Az anyai táplálkozás modulálja a magzat fejlődését azáltal, hogy placenta hatékonysági változásokat indukál az ifjú kocákban

Absztrakt

Háttér

A méhen belüli növekedés korlátozása (IUGR) és a magzat túlnövekedése növeli a posztnatális egészség kockázatát. Az anyai táplálkozás a fő intrauterin környezeti tényező, amely megváltoztatja a magzat súlyát. Az anyai táplálkozás magzati fejlődésre gyakorolt hatásainak hátterében álló mechanizmusok azonban nem teljesen egyértelműek. Kidolgoztunk egy disznómodellt, és izobár címkékkel a relatív és abszolút kvantifikációhoz (iTRAQ) megvizsgáltuk az anyák placenta proteomájának változásait normál energiafogyasztású (Con) és nagy energiabevitelű (HE) diétán.

Eredmények

A Con csoportban nehéz és könnyű magzatokat találtak a méh tubális és nyaki végén a terhesség 90 d-jén. Sőt, a nehéz magzatoknál magasabb volt a glükózkoncentráció, mint a könnyű magzatoknál. Ugyanakkor a HE csoportban magasabb egységességet figyeltek meg. A két pozíció közötti placenta promóterek azt mutatták, hogy a Con és a HE csoportokban 78, illetve 50 különböző módon expresszált fehérjét detektáltak. A Con csoportban ezek a fehérjék részt vettek a lipid anyagcserében (HADHA, AACS, CAD), a tápanyag transzportban (GLUT, SLC27A1) és az energia anyagcserében (NDUFV1, NDUFV2, ATP5C1). A HE csoportban azonban főleg transzkripciós és transzlációs szabályozásban, valamint intracelluláris vezikuláris transzportban vettek részt.

Következtetések

Eredményeinkből kiderült, hogy az anyai táplálkozás elsősorban a placenta lipidjeinek és az energia-anyagcserének a modulálásával változtathatja meg a születési súlyt, amely egy lehetséges mechanizmust is kínál a magzati súly magasabb egységességének megmagyarázására HE-étrenddel táplált kocáknál.

Háttér

A juhokkal és rágcsálókkal összehasonlítva a sertések fiziológiailag és genetikailag jobban hasonlítanak az emberhez [11], ezért ideális modellnek tekintik őket a klinikai táplálkozás vizsgálatában [12]. Sertésmodellekkel végzett egyes tanulmányok azt mutatják, hogy a kóros magzati növekedés negatív hatása az, hogy hozzájárul a malac születési súlyának (CVBW0) nagyobb alomon belüli variációjához [13]. Érdekes módon Kim és mtsai. (2013) összefoglalta, hogy a magzati súly lineárisan nőtt a méhnyaktól a méh-tubális elágazásig a terhesség 102. és 112. napján [14]. Így disznó modell segítségével a méh szarvának mindkét oldalán elhelyezkedő méhlepény hatékonyságának vizsgálata valószínűleg tükrözi a magzati fejlődés mögöttes mechanizmusait, amelyek relevánsak az IUGR és a túlsúlyos utódok előfordulása szempontjából. A túl alacsony vagy magas születési súlyú újszülöttek általános problémát jelentenek az emberi egészségben, bár az emberek általában az egypárú állatok osztályába tartoznak [15].

A legtöbb állatkísérlet kimutatta, hogy az anyák táplálékfelvétele a terhesség alatt befolyásolja a születési súlyt [16, 17]. Mindazonáltal azok a mechanizmusok, amelyek mögött az anyai táplálkozás szabályozza a magzat fejlődését, továbbra sem világosak. Ezért ez a tanulmány feltárta az újszülöttek tömegének variációinak molekuláris alapját, amelyet az anya terhesség alatti változó táplálkozási energiaszintje okozott. Sertés modell alkalmazásával a relatív és abszolút mennyiségi meghatározáshoz (iTRAQ) placeboproteom elemzéseket alkalmaztunk izobár tagjelű placenta proteom elemzéssel. Eredményeink új betekintést nyújtanak a magzat fejlődésének anyai táplálkozási szabályozásának molekuláris alapjainak jobb megértése felé a placentán keresztül.

