A DNS-vakcina megindítja az élő attenuált chikungunya vírus replikációját in vitro és protektív immunreakciót vált ki egerekben

Irina Tretjakova

1 Medigen, Frederick, Maryland

Jason Hearn

1 Medigen, Frederick, Maryland

Eryu Wang

2 Sealy Vakcinák Fejlesztési Központja és Patológiai Osztály, Emberi Fertőzések és Immunitás Intézete, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, Galveston, Texas

Scott Weaver

2 Sealy Vakcinák Fejlesztési Központja és Patológiai Osztály, Emberi Fertőzések és Immunitás Intézete, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, Galveston, Texas

Pushko Péter

1 Medigen, Frederick, Maryland

Absztrakt

Háttér. A chikungunya vírus (CHIKV) világszerte a chikungunya láz kitöréseit okozza, és kialakulóban lévő járványveszélyt jelent. A CHIKV elleni vakcinák fejlesztése kihívást jelentett. Jelenleg nincs jóváhagyott vakcina vagy specifikus terápia a betegségre.

Mód. Új kísérleti CHIKV vakcina kifejlesztéséhez új immunizációs DNS (iDNS) fertőző klón technológiát használtunk, amely egyesíti a DNS és az élő attenuált vakcinák előnyeit. Itt leírunk egy plazmid DNS-ből álló iDNS-vakcinát, amely az eukarióta promótertől lefelé haladó 181/25 élő, attenuált CHIKV klón teljes hosszúságú fertőző genomját kódolja. Az iDNS megközelítést úgy tervezték, hogy in vitro és in vivo megindítsa az élő vakcinavírus replikációját a plazmidból.

Eredmények. Kísérleti CHIKV iDNS vakcinákat készítettünk és értékeltünk tenyésztett sejtekben és egerekben. 10 ng iDNS-sel történő transzfekció elegendő volt a vakcinavírus in vitro replikációjának megkezdéséhez. A BALB/c egerek egyetlen 10 μg CHIKV iDNS plazmiddal történő oltása szerokonverziót, semlegesítő antitestek kiváltását és védelmet nyújtott a neurovirulens CHIKV kísérleteivel szemben.

Következtetések. Élő attenuált CHIKV 181/25 vakcina in vitro és in vivo adható be DNS oltással. Úgy tűnik, hogy az iDNS megközelítés ígéretes vakcinázási stratégiát jelent a CHIK és más alfavírusos betegségek ellen.

MÓD

Sejtvonalak és vírusok

Kínai hörcsög petefészket (CHO) és afrikai zöldmajom Vero sejtvonalakat az American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) sejtekből nyertünk, és párásított inkubátorban 37 ° C-on és 5% CO2-ot tartottunk a minimális esszenciális táptalajban (αMEM). 10% szarvasmarha-magzati szérummal (FBS) és gentamicin-szulfáttal (10 μg/ml) kiegészítve (Life Technologies, Carlsbad, CA). A CHIKV 181/25 törzs élő, attenuált TSI-GSD-218 vakcinát az Új Vírusok és Arbovírusok Világközpontjától (WRCEVA) szereztük be. A CHIKV neurovirulens Ross törzse standard egér kiváltására használt állomány volt, amelyet egerek provokálására alkalmaztak a texasi egyetem orvosi osztályának Galvestonban, a 3+ biológiai biztonságosság (BSL3 +) laboratóriumában [22].

Plazmidok és az iDNS előállítása

A teljes hosszúságú cDNS klónok és immunizáló DNS (iDNS) plazmidok szekvenálása és előállítása. A, szekvencia polimorfizmus a 301 és 304 csoportokban a nem strukturális poliproteinben (nsP). Csak a 3,5–40-es klón szekvenciája azonos a TSI-GSD-218 181/15 vakcina szekvenciájával (GenBank> L37661), míg más klónok és GenBank-szekvenciák variációkat tartalmaznak ezeknél a maradékoknál. A GenBank csatlakozási száma a jobb oldalon látható. B, A teljes hosszúságú funkcionális chikungunya vírus komplementer DNS-t (cDNS) kódoló plazmidokat mutatjuk be. Jelzik a citomegalovírus (CMV) promotert (nyílt nyíl), a 26S promotert (folytonos nyíl), a teljes hosszúságú cDNS klónok összeállításához használt restrikciós helyeket és antibiotikum-rezisztencia géneket, valamint az iDNS plazmidok jelölését. Amp, ampicillin; Kan, kanamicin.

