Az Annexin A1 szabályozza a bél nyálkahártyájának sérülését, gyulladását és helyreállítását

Absztrakt

A gyomor-bél traktus gyulladásos állapota a morbiditás és a mortalitás egyik jelentős oka világszerte. Az olyan állapotok, mint a fertőző vastagbélgyulladás és a gyulladásos bélbetegség, a nyálkahártya szöveteinek erózióját és fekélyesedését, valamint a gyomor-bélműködés károsodását idézik elő. A nyálkahártya sérülésének és gyulladásának kezdete során a gyulladásos jelátvitel komplex tömbje indul meg, amely magában foglalja a PG és a citokin termelést (1). A citokinek alcsoportjai, köztük az IL-8, az IFN-y és a TNF-a, károsítják a bélhám működését, és gyulladásos sejtek toborzódásához vezetnek a sérülés helyén (2). Például kimutatták, hogy az IFN-γ és a TNF-a károsítja a bél hámsejtjeinek transzportját, és előidézi az intercelluláris csomópontok és az apoptózis felbomlását (3, 4, 5). Az IL-8 a leukociták hatékony toborzója (6). A védőmechanizmusok egyidejű aktiválása azonban a gyulladás mértékének és a sérülés súlyosságának szabályozására szolgál. Különböző tényezők, köztük az IL-11 és az indukálható NO-szintáz kidolgozása kritikus fontosságú a bélnyálkahártya védekező mechanizmusa szempontjából a funkcionális integritás fenntartása érdekében (1, 7, 8, 9).

Az AnxA1 egy kalciumfüggő foszfolipidkötő fehérje, amelyet eredetileg glükokortikoidok indukáltak és gátolják a foszfolipáz aktivitást (10, 11). Ezt követően az AnxA1-ről kimutatták, hogy különféle sejtfunkciókat szabályoz különféle sejttípusokban, és mély gátló hatást mutat a leukocita transzmigrációjára és aktiválására (12, 13). Az AnxA1 védő és gyulladáscsökkentő szerepét az endotoxaemia, a peritonitis, az ízületi gyulladás, valamint az agyi és szívizom ischaemia modelljeiben bizonyították (13, 14, 15, 16, 17, 18, 19). A csoportunkban végzett in vitro vizsgálatok szerepet játszottak az AnxA1-ben a regeneratív nyálkahártya-válaszok szempontjából fontos bélhámsejt-modell migrációjának stimulálásában (20). Ezekkel a megállapításokkal összhangban a legújabb tanulmányok meghatározták az AnxA1 szerepét az indometacin által kiváltott gyomorfekély gyógyulásának elősegítésében (21).

Foszfolipáz-gátló hatása mellett kimutatták, hogy az AnxA1 védő és gyulladáscsökkentő tulajdonságait a formil-peptid receptorokon (FPR) keresztül történő szignálozás közvetíti. 4 Különösen az AnxA1 védőhatása a szívizom ischaemia modelljeiben bizonyítottan érzékeny az FPR antagonizmusára (18). Ezenkívül a leukocita funkció gátlását és a gyomornyálkahártya sebgyógyulásának elősegítését az ALX/FPRL-1 AnxA1 általi stimulálásának tulajdonítják (22, 23). Az ALX/FPRL-1 a bél hámsejtjeiben expresszálódik, ahol kimutatták, hogy szabályozza a gyulladásgátló jelátvitelt (24, 25). Érdekes módon az AnxA1 szekrécióját a gyulladt bélnyálkahártya szövetekben azonosították (26, 27); ennek az eseménynek a funkcionális jelentőségét azonban még meg kell határozni. Ezért arra törekedtünk, hogy meghatározzuk az AnxA1 szerepét a bélnyálkahártya sérülésének és gyulladásának modulálásában. AnxA1 knockout állatok felhasználásával kimutatjuk, hogy az AnxA1 expresszió hiánya fokozott érzékenységet eredményez az akut dextrán-szulfát-nátrium (DSS) által kiváltott vastagbélgyulladásra, valamint károsítja a gyógyulást a DSS megvonása után. Ezenkívül megállapításaink az ALX/FPRL-1 szempontjából kritikus szerepet játszanak az AnxA1 által a gyulladásos folyamat során nyújtott védőhatások közvetítésében is.

