlátozó állat (az a patkány, amelynek napi bevitele meghatározza a másik 3 állat napi bevitelét) általában alkohollal táplált patkány. A beadandó étrend mennyiségét kiszámítják és napi alapon beállítják. Az állatok etetése a nap ugyanabban az időpontjában ajánlott (általában reggel).

Az alkoholos étrendet fokozatosan vezetik be a következő séma alkalmazásával:

Az etetést folytatják 10 héttel az LPS injekció előtt. Az egyéni étrend-fogyasztást naplóba rögzítik.

2. LPS farokvénás injekciók

Ezt az eljárást egy erre kijelölt csendes helyen, az állatok etetésén kívül hajtják végre (1. ábra). Javasoljuk, hogy egyszerre egy állatot vegyenek a ketrecébe. A ketrecet törölközőbe kell csomagolni. A patkányokat visszakapják a ketrecekből, állat-visszatartó készülékben visszatartják és lemérik. A patkány farka infravörös fény vagy meleg víz segítségével melegszik fel. Az injekció beadásának helyét a lehető legdisztálisabban kell megválasztani, és etanollal fertőtleníteni. Az injektálandó LPS oldat térfogatát a testtömeg (3 mg/kg) alapján számítják ki. Ezt az eljárást hetente kétszer megismételjük (összesen 3 injekció). Az alkohol/kontroll étrend beadása az injekció teljes időtartama alatt folytatódik.


1.ábra: Felkészülés farokvénás injekciókra. Javasoljuk, hogy készítsen kúp alakú szövetet, amelynek hegyén egy kis (5 mm széles) lyuk található. A patkány menedéket keres a szövetben (A). Az állatot behelyezzük a tartóba (B). A patkány farkát vízfürdőben melegítjük (C). LPS/sóoldat injekciója a véna disztális részébe (D).

3. A kísérleti állatok feláldozása és a szervek feldolgozása

Az állatokat 24 órával az utolsó LPS/fiziológiás sóoldat beadása után lefejezéssel feláldozzuk. A pancreatákat kinyerjük és 3 részre (proximális, középső és distalis hasnyálmirigy) vágjuk. Ennek célja a mintavételi hibák elkerülése, mivel az elváltozások foltosak lehetnek. Az egyes régiók mintáit darabokra osztjuk, és az alábbiak szerint dolgozhatjuk fel: i) gyorsfagyasztás folyékony nitrogénben, ii) beágyazás TOT vegyület közegébe (fagyasztott szakaszokhoz) és iii) 10% semleges pufferelt formalinban történő rögzítés.

Az akut elváltozásokat (acináris sejtek nekrózisa, vakuolizáció, gyulladásos infiltrátum, vérzés) a legjobban a hematoxilin és eozin festett szakaszai értékelhetik.


2. ábra: Az etanol ± egyszeri LPS injekció hatása a patkány hasnyálmirigyére. Reprezentatív H&E festett hasnyálmirigy-szakaszok patkányokról, akik kontroll étrendet tápláltak egyetlen LPS injekcióval (CL), és patkányok alkoholtartalmú étrendet fogyasztottak egyetlen LPS injekcióval (AL). Az ALs patkányok jelentős acináris vakuolizációt (blokk nyíl), acináris sejtek nekrózist (nyílhegy), gyulladásos infiltrátumot (nyíl) és vérzést (csillag) mutattak ki. A CLs csoportban elhanyagolható elváltozásokat találtak. Eredeti nagyítás x600.

A fibrózist a Masson Trichrome (3. ábra) vagy a Sirius Red festett szakaszain értékelik. A kollagén lerakódásának mértéke tovább értékelhető a hidroxi-prolin assay-vel.


3. ábra: Az etanol ± ismételt LPS injekciók hatása az extracelluláris mátrix lerakódására a patkány hasnyálmirigyében. Masson reprezentatív trichromfoltos hasnyálmirigy-szakaszai kontroll patkányokkal táplált patkányokból, akik ismételt LPS injekciókat (CLr) kaptak, és patkányok alkoholos étrendet fogyasztottak, amelyek ismételt LPS injekciókat kaptak (ALr). Az ALr patkányok pancreata jelentős periacináris fibrózist (kék foltos sávokat) és acináris atrófiát mutatott. CLr állatokban a kék festés a periductularis és perivascularis régiókra korlátozódott, és az acinar mérete normális volt. Eredeti nagyítás x1000.