Mód

Állatkezelés és kísérleti tervezés

Az állatkísérleteket a Szecsuáni Mezőgazdasági Egyetem Mezőgazdasági Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága által jóváhagyott állatvédelmi törvénynek megfelelően végezték. Ebben a kísérletben 28 fajtatiszta nagy fehér (LW) kocát használtunk, átlagos súlyuk 135,54 ± 0,66 kg. Párzás után az ikrákat véletlenszerűen két kísérleti csoportba soroltuk. Az étrendi kezelések két étrendi táplálkozási szintet tartalmaztak a szójaolaj-kiegészítés különböző koncentrációival: 14,23 MJ DE/kg (HE) és 12,56 MJ DE/kg (Con) az NRC (2012) ajánlási energiaigényét (1. táblázat) . A terhességi kismamák takarmányfelvétele 2,0 kg/d d 0 és 30 között, 2,4 kg/d d 31 és 90 között és 3,0 kg/d d 91 és fészek között. Valamennyi kocasüldöt egyedi etetési standokon helyezték el, és a vizet ad libitum szolgáltatták.

Minta kollekció

Megmértük a kocasülták vastagságának vastagságát (P2: 65 mm-re a középvonaltól az utolsó borda mellett). Négy kocát választottak ki véletlenszerűen az egyes csoportokból, amelyeket a vemhesség d 55-én, illetve 90-ben vágtak le, a Zoletil 50-vel (Zoletil 50 Vet, Virbac, Franciaország) végzett mély érzéstelenítést követően 0,1 mg/testtömeg-kg dózisban, amelyet intramuszkuláris injekcióval, a fennmaradó kocasülteket a szülésig etettük. A laparotómiát követően a méheket azonnal eltávolították az ivartól és jégre helyezték. A terhesség 90. napján minden egyes magzatból köldökvénás vért gyűjtöttek, amely a méhnyak és a méh-tubális csomópont felé irányult. Az összes vérmintát közvetlenül a gyűjtés után centrifugáltuk (3000 × g 15 percig 4 ° C-on). A későbbi elemzésekhez szérummintákat gyűjtöttünk és -20 ° C-on tároltunk. Az egyes méhszarvakban elhelyezkedő magzatok súlyát a méhnyaktól a méh-tubális elágazásig a terhesség d 55. és 90. pontján rögzítettük. A placentát gondosan elkülönítettük, és minden magzat méhéből lemértük terhesség d 55. és 90. napján. A terhesség 90. napján a méhnyakot és a méh-tubális csomópontot körülvevő placenta szövetmintákat folyékony nitrogénben fagyasztották le, hideg steril sóoldattal történő öblítés után, későbbi kísérletek céljából.

A szérum IGF-1 és a glükóz elemzése

A szérum IGF-1-et és a glükózt enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készletekkel (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) mértük a gyártó ajánlásai szerint. Az IGF-1 és a glükóz minimálisan kimutatható szintje 0,01 ng/ml volt.

Fehérje minta előkészítése

Kvantitatív iTRAQ proteomikai megközelítés. Ez az ábra leírja a méhlepény mintagyűjtésének különböző helyét a Con és a HE csoport között. És az iTRAQ proteomikai megközelítés alapvető folyamata