Anyagok és metódusok

Állatok

Vad típusú (WT) nőstény BALB/c egereket a The Jackson Laboratory-tól vásároltunk. AnxA1 null egereket állítottunk elő a korábban leírtak szerint (28). Az állatokat 12 óra fény/12 óra sötét ciklusban tartottuk kórokozóktól mentes körülmények között. Az egerek ad libitum hozzáférést kaptak a szokásos étrendhez és vízhez a kívánt életkor (8–10 hét) és/vagy súly (20–25 g) eléréséig. Az állatokat használó összes eljárást az Emory Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta, és azokat a Nemzeti Egészségügyi Intézet által felvázolt kritériumok szerint hajtották végre.

A vastagbélgyulladás kiváltása

Hét százalékos (w/v) DSS-t (molekulatömeg, 36–50 kDa; MP Biomedicals) tisztított vízben oldunk és 7 napig egereknek adjuk be (29). ALX/FPRL-1 stimulációval végzett mentési vizsgálatokhoz 15-epi-lipoxin A4-t ((5S, 6R, 15R) -5,6,15-trihidroxi-7,9,13-transz-11-cisz-eikosatetraénsavat használtunk).; Calbiochem), amelyet ip (0,4 μg/állat) naponta a DSS beadása során.

Western blottolás

Az egér vastagbéljeiből sztereomikroszkóppal manuálisan eltávolított nyálkahártya-szöveteket vagy sejtrétegeket lízispufferbe helyeztük (100 mM KCl, 3 mM NaCl, 3,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4) és 1% Triton X-100), amelyek proteázt és foszfatáz inhibitorok (Sigma-Aldrich). A lizátumokat felengedtük, és az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítottuk (16 000 × g/10 perc/4 ° C). A megtisztított lizátumokat a fehérjekoncentrációra normalizáltuk, redukáló Laemelli mintapufferrel kevertük (amely 20 mM DTT végkoncentrációt tartalmaz), és SDS-PAGE-nak vetettük alá. A fehérjéket nitrocellulóz membránokra vittük át, és immunblotoltuk nyúl anti-annexin 1 és aktin Abs alkalmazásával.

Immunfluoreszcencia

Az immunfluoreszcenciához szükséges vastagbél szövetmintákat O.C.T. (Sakura) és krioszekcionált (5 μm vastag). A szöveti szakaszokat ezután 3,4% paraformaldehidben rögzítettük 20 percig szobahőmérsékleten, és HBSS + -al mostuk. Ezután a metszeteket 1% Triton X-100 HBSS + -on áteresztjük, mossuk, majd 3% BSA-t tartalmazó HBSS + -val blokkoljuk 1 órán át szobahőmérsékleten. 1 órás inkubálás után primer abs-val 3% BSA blokkoló pufferben, a metszeteket mossuk, 1 órán át inkubáljuk Alexa festékkel konjugált másodlagos Abs-vel, mossuk, majd To-Pro-3 jodiddal inkubáljuk a magok láthatóvá tétele érdekében. A metszeteket p-fenilén-diaminba illesztettük, és egy Zeiss LSM510 lézeres pásztázó konfokális mikroszkóppal (Zeiss) elemeztük. Az integrált pixelintenzitás-elemzést a Zeiss LSM 510 (V 4.03) képelemző szoftverrel végeztük. Az elemzéshez készült képek azonos detektorerősítési beállításokkal készültek.