Transzfekciók és vizsgálatok in vitro

CHO vagy Vero sejteket transzfektáltunk az iDNS plazmid elektroporációjával 1 ng és 5 μg közötti koncentrációban. Mind a CHO, mind a Vero sejtek transzfekcióját lényegében a korábban leírt módon hajtottuk végre [21, 23]. Kontrollként a sejteket 10 2–105 plakkképző egységgel (PFU) inkubáltuk a CHIKV 181/25 vakcinavírussal. A CHIKV antigének expresszióját iDNS-sel transzfektált és vírussal fertőzött sejtekben immunfluoreszcencia vizsgálattal (IFA) és Western blot alkalmazásával detektáltuk, CHIKV hiperimmun egér aszcitikus folyadék (HMAF) VR-1241AF (ATCC) alkalmazásával. A CHIKV antigéneket Western-blot segítségével is megerősítettük, lábadozó humán antiszérummal (UTMB; Dr. Robert Tesh jóvoltából). Végül a vírus jelenlétét a tenyészközegben plakkvizsgálattal igazoltuk duplikátumokban. Meghatároztuk az átlagokat és az SD-ket. Mindegyik kísérletet legalább kétszer elvégeztük az eredmények megismételhetőségének biztosítása érdekében. A vírusnövekedési görbékhez a mintákat meghatározott időközönként gyűjtöttük be, és duplikálva számoltuk el plakkvizsgálattal Vero-sejt monorétegekben 6-lyukú lemezeken.

Védőoltások és szerológiai elemzés

Kihívás

A kísérleti kihíváshoz az egereket a fent leírt BSL3 + létesítménybe vittük, és virulens CHIKV Ross törzzsel fertőztük 6x106 PFU dózisban 20 μl-ben intranazális úton [22]. A vérmintákat a fertőzés után 3 napig gyűjtöttük a virémia kimutatása céljából. Az oltott és a kontroll állatok közötti vírustiter-különbségek statisztikai szignifikanciáját a Student t teszttel határoztuk meg.

EREDMÉNYEK

CHIKV p181/25 iDNS előállítása

A CHIKV élő, attenuált TSI-GSD-218 vakcinát, a 181/25 klónt, egyszer átadtuk a CHO sejtekben. Az 1. passzusvírusból vírusos RNS-t izoláltunk, és a CHIKV cDNS előállításához használtuk fel. A CHIKV 181/25 vírus teljes genomját átfogó négy cDNS-fragmenst fordított transzkripcióval és nagy pontosságú PCR-rel állítottunk elő. A cDNS-klónok szekvenciáit CHIKV-szekvencia-specifikus oligonukleotid-primerek alkalmazásával határoztuk meg a cDNS-szekvenciák megerősítésére a publikált CHIKV 181/25 szekvenciához (TSI-GSD-218; GenBank-csatlakozás> L37661). A szekvenálás feltárta a genetikai variánsok jelenlétét a nem strukturális poliprotein (nsP) aminoterminális régiójában. Például csak a 7 szekvenált cDNS-klónból, a 3,5–40-ből, csak egy tartalmazott Ile301 maradékot az nsP1-ben, amely megegyezett a 181/25 közzétett szekvenciájával (ábra (1 A ábra). A fennmaradó 6 klón Thr301-et tartalmazott a vad típusú CHIKV, valamint a 181/25-vel oltott virémiás páciens VR1-izolátuma, akinél enyhe arthralgia alakult ki [18, 19]. Heterogenitást is kimutattunk a 314-es maradéknál (ábra (1 A ábra). Bár egyik sem a 301-es és 314-es aminosavmaradékok felelősek a gyengülésért [18], a genetikai variánsok jelenléte a víruspopulációban hozzájárulhat a 181/25 vakcina fenotípusos heterogenitásához.