Az a-simaizom aktin immunfestése (4. ábra) megerősíti a hasnyálmirigy-sztellát sejtek aktiválódását alkoholos táplálékkal ellátott állatokban, akik ismételt LPS-injekciókat kapnak.


4. ábra: Az etanol ± ismételt LPS injekciók hatása az alfa simaizom aktin (αSMA) expressziójára patkány hasnyálmirigyben. Reprezentatív paraffinba ágyazott szakaszok, amelyeket ismételt LPS injekciókat (CLr) kapott kontroll étrendet tápláló patkányokból αSMA-ra festettek, és ismételt LPS injekciókat (ALr) kapott alkoholos étrenddel ellátott patkányok. Az ALr patkányok pancreata markáns periacináris immunreaktivitást mutatott az aSMA-val szemben, ami jelezte az aktivált hasnyálmirigy-sztellát sejtek jelenlétét. Eredeti nagyítás x600. Antitest: Monoklonális egér anti-α -SMA antitest, n ° A5228 - 1A4 klón, Sigma, St. Louis, Missouri, USA.

3.0 Megjegyzések

1. Az etetési modellből származó állatokat elkülönített, jól szellőző helyiségben kell elhelyezni, elkülönítve más kísérleti állatoktól. Az alkohollal táplált patkányok különösen érzékenyek az élénk zajokra, különösen az injekciók után. Javasoljuk, hogy a rádió mindig legyen bekapcsolt állapotban (alacsony hangerő), és kerülje az állatszoba felesleges látogatását. Az állatokkal nagyon óvatosan kell bánni. Különösen az alkohol patkányok ingerlékenyek és könnyen megterhelhetők. Ez alkalmatlansághoz, alkoholelvonási tünetekhez és halálhoz vezethet.

2. Huzalfenék-ketreceket használnak annak megakadályozására, hogy az állatok almot vagy ürüléket lenyeljenek (5. ábra). Az állatetikai bizottságok javasolhatnak némi környezeti gazdagítást (például alagutat). Minden környezeti dúsítást fémből kell készíteni.

3. A Lieber és DeCarli folyékony táplálékkal etetett állatoknak nincs szükségük további vízre. Az étrendben biztosított víz elegendő napi szükségleteikhez. Az állatetikai bizottságok azonban külön vízellátást kérhetnek.

4. Az irodalom szerint a Lieber-DeCarli folyékony étrendet sikeresen alkalmazták más patkánytörzsekkel (pl. Wistar patkányok). A fent leírt patkánymodellt azonban legjobb tudomásunk szerint csak Sprague-Dawley patkányokkal hajtották végre.

5. Javasoljuk az állandó intravénás vonalak használatát patkányok LPS beadására. Ez utóbbiak az állatok irritációjának és lehetséges fertőzésének okát jelentik.

6. A fent leírt modellt C57BL6 hím egereknél alkalmaztuk (12). Előzetes vizsgálataink kimutatták, hogy ez az egér törzs nem tolerálta az 5 térfogatszázalékos etanolkoncentrációt. Ennek oka lehet az a tény, hogy a C57BL6 hím egerek súlyosabb ivók, mint a Sprague-Dawley patkányok, és/vagy hogy különösen érzékenyek az etanol hatásaira. Ezért az alkoholos étrend ajánlott etanol-koncentrációja 3 térfogatszázalék. Az alkohol ebben a koncentrációban intravénás LPS-sel együtt reprodukálja a Sprague-Dawley patkányokban megfigyelt akut és krónikus hasnyálmirigy-elváltozásokat (12; 5. ábra).


5. ábra: (A) Egyedi tervezésű ketrec folyékony táplálékkal történő adagoláshoz patkányokban és egerekben (Alain Vonlaufen, Genfi Egyetem, Svájc; Indulab®, CH-9473 Gams). A ketrec tetejéről etetőcsöveket és vizes palackokat helyeznek be. (B) Lieber-DeCarli folyékony étrenddel etetett egerek egyedi elhelyezése. Az egerek 7x7mm-es rácson nyugszanak (patkányok: 11x11mm). Az ágyneműt egy kivehető lemezbe helyezik a ketrec alatt.

4.0 Hivatkozások