A gyulladás értékelése DSS-sel kezelt egerekben

A DSS-sel kezelt állatok napi klinikai értékelése magában foglalta a testtömeg mérését, a széklet konzisztenciájának és a székletben lévő vér jelenlétének értékelését guajaki papírvizsgálattal (Hemoccult Sensa; Beckman Coulter). A 0 és 4 közötti validált klinikai betegség aktivitási indexet (DAI) a következő paraméterek alapján számoltuk ki: széklet konzisztencia, széklet vér jelenléte vagy hiánya, valamint a súlycsökkenés százaléka (30). Az egereket a 7. napon vagy a DSS megvonását követő 7. napon feláldoztuk, és a vastagbelet eltávolítottuk. A hosszúságot és a súlyt (31) mértük a vakbél kizárása és a vastagbél felosztása előtt a szövettan és a myeloperoxidase (MPO) aktivitás értékelése céljából (32).

A szövet MPO tevékenysége

Az MPO aktivitást a szövettanhoz használt szövet melletti szövetben mértük. A mintákat hideg PBS-sel öblítettük, szárazra foltoztuk és azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. -80 ° C-on tároltuk őket, amíg meg nem vizsgáltuk az MPO-aktivitást o-dianizidin-módszerrel (33, 34).

Szövettan

Az AnxA1 fokozott expressziója a vastagbél nyálkahártya szöveteiben a DSS kezelést követően. A nem kezelt és DSS-sel kezelt WT BALB/c állatok (A) nyálkahártya-lizátumainak Western blot-analízise megnövekedett AnxA1 fehérjét mutatott ki. Az ezekből a vizsgálatokból származó Western blotok densitometriai elemzése alapján (B) az AnxA1 szint 1,5-szeresére emelkedett a DSS-kezelést követően (∗, p-érték ⇓ A, nyilak). A lamina propriában található mononukleáris sejtek szintén expresszálják az AnxA1-et (2. ábra ⇓ A, nyílhegyek). A felszíni enterocitákban az AnxA1-et az apikális és laterális membrán plazmamembránjai mentén, valamint a citoplazmatikus rekeszben találtuk (2. ábra ⇓ B). Ezzel szemben az AnxA1-et főleg a kriptahám citoplazmájában azonosították (2. ábra (C). A DSS-kezelést követően az AnxA1-t mind a felszíni, mind a kriptás hámsejtekben felfelé szabályozták (2. ábra, B – E; a képeket azonos detektorerősítési beállításokkal készítettük). Az integrált pixelintenzitás-elemzés alapján a hám 1,6-szoros növekedést mutatott az AnxA1 szintben a DSS-sel kezelt állatokban a kezeletlen kontrollokhoz képest (2. ábra ⇓ F; ∗, p-érték

Az DS-kezelést követően az anxA1 expresszió fokozódik a bél hámsejtjeiben. A WT BALB/c nyálkahártya immunfluoreszcencia analízise során az AnxA1 expressziója mind a kriptában, mind a felszíni bél hámsejtjeiben (A; nyilak) [Bar = 50 μm] mutatkozott. A felszíni enterocitákban (B) az AnxA1 az apikális és laterális plazmamembránokban, valamint a citoplazmában lokalizálódik, míg a kriptahámsejtekben kizárólag a citoplazmában (C) látszik [Bars = 20 μm]. A DSS-kezelést követően az AnxA1 szint mind a felszíni, mind a kriptás hámsejtekben megemelkedik a kezeletlen állatokkal összehasonlítva (B – E; azonos detektorerősítési beállításokkal készített képek) [Bars = 20 μm]. Az integrált pixelintenzitás-analízis (F) az anxA1 szint 1,7-szeres növekedését mutatta ki a bél hámsejtjeiben 7 napos DSS-kezelés után (∗, p-érték ⇓ A, az AnxA1 (-/-) egereknél erőteljesebb súlyvesztés volt megfigyelhető) a DSS beadását követő 3 napon belül összehasonlítva a DSS-kezelt WT állatokkal (* p-érték ⇓ B; ∗, p-érték ⇓ C; ∗, p-érték ⇓ D; ∗, p-érték ⇓ A, reprezentatív H & E- festett szakaszok nagyobb fokú hámkárosodást, megnövekedett neutrofil infiltrációt és gyulladásos változásokat mutattak ki az AnxA1 (-/-) egerek submucosalis szöveteiben (nyilak) a WT állatokkal összehasonlítva 7 napos DSS-kezelést követően. Így a DSS-sel kezelt AnxA1/-) az állatoknál magasabb volt a sérülés és az MPO aktivitás szövettani pontszáma a nyálkahártya szövetekben a kontrollokhoz képest (4. ábra ⇓, B és C; ∗, p-érték