A szekvenciával igazolt cDNS-fragmenseket a pcDNA3.1-ből származó plazmidon belül egyesítettük, és így előállítottuk a p181/25-7 iDNS-plazmidot, amely a CMV fő, azonnali-korai promóterétől lefelé irányuló 181/25 klón genomikus RNS teljes hosszúságú cDNS-jét tartalmazza (1. ábra). 1). Mivel az RNS hiteles 5'- és 3'-vége kritikus fontosságú az alphavirus replikációja szempontjából [2], a CMV promotert és a HDV ribozim régiókat optimalizálták a funkcionális 181/25 genomi RNS transzkripciójának biztosítása érdekében. Két további CHIKV iDNS variánst is készítettünk (ábra (1. ábra) .1). Az iDNS megközelítés alkalmazhatóságának bemutatására az új CHIKV vakcinák gyártása során a p181/25-39 iDNS-t úgy készítettük el, hogy a 181/25 kapszid és a glikoprotein gének közé egy duplikátum 26S szubgenom promotert illesztettünk (ábra (1 B ábra). tanulmányok kimutatták, hogy egy alfavírusból 2 gén expresszálható tandem módon [24]. Végül a p181/25-1 iDNS-variánst úgy állítottuk elő, hogy a p181/25-7-ben lévő pcDNA3.1 vektor gerincét a pCRII-vel helyettesítettük. gerinc, hogy a kanamicin rezisztenciát biztosítson az iDNS plazmiddal szemben, így a p181/25-7 és a p181/25-1 egyaránt a CHIKV 181/25 szekvenciákat kódolták, és csak a vektor gerincében és az antibiotikum rezisztencia génjeiben különböztek.

Élő attenuált vakcinavírus-replikáció elindítása az iDNA In Vitro-ból

Az immunizációs DNS (iDNS) p181/25-7 plazmid transzfektálása CHO sejtekbe. A, A bal oldalon látható az immunizációs DNS (iDNS) megközelítés a chikungunya vírus (CHIKV) élő attenuált vírus elindításához eukarióta sejtekben. Jelzik a citomegalovírus (CMV) promotert (nyílt nyíl), a sejtmagot és az utód vírust. A CHIKV antigének expressziója az iDNS-plazmid transzfektálása után a jobb oldalon látható, immunfluoreszcencia vizsgálattal (IFA) detektálva 48 és 96 órával a transzfekció után. A transzfektált sejtek alikvotjait 8-lyukú kamrákba helyeztük, a megadott idõpontokban hideg acetonban rögzítettük és IFA-val dolgoztuk fel, egér CHIKV-specifikus antitest, majd fluoreszcein-izotiocianát-konjugált szekunder antitest alkalmazásával. B, CHIKV antigének kimutatása transzfektált CHO sejtekben Western-blot (bal oldali) és a tenyészközegben plakettvizsgálattal 48 órával a transzfekció után (középen). Összehasonlításképpen, a 181/25 vírus vakcina (1. átmenet a CHO sejtekben) plakkvizsgálata látható. A jobb oldali panel a p181/25-7 iDNS-eredetű vírus növekedési görbéjét mutatja (3 kísérlet átlaga). A Western blotot humán lábadozó fázisú CHIKV-specifikus szérum (1. sáv) és CHIKV HMAF (2. sáv) alkalmazásával végeztük. A PE2, E2, E1 és C antigének vannak feltüntetve.

A chikungunya vírusok (CHIKV) növekedési görbéi vírusfertőzött (szaggatott vonalak) és immunizációs DNS (iDNS) transzfektált (folytonos vonalak) Vero sejtekben. A sejteket jelzett vírusokkal fertőztük, vagy elektroporációval transzfektáltuk a jelzett iDNS-plazmidokkal (1. ábra: 1. ábra). A vírusok megnevezése és az iDNS-plazmidok mennyisége a jobb oldalon látható. A vírus jelenlétét a tenyészközegben plakkvizsgálattal határoztuk meg duplikátumokban. Minden adatpont 2 mérés átlagát jelenti. A szórásokat kiszámoltuk, de nem mutattuk be, hogy javítsuk a grafikon tisztaságát. PFU, plakettképző egység.

A CHIKV iDNS vakcina immunogenitása és hatékonysága egerekben

Asztal 1.

