Az Artemisia annua anti-adipogén hatása étrend okozta elhízás egerek modelljében

Hye Kyung Baek

1 Orvosbiológiai Orvostudományi Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Soonchunhyang Egyetem, Asan 31538, Korea.

Hyeji Shim

1 Orvosbiológiai Orvostudományi Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Soonchunhyang Egyetem, Asan 31538, Korea.

Hyunmook Lim

1 Orvosbiológiai Orvostudományi Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Soonchunhyang Egyetem, Asan 31538, Korea.

Minju Shim

1 Orvosbiológiai Orvostudományi Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Soonchunhyang Egyetem, Asan 31538, Korea.

Chul-Kyu Kim

2 Orvosi Biotechnológiai Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Soonchunhyang Egyetem, Asan 31538, Korea.

Sang-Kyu park

2 Orvostudományi Biotechnológiai Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Soonchunhyang Egyetem, Asan 31538, Korea.

Yong Seok Lee

3 Élettudományi és Biotechnológiai Tanszék, Természettudományi Főiskola, Soonchunhyang Egyetem, Asan 31538, Korea.

Ki-Duk Song

4 Genomikai Informatikai Központ, Han-kyong Nemzeti Egyetem, Anseong 17579, Korea.

Sung-Jo Kim

5 Biotechnológiai Tanszék, Hoseo Egyetem, Asan 31499, Korea.

Sun Shin Yi

1 Orvosbiológiai Orvostudományi Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Soonchunhyang Egyetem, Asan 31538, Korea.

Absztrakt

Bevezetés

A zsírszövet szerepet játszik az energiatárolásban és a hőszabályozásban, és különféle hormonok, köztük az adipokinek és a citokinek forrásaként szolgál [11,12,36]. A zsírszövet elengedhetetlen a zsírban oldódó vitaminok felszívódásához [35] és a sejtmembrán összetételéhez [30]. Azonban a magas zsírtartalmú étrend bevitele elhízást okoz azáltal, hogy túlzottan növeli a szervezetben az adipogenezist. A fokozott zsírfelhalmozódás olyan súlyos negatív szövődményeket okoz, mint a megnövekedett inzulinrezisztencia, az arteriosclerosis, a szív- és érrendszeri betegségek, a hiperlipidémia és a diabetes mellitus [18,34,41].

A nyugati országokban sokan fogyasztanak magas zsírtartalmú vagy magas kalóriatartalmú étrendet rendszeres testmozgás nélkül. Következésképpen számos gyógyszergyár megkezdte az elhízást célzó gyógyszerek kivizsgálását. Számos ígéretes elhízás elleni gyógyszert azonban elutasítottak, mert váratlan mellékhatásokat mutattak ki az embereknél [4,31].

Az Artemisia annua (AA), egy jól ismert maláriaellenes szer [23,29], nemrégiben kimutatták, hogy számos in vitro vizsgálatban csökkenti az adipocita differenciálódást, csökkentve a peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor (PPAR) -γ, C/EBP-α, C/EBP-γ [22]. Az adipogenezisre gyakorolt hatását azonban még nem vizsgálták állatmodellekben.

Jelen vizsgálatunkban napi AA-kivonat szájon át történő beadását végeztük diéta indukált elhízás (DIO) állatmodellben. AA-kivonatot alkalmaztunk a 3T3-L1 sejtekre, majd ezt követően összehasonlítottuk a relatív fehérje-expressziókat az alkalmazás különböző koncentrációi és időtartama között. Ezenkívül olajvörös O festést és Western blotot végeztek in vitro, majd ezt követően számos rokon gén szövettana és mRNS expressziója alapján megfigyelték az élettani adatokat és az adipogenezisre gyakorolt hatásokat, hogy értékeljék az AA gyógynövény elhízás elleni hatásait egy in vivo rendszer.

Anyagok és metódusok

AA kivonás

Összesen 40 g AA-t főztek 1,8 liter desztillált vízzel (DW) 1,5 bar nyomás alatt, 80 ° C-on. 30 percig tartó forralás után az extraktumot teljesen lehűtjük. Az extraktumot először papírral (185 mm; Advantec, Japán), majd egy Nalgene Rapid-Flow Battle Top Filter (0,2 um pórusú membrán; Thermo Scientific, USA) segítségével szűrjük. A végső AA kivonatot 4 ° C-on tároltuk.

Állatok

Huszonnégy felnőtt C57BL/6J egeret (átlag = 23 g, 21 és 25 g közötti, 7 hetesek) szobahőmérsékleten (22 ℃) és 60% -os páratartalom mellett 12 órás fény: sötét ciklus (világos ciklus: sötét ciklus 07: 00-19: 00 között). Az egereket négy csoportra osztották, kettőre normál chow étrendet biztosítottak (2018S; Harlan, USA), kettőre pedig magas zsírtartalmú étrendet (TD.06414; Harlan). A vízhez szabad hozzáférést biztosítottak. Minden nap 10 ml/1 kg/nap AA-kivonatot adtunk óvatosan szájon át szondával (0,9 × 50 mm) az egyes táplálékcsoportok felének, míg a másik felének ugyanannyi mennyiségű vizet adtunk. A testsúlyt, az étel- és a vízfogyasztást naponta regisztrálták, és a vércukorszintet hetente egyszer tesztelték éhomi körülmények között. A perifériás vért az egér farokvénájának hegyének levágásával gyűjtöttük össze. A perifériás vér glükózszintjét One Touch Ultra (LifeScan, USA) vércukormérővel, One Touch Ultra tesztcsíkokkal (LifeScan) mértük. A kísérleteket 4 héten keresztül hajtották végre, és azokat a Soonchunhyang Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága jóváhagyta (IACUC jóváhagyási szám: SCH15-0001).