Az anxA1-hiányos egerek klinikai és hisztopatológiai javulását mutatják a DSS-kezelés visszavonását követően. Az AnxA1 (-/-) egereknél a súlygyarapodás mértéke szignifikánsan csökkent a DSS-kezelés visszavonása után, összehasonlítva a WT kontrollokkal (A; ∗, p-érték ⇓ A, AnxA1 (-/-) állatok kezelése 15 epi-vel -lipoxin A4 a DSS beadása során hasonló testsúlycsökkenést eredményez, mint a WT DSS-sel kezelt kontrolloké. Érdekes módon a DSS kezelés következtében nem tapasztaltak szignifikáns javulást a WT BALB/c állatoknál. A DAI pontszám az AnxA1 esetében ( A -/-) állatok szignifikánsan magasabbak voltak, mint a kontrolloké, és a 15-epi-lipoxin A4-gyel végzett kezelés hasonló DAI-pontszámokat eredményezett, mint a WT DSS-sel kezelt állatoké (6. ábra ⇓ B). 15-epi-lipoxin A4-vel kezelt WT-állatok, összehasonlítva a kizárólag DSS-sel kezelt WT-állatokkal. Végül a hisztopatológiai elemzés a nyálkahártya sérülésének jelentős javulását mutatta a DSS beadása miatt a 15-epi-lipoxin A4-vel kezelt AnxA1 (-/-) állatokban összehasonlítva a csak DSS-t kapókkal (6. ábra ⇓, C és D) DSS-sel kezelt állatokon a 15-epi-lipoxin A4 egyidejű kezelése nem eredményezett statisztikailag szignifikáns javulást a szövettani sérülési pontszámban (1. ábra). 6, C és D). Tehát AnxA1 hiányában az ALX/FPRL-1 stimuláció hatékonyan csökkenti a DSS által kiváltott betegség súlyosságát, hasonlóan a WT kontrollokban megfigyelthez. AnxA1 jelenlétében (WT egerekben) az ALX/FPRL-1 stimuláció a jelenlegi protokollal és ligandummal nem javította a betegség lefolyását.

Az ALX/FPRL-1 stimuláció megmenti az AnxA1-hiányos egerek érzékenységét a DSS által kiváltott vastagbélgyulladásra. Az AnxA1 (-/-) állatok kifejezettebb súlyvesztést mutattak a DSS-kezelést követően, amely 15-epi-lipoxin A4 (az ábrán L jelöléssel jelölt) beadásával ALX/FPRL-1 stimulációval visszaállt a WT kontrollokéhoz (A; ∗, p-érték ⇓ A; ∗, p-érték ⇓ A). DSS beadását követően az AnxA1 (-/-) állatok nagyobb mértékben szuppresszálták az ALX/FPRL-1 expressziót a WT állatokhoz képest, átlagosan 4,7-szer kisebbek, mint a DSS-sel kezelt WT állatok (7. ábra A). Az FPR-rs2 esetében nem észleltek expressziós különbséget a kontroll WT, a DSS-sel kezelt WT és a kontroll AnxA1 (-/-) állatok között (7. ábra ⇓ B). 7 napos DSS-kezelést követően azonban az FPR-rs-2 expresszió csak AnxA1 (-/-) állatokban csökkent drámaian (7. ábra B, ⇓, p-érték ⇓ C). Így az AnxA1 (-/-) egerek csökkentik az ALX/FPRL-1, és különösen az FPR-rs2 expressziót a DSS kezelést követően a WT állatokkal.