P181/25-7 immunizációs DNS (iDNS) és szülői 181/25 vakcinák BALB/c egerekben

CHIKV vakcina
Állatok útvonala, szérumkonvertált/összes (%) b vírusneutralizációs titer, c PRNT80, tartomány (átlag) PRNT80 (egerek száma) PRNT50,
Tartomány (átlag) PRNT50 (egerek száma)

p181/25-7 iDNS, intramuszkuláris

8/8 (100)

320–1280 (640,00)

b Immunfluoreszcencia vizsgálattal és Western blot-tal kimutatták.

c Plakk-redukciós semlegesítési tesztek, amelyek 80% (PRNT80) és 50% (PRNT50) csökkenést mutatnak a plakkok számában, oltott BALB/c egerek szérum antitesttel történő inkubálása után.

A szérum antitest kimutatása oltott BALB/c egerek szérumában immunfluoreszcencia vizsgálattal. A, az 1–8 egereket intramuszkulárisan oltottuk be in vivo elektroporációval 10 μg p181/25-7 immunizációs DNS-sel (iDNS). B, 9–16 egerekbe szubkután 10 5 plakkképző egységet injektáltunk élő 181/25 vírussal. A vakcinázást követő 21. napon szérumokat kaptunk, és 1:10 arányú hígítással próbáltuk, majd fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált antimouse antitest következett. A Chikungunya vírus (CHIKV) pozitív reakcióját zöld fluoreszcens gócok jelzik. Ebben a kísérletben a sejtmagok vizualizálásához a propidium-jodid mag ellenfestést használtuk [28]. A vörös fluoreszcencia magfestést jelez.

Rövidítések: PBS, foszfáttal pufferolt sóoldat; PFU, plakkképző egységek.

a BALB/c egereket 10 μg p181/25-7 iDNS intramuszkuláris injekcióval-elektroporációval oltottuk be (ábra (1. ábra).

b Immunfluoreszcencia vizsgálattal detektálva.

c A kihívást intranazálisan, 6 × 106 PFU CHIKV-Ross vírussal végeztük 20 μl térfogatban, ahogy másutt leírták [22].

A szérum antitest kimutatása a beoltott BALB/c egerek szérumában immunfluoreszcencia vizsgálattal (IFA). Az 1–10-es egereket intramuszkulárisan oltottuk be in vivo elektroporációval 10 μg p181/25-7 immunizációs DNS-sel. A szérumokat az oltás után a 21. napon vettük, és 1:10 arányú hígítással vizsgáltuk, majd fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált antimouse antitest következett. A Chikungunya vírus (CHIKV) pozitív reakcióját zöld fluoreszcencia jelzi. Ebben az IFA kísérletben a propidium-jodid mag ellenfestést nem használtuk. Ezért a zöld fluoreszcens CHIKV-specifikus gócok sötét háttéren vannak feltüntetve. Ugyancsak jelzik a nem vakcinázatlan kontroll egerek szérumával végzett CHIKV antigén detektálását (foszfátpufferolt sóoldat [PBS]) és az antigén detektálását kontroll vírusspecifikus antiszérummal (α-CHIKV).

VITA

Megjegyzések

Köszönetnyilvánítás. Köszönjük Brian Nickolsnak, Ruth Florese-nak, Elena Klyushnenkovának és Igor Lukashevichnek a szakértői segítséget és a megbeszéléseket; Robert Tesh és Patricia Repik, a 181/25 oltóanyagok és reagensek beszerzésében nyújtott segítségért az Új Vírusok és Arbovírusok Világközpontjától; valamint ATCC és BEI erőforrások az egér HMAF biztosításához.

Jogi nyilatkozat. A cikk tartalma kizárólag a szerzők felelőssége, és nem feltétlenül képviseli a finanszírozó ügynökségek hivatalos nézeteit.

Pénzügyi támogatás. Ezt a munkát az Országos Allergiai és Fertőző Betegségek Intézete, az Országos Egészségügyi Intézetek támogatták (1R03AI094159 és 1R01AI093491 díjak).

Potenciális összeférhetetlenség. Minden szerző: Nincsenek jelentett konfliktusok.

Minden szerző benyújtotta az esetleges összeférhetetlenségről szóló ICMJE űrlapot. Tárultak azok a konfliktusok, amelyeket a szerkesztők relevánsnak tartanak a kézirat tartalma szempontjából.