Placenta proteomikai vizsgálatok

LC-ESI-MS/MS elemzés Triple TOF 5600 alapján

Az MS elemzésének protokollját a [22] korábban leírta, apró módosításokkal. Először mindegyik frakciót újraszuszpendáltuk az A pufferben (5% ACN, 0,1% FA), és 20000x g 10 percig, és a peptid végső koncentrációja körülbelül 0,5 μg/μl volt. Ezt követően 10 μl felülúszót töltöttünk az LC-20 AD nanoHPLC oszlop 2 cm-es C18-csapdájába (Shimadzu, Kyoto, Japán). A peptideket házon belül csomagolt 10 cm-es analitikai C18 oszlopra (belső átmérő 75 μm) eluáltuk. A mintákat 8 μL/min sebességgel töltöttük 4 percig, majd a gradiens 300 nL/perc sebességgel kezdődött, 2-35% B (95% ACN, 0,1% FA) 35 percig, lineáris gradiens 60% -ig 5 percig 80% 2 percig, karbantartás 4 percig, végül 1 percig 5% -ra tér vissza. A frakciókat TripleTOF 5600 rendszer (AB SCIEX, Concord, ON) alkalmazásával elemeztük, Nanospray III forrással (AB SCIEX, Concord, ON) és emitterként egy kihúzott kvarcheggyel (New Objectives, Woburn, MA). Az adatokat 250 ms-ban gyűjtöttük össze, és akár 30 termék-ion-vizsgálatot gyűjtöttünk össze, ha túlléptük a 120 számlálás/másodperc (számlálás/s) küszöböt, 2–5+ töltöttségi állapot mellett és 15 másodperces dinamikus kizárással beállítás. Mindegyik frakciót nano LC-MS/MS módszerrel elemeztük, a [23] korábban leírtak szerint.

Adatfeldolgozás és elemzések

Az iTRAQ-ból származó, differenciálisan expresszált fehérjék MRM validálása

Az MS/MS adatok spektrális könyvtárát egy TripleTOF5600 készüléken (AB SCIEX, Foster City, Kalifornia) generáltuk, és disznó adatbázis (48278 bejegyzés) alapján kerestük a Mascot 2.3.02 (Matrix Science, Egyesült Királyság) alkalmazásával. A dátumfájlt importálták a Skyline szoftverbe, ahol könyvtár épült. A peptideket a többszörös reakciómonitorozási (MRM) módszer fejlesztésére szelektáltuk a következő kritériumok szerint: (1) az adatbázisban egyedi szekvenciákkal rendelkező peptidek; (2) az azonos elúciós profilú maximális m/z 5 y-ionok ugyanabban az arányban voltak, mint a spektrális könyvtár. A megcélzott peptidek várható retenciós idejét IRT stratégiával figyelték meg. Az egyesített peptideket megemésztettük, és előzetes SRM vizsgálatot alkalmaztunk annak meghatározására, hogy hol találhatók ezek a fehérjék.

Statisztikai analízis

A reprodukciós teljesítmény és a szérum biokémiai indexek eredményeit Student's segítségével elemeztük t-teszt SPSS-ben (v. 19.0 for Windows, SPSS; IBM SPSS Company, Chicago, IL, USA). A magzati és a malac születési súlyának változásait egy arcsine négyzetgyök transzformációt követően elemeztük. Eredmények a következővel: o

Eredmények

Az ivadékok reproduktív teljesítménye

Az anyai étrendi kezelésnek a terhesség 55. napján nem volt hatása a P2 helyzetben lévő zsírzsírvastagságra, a magzati súlyra és a súly (CV-súly) variációs együtthatójára (2. táblázat; o > 0,05). Azonban a vemhesség 90. napján az anyák nagyobb vastagságú vastagságot mutattak a HE csoport P2 helyzetében, mint a Con csoport (o 2. táblázat Az étrendi energiaszint hatása az kocák szaporodási teljesítményére

A magzati és a placenta súlyának megoszlása (g) a méh szarván belül. a: a magzati súly megoszlása a Con csoportban a terhesség 55. napján; b: a placenta súlyának megoszlása a Con csoportban a terhesség 55. napján; c: a magzati súlyok eloszlása a HE csoportban a terhesség 55. napján; d: a placenta súlyának megoszlása a HE csoportban a terhesség 55. napján; e: a magzati súly megoszlása a Con csoportban a terhesség 90. napján; f: a placenta súlyának megoszlása a Con csoportban a terhesség 90. napján; g: a magzati súly eloszlása a HE csoportban a terhesség 90. napján; h: a placenta súlyának megoszlása a HE csoportban a terhesség 90. napján. Az adatok mediánban vannak megadva (interkvartilis tartomány)