Az AnxA1 (-/-) egerek csökkent ALX/FPRL-1 expressziót mutatnak a DSS kezelést követően. A teljes RNS-t kontroll és DSS-sel kezelt WT és AnxA1 (-/-) egerek nyálkahártya szöveteiből extraháltuk, és RT-PCR analízisnek vetettük alá az ALX/FPRL-1, FPR-rs2 és FPR1 szempontjából. Bár DSS-sel kezelt WT típusú állatokban az ALX/FPRL-1 szintek elnyomódtak, a DSS kezelést követően az ALX/FPRL-1 mRNS további csökkenését figyelték meg az AnxA1 (-/-) állatokban (A; n = 3 állat). Az FPR-rs2 expresszió nem változott a DSS beadása után WT állatokban, de drasztikusan csökkent az AnxA1 (-/-) egerekben egy 7 tanfolyam DSS kezelést követően (B; n = 3 állat). Az FPR1 expresszió hasonló csökkenését figyelték meg DSS kezelést követően WT és AnxA1 (-/-) állatokban (C; n = 3 állat).

Vita

Kimutatták, hogy az AnxA1 védő vagy gyulladáscsökkentő szerepet játszik számos betegségmodellben (13, 14, 15, 17, 47). Viszonylag keveset tudunk azonban az AnxA1 szerepéről a gyomor-bél traktus sérülésének és gyulladásának szabályozásában. A legújabb tanulmányok meghatározták az AnxA1 szerepét a dexametazon gasztroprotektív hatásainak közvetítésében a nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek okozta sérülések ellen, valamint a gyomorfekély helyreállításának elősegítésében (21, 48). Az alsó gyomor-bél traktusban a vastagbélgyulladás rágcsáló-modelljeivel végzett vizsgálatok, valamint a humán fekélyes vastagbélgyulladás elemzésével megállapították ennek a gyulladáscsökkentő mediátornak a fokozott expresszióját és szekrécióját (26, 27). Jelen tanulmány az AnxA1 expresszió funkcionális jelentőségének megvizsgálására akut vastagbélkárosodás és gyulladás, valamint a nyálkahártya szövetek helyreállítása során történt.

Az AnxA1 egy funkcionálisan sokszínű gyulladásgátló fehérje, amelyet különféle sejttípusok expresszálnak, beleértve az epitheliális sejteket is (49, 50, 51, 52, 53, 54, 55). Meghatároztuk az AnxA1 expresszióját normál egér vastagbél hámsejtekben a kriptapint-tengely mentén. Megállapították, hogy az AnxA1 lokalizálódik a kripta hámjának citoplazmatikus részében. Érdekes módon az AnxA1-et a citoplazma mellett bőségesen megtalálták az apikális és laterális plazmamembrán domének mentén a felszíni enterocitákban. A kripta hámsejtek és a teljesen differenciált felületi enterociták közötti lokalizációbeli különbség arra utalhat, hogy az AnxA1 szerepet játszik a vastagbél hámsejtjeinek differenciálódásának és/vagy érésének szabályozásában. Az AnxA1 ilyen szerepét in vitro vizsgálatok során figyelték meg a modell hámsejtvonalak alkalmazásával (53, 56). Nem figyeltünk meg morfológiai vagy nyilvánvaló funkcionális különbségeket a WT és AnxA1 (-/-) állatok vastagbél nyálkahártyájában. Így az AnxA1 homeosztatikus szerepe az egér bélhámjában ismeretlen marad, és a redundáns rendszerek kompenzálhatják hiányát. Alternatív megoldásként védelmi funkciója sértés alkalmazásával működőképessé válhat.

A trinitrobenzolszulfonsav által indukált vastagbélgyulladásban az AnxA1 fokozott expresszióját azonosító korábbi vizsgálatokkal összhangban patkányokban (26) megfigyeltük az AnxA1 expresszió szignifikáns up-szabályozását a nyálkahártya-lizátumokban, pontosabban a vastagbél hámjában a DSS beadását követően. Ezenkívül az AnxA1-hiányos állatok szignifikánsan fokozott érzékenységet mutattak a DSS által kiváltott vastagbélkárosodás és morbiditás iránt. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az AnxA1 protektív szerepet játszik akut vastagbélkárosodásban.

A DSS által kiváltott vastagbélgyulladásra való fokozott érzékenység mellett az AnxA1 (-/-) állatok klinikai és hisztopatológiai gyógyulását is csökkenték a DSS-kezelés visszavonását követően. Ez a megállapítás arra utal, hogy az AnxA1 fontos szerepet játszik a vastagbél nyálkahártya sebgyógyulásának elősegítésében. Korábbi in vitro vizsgálatok csoportunkból meghatározták az AnxA1 szerepét az ALX/FPRL-1 által közvetített hámsejt-vándorlás fokozásának stimulálásában háromdimenziós mátrixokon keresztül (20). Mivel a hámsejtek migrációja szükséges a nyálkahártya sebgyógyulásához és regenerációjához, az ALX/FPRL-1 AnxA1 által közvetített aktiválása fontos mechanizmus lehet a bélnyálkahártya sebgyógyulásának elősegítésében. Ezzel az elképzeléssel összhangban a vizsgálatok meghatározták az ALX/FPRL-1 AnxA1 által közvetített stimulációjának szerepét az indometacin által kiváltott gyomorfekély gyógyulásának elősegítésében (21). Ebben a jelentésben azonban az AnxA1-hiányos állatok nem mutattak fokozott érzékenységet a gyomorban fekélyképződés indukciója iránt, amint azt DSS-indukálta károsodásra figyeltük meg.

Összefoglalva, bebizonyítottuk, hogy az AnxA1-et az egér bél hámsejtjei expresszálják, és expressziója fokozódik a DSS beadását követően. Az AnxA1 hiányában szenvedő egerek fokozott érzékenységet mutatnak a DSS által kiváltott nyálkahártya sérülés iránt, ami a kapcsolódó morbiditás növekedését eredményezi. Az AnxA1-hiányos egerek klinikai és hisztopatológiai gyógyulása is károsodott a DSS beadását követően. Ezenkívül az ALX/FPRL-1 stimulálása AnxA1 (-/-) állatokban csökkenti a DSS által kiváltott betegség súlyosságát a WT állatokéhoz, de nem javítja jelentősen a betegség súlyosságát a WT állatokban. Végül az AnxA1 (-/-) egerek alacsonyabb egér lipoxin receptor szintet mutatnak a DSS kezelést követően a WT állatokhoz képest. Összességében ezek az adatok alátámasztják az AnxA1 protektív szerepét az akut bélnyálkahártya-sérülés után, ahol megkönnyíti a hámgát helyreállítását is. Adataink arra is utalnak, hogy az ALX/FPRL-1 aktiváció szerepet játszik az AnxA1 bélnyálkahártya sérülés elleni védőhatásainak közvetítésében. Az AnxA1 védelme a bélsérülésektől és a nyálkahártya helyreállításának elősegítésének mechanizmusaihoz hozzájárulhat a bélnyálkahártya sérülésének megelőzését és a sebgyógyulást elősegítő terápiák kialakításához.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Dr. E. Rodriguez-Boulan-nak az SKCO-15 sejtek ajándékát és Dr. Voss S.-nak a sejttenyésztési segítséget.