Szövetfeldolgozás

Az epididymális zsírszöveteket perfúzió előtt eltávolítottuk, és 4% paraformaldehidbe (PFA) merítettük. Az állatokat 0,1 M foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS; pH 7,35) perfundáltuk, majd 4% PFA-t 0,1 M foszfát-pufferben (PB; pH 7,35).

Sejtkultúra

A 3T3-L1 sejteket magas glükózszintű (25 mM) Dulbecco Modified Eagle táptalajban (DMEM; Gibco, USA) tartottuk fenn, 10% szarvasmarha borjúszérummal (BCS; Hyclone, USA) és antibiotikumokkal (penicillin 100 U/ml és streptomycin 100) kiegészítve. mg/ml) 37 ° C-on 5% -os CO2 inkubátorban. Az adipocita differenciálódás érdekében a sejteket differenciálódást indukáló közeggel (DIM) kezeltük, amely 1 µM dexametazont (Sigma, USA), 5 mM 3-izobutil-1-metilxantint (Sigma) és 4 mg/ml inzulint (Sigma) tartalmazott DMEM-ben 10 % magzati szarvasmarha-szérum (FBS) a konfluencia után 2 nappal. 2 nap múlva a sejteket 10% FBS-t és inzulint tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük. Ezt követően a táptalajt minden második napon cseréltük.

Olajvörös O festés

Olajvörös O-festést végeztek az adipogén indukciós 8. napon. Röviden: a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, majd 4% paraformaldehiddel rögzítettük 1 órán át szobahőmérsékleten. A sejteket ezt követően 60% izopropanollal mostuk és teljesen megszárítottuk. Végül a sejteket olajvörös O-val (6 rész 0,5% izopropanolos olajvörös por és 4 rész víz) 10 percig festettük, majd PBS-sel mostuk.

Kvantitatív valós idejű PCR elemzés

Az epididimális zsírszövetből a teljes RNS-t izoláltuk egy Ambion PureLink RNA Mini Kit segítségével a gyártó utasításai szerint (Ambion, USA). Kvantitatív valós idejű PCR-t SYBR Green festékkel végeztünk egy ABI Step One Real Time PCR műszerrel (Applied Biosystems, UK). A génexpresszió relatív kvantitatív meghatározásához összehasonlító Ct módszert (2 -ΔΔCt) használtunk. Az eredményeket a kontroll génre (36B4, háztartási gén, savas riboszomális fehérje) normalizáltuk. Az alkalmazott primerek és próbák szekvenciáját az 1. táblázat sorolja fel [13,17].

Asztal 1

Western blot elemzés

A sejtkivonatokat lízispufferben (iNtRon Biotechnology, Korea) homogenizáltuk, és a fehérjekoncentrációkat BCA kit (iNtRon Biotechnology) segítségével határoztuk meg. A lizátumokat 10% SDS-PAGE-val elválasztottuk és PVDF membránokra vittük át (Bio-Rad Laboratories, USA). A membránokat primer antitestekkel vizsgáltuk PPAR-y, zsírsavkötő 4-es fehérje (FabP4), glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (Cell Signaling Technologies, USA) és C/EBPβ (Abcam, Egyesült Királyság) ellen, majd egy éjszakán át inkubáltuk. További mosás után a membránokat HRP-konjugált szekunder antitesttel (Vector, USA) inkubáltuk. Az immunreaktív jeleket fokozott kemilumineszcenciájuk alapján detektáltuk és a MicroChemi 4.2 rendszerben rögzítettük.

Adatelemzés

Valamennyi mérést elvégeztük és elemeztük az objektivitás biztosítása érdekében. A Western blot során keletkező sávok intenzitását az átlagos szürke szint transzformálásával mért optikai sűrűség alapján értékeltük a következő képlettel: optikai sűrűség = log (256/átlagos szürke szint) ImageJ 1.59 szoftverrel (National Institutes of Health, USA). A mikroszkópban a lipidcseppek méretét kísérleti területenként kalibráltuk. A Dataf az átlag ± standard hiba (SE) átlagként jelenik meg. A relatív mRNS expressziós szinteket automatikusan mértük valós idejű qPCR-rel. Az átlagok közötti különbségeket ismételt kétirányú varianciaanalízissel és egyirányú varianciaanalízissel elemeztük, amelyet Bonferroni utópróba és Duncan új többszörös módszere követett a kísérleti csoportok közötti különbségek meghatározására.

Eredmények

Élettani adatok

Az eredmények azt mutatták, hogy mind a négy egércsoport súlya hasonló volt a kísérlet kezdetén. A napi súlymérések azt mutatták, hogy a magas zsírtartalmú étrend (HF)/AA csoport súlya kevesebb, mint a HF/hordozó (Veh) csoporté. Ez a különbség a 14. naptól kezdve statisztikailag szignifikáns volt, és a kísérlet előrehaladtával nyilvánvalóbbá vált. Mindkét normál chow dieta (ND) táplált csoportban az ND/AA csoport súlya valamivel kisebb volt, mint az ND/Veh, de ez a különbség nem volt szignifikáns (A és B panel az 1. ábrán). A táplálékfelvétel mindkét ND táplált csoportban (ND/Veh és ND/AA) nem különbözött szignifikánsan a kísérlet során. Az első két hétben nem volt figyelemre méltó különbség a táplálékfelvétel terén a HF táplált csoportok (HF/Veh és HF/AA) között, de a HF/AA csoportban az élelmiszer-bevitel viszonylag alacsonyabb lett, mint ezt követően a HF/Veh csoportban (C és D panel az 1. ábrán). A vércukorszintben nem volt különbség a csoportok között. Az AA (ND és HF) egerek epididimális zsírszövetei alacsonyabbak voltak, mint a Veh (ND és HF) egerek.