Az IGF-1 és a glükóz koncentrációja a magzati szérumban a méh különböző helyein

A terhesség 90. napján az IGF-1 és a glükózkoncentráció a Con csoportban szignifikánsan magasabb volt a méh-tubális csomópont felé elhelyezkedő magzatokban, mint a méhnyak felé (o 0,05) (3. táblázat; 2. kiegészítő fájl: S2 táblázat).

A differenciálbőségű fehérjék azonosítása és összehasonlítása

Az iTRAQ elemzés segítségével összesen 3011 és 3018 fehérjét azonosítottak a hamis 1% -os felfedezési arányban a Con és a HE különböző méhhelyein (3. kiegészítő fájl: S3 táblázat; 4. kiegészítő fájl: S4 táblázat).

A Con csoportban azonosított fehérjék közül 78> 1,2-szeres változásokat mutatott a méhnyak és a méh-tubális csomópont között (o 4. táblázat Differenciálisan expresszált fehérjék a méhlepényben a Con csoportban

A placentából azonosított differenciálbőségű fehérjék funkcionális osztályozása. A panelek a a: a Con csoport és b: a HE csoport

A HE csoportban azonosított fehérjék közül 50> 1,2-szeres változásokat mutatott a méhnyak és a méh-tubális csomópont között (o 5. táblázat Differenciálisan expresszált fehérjék a placentában a HE csoportban

A differenciálbőségű fehérjék GO annotációi

A placentában differenciálisan expresszált fehérjék GO eloszlásának elemzése. a: a Con-csoport "sejtkomponense"; b: a HE-csoport "sejtkomponense"; c: a Con-csoport "molekuláris funkciója"; d: a HE csoport "molekuláris funkciója"; e: a Con-csoport "biológiai folyamata"; f: a HE csoport "biológiai folyamata"

MRM validálás a differenciálisan expresszált fehérjékre az iTRAQ-ból

Az MRM elemzés sikeresen kimutatott 10 differenciálisan expresszált fehérjét (6. táblázat), beleértve az iTRAQ-ból származó 20 egyedi peptidet. Fontos volt, hogy az MRM-ből származó 10 célfehérje mennyiségi adatainak logikai arányai szignifikánsan pozitívan korreláltak az iTRAQ-val kapott adatokkal (5. ábra; o 1.2, o 6. táblázat: A differenciálisan expresszált fehérjék MR- validálása Con és HE csoportokban

Az iTRAQ és az MRM közötti változás változásának összefüggése a tíz célfehérje esetében. a: a Con csoport korrelációja; b: a HE csoport összefüggése

Vita

Differenciális proteomvizsgálat a placenta között a méhnyak és a méh-tubális csomópont helyzete felé a Con csoportban

Differenciál proteomvizsgálat a méhnyak és a méh-tubális csomópont helyzete között a HE csoportban

Következtetés

Vizsgálatunk az első bizonyíték arra, hogy megváltozik a proteomák válasza a placenta méh-tubális és cervicalis végén, a növendék táplálékkal történő megnövekedett energiafogyasztására. A placenta lipid- és energia-anyagcseréje, valamint a tápanyagok szállítása döntő jelentőségű lehet a magzatok súlyának befolyásolásában. Ezenkívül ez a tanulmány bebizonyította, hogy a terhesség alatti magas energiaellátás fokozta a magzat fejlődését, javította a méhlepény tápanyagellátását és csökkentette az alomon belüli születési súly ingadozását, végső soron növelve a magzat súlyát és a malac születési súlyának egyenletességét. Ezek az eredmények új betekintést nyújtanak azokba a mechanizmusokba, amelyek révén az anyai táplálkozás szabályozza a magzat növekedését, és javítja a placenta hatékonyságának